脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞治療免疫性皮膚病研究進(jìn)展

何玉倉(cāng) 吳含文 楊芳芳 丁思琦 李力群

免疫性皮膚疾病大部分發(fā)病原因不詳，治療困難，長(zhǎng)年的疾病進(jìn)程常會(huì)給患者生活、心理上造成巨大負(fù)面影響。近年來間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stromal cells,MSCs）移植在免疫性皮膚病治療中的應(yīng)用備受關(guān)注。MSCs是一類可以從人體多個(gè)部位獲得的多向分化潛能的干細(xì)胞，其具有強(qiáng)大的自我更新能力，可以分化為不同組織類型[1]，現(xiàn)今被廣泛研究而應(yīng)用于組織工程。其中的脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stromal cells,ADSCs）相比較于其他干細(xì)胞而言，具有來源豐富、取材簡(jiǎn)單、便于培養(yǎng)、增殖速度快、免疫原性較低等顯著的優(yōu)越性，越來越受到人們的關(guān)注[2]。大量的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都證實(shí)它們具有強(qiáng)大的抗炎、抗纖維化、抗凋亡和促血管生成作用。ADSCs通過分泌抗炎細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，發(fā)揮協(xié)同作用，使ADSCs移植后的組織修復(fù)能力增強(qiáng)，細(xì)胞損傷減少[3]。它們所表達(dá)的Ⅰ類主要組織相容性復(fù)合體，在炎癥等情況下可以被誘發(fā)表達(dá)Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合體[4]。并且由于人類白細(xì)胞抗原（HLA）-DR和共刺激分子如CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD40及其配體CD40L在其表面的表達(dá)缺失，使其具有免疫逃避機(jī)制[5-6]。各種免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制使ADSCs在再生醫(yī)學(xué)方面之外，有了更廣闊的用途——免疫性皮膚疾病的治療。

1 ADSCs的免疫調(diào)節(jié)功能

ADSCs主要通過兩種途徑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。一種是直接的，通過MSCs與包括免疫細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞間的相互作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用。ADSCs可以作用于包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、造血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、周細(xì)胞和血管周圍的內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[7]。不僅是有生物活力的MSCs、凋亡的MSCs，甚至MSCs碎片也可以發(fā)揮部分的抗炎效應(yīng)[8]。另一種是間接的，ADSCs分泌多種可溶性介質(zhì)以及細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs），作用于靶點(diǎn)來達(dá)到減輕炎癥反應(yīng)的目的[9]。這些EVs是由營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和前炎癥因子組成的，包括了細(xì)胞因子、趨化因子、甚至由EVs運(yùn)載的蛋白質(zhì)以及miRNAs，EV包括外泌體和微囊泡，可以作為膜與胞漿蛋白、脂質(zhì)和遺傳信息之間轉(zhuǎn)移的載體在細(xì)胞之間的通信中發(fā)揮作用[10-12]。目前認(rèn)為，非直接細(xì)胞接觸是ADSCs發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)、促進(jìn)組織修復(fù)再生的主要途徑[13]，利用MSCs分泌效應(yīng)的治療方法最近也受到越來越多的關(guān)注。

2 ADSCs在自身免疫性皮膚病的應(yīng)用

目前應(yīng)用ADSCs治療自身免疫性皮膚疾病的方法有局部給藥和全身給藥。全身給藥的操作簡(jiǎn)單，常常通過ADSCs靜脈注射來實(shí)現(xiàn)。ADSCs進(jìn)入體內(nèi)后根據(jù)局部促炎細(xì)胞因子表現(xiàn)出高度的趨化性，定位于炎癥組織，可能和ADSCs表達(dá)的趨化因子受體4（CXCR4）有關(guān)[14]。雖然ADSCs靜脈注射的安全性在一期人類臨床試驗(yàn)中已經(jīng)得到肯定[15]，但其存在的其他風(fēng)險(xiǎn)仍未完全明確。局部給藥包括皮內(nèi)注射、混合移植等[16]，具有高效、精準(zhǔn)，直擊靶點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中更具優(yōu)勢(shì)。但針對(duì)很多全身散在病灶的皮膚病患者而言，局部給藥會(huì)增加更多痛苦，無法達(dá)到根治效果。因此如何選擇用藥要視患者和疾病本身特點(diǎn)來選擇。

2.1 ADSCs用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus,SLE） SLE是由于免疫復(fù)合物沉積造成全身多器官受損的自身免疫性疾病，抗核抗體(ANA)和抗雙鏈DNA常作為懷疑SLE或結(jié)締組織疾病患者的篩選工具[16]。產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞在小鼠模型中被證實(shí)是SLE等多種自身免疫性疾病的促進(jìn)因素[17]。研究者發(fā)現(xiàn)通過ADSCs靜脈注射后可以控制Th17淋巴細(xì)胞數(shù)量和產(chǎn)生IL-17的能力來實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)，還可以減少Th1、增加Breg細(xì)胞、Treg細(xì)胞的數(shù)量，減輕SLE小鼠蛋白尿和血清的抗ds-DNA抗體、肌酐，減輕腎臟損害以及腎間質(zhì)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫，改善SLE的炎癥指標(biāo)和臨床癥狀[19-21]。ADSCs的應(yīng)用就調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡比例上來看，和SLE傳統(tǒng)治療用藥環(huán)磷酰胺作用效果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[22]，這有可能為SLE的治療提供新方向。

2.2 ADSCs用于治療特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis,AD） AD是一種和遺傳因素、環(huán)境過敏原有關(guān)，伴有表皮屏障破壞的多因素、異質(zhì)性疾病，可伴有炎癥反應(yīng)，以皮膚瘙癢為主要臨床表現(xiàn)。AD患者血清IgE水平增高，急性期皮損處Th2細(xì)胞顯著增高，產(chǎn)生細(xì)胞因子如IL-4、IL-13、IL-31等，慢性期可發(fā)現(xiàn)Th1型細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ升高[23-24]。有學(xué)者在犬AD模型中通過系統(tǒng)性注射ADSCs治療6個(gè)月后，原先經(jīng)過傳統(tǒng)治療（如食譜營(yíng)養(yǎng)支持、局部治療、抗菌藥物治療、過敏原特異性免疫治療、免疫調(diào)節(jié)藥物等）12個(gè)月以上無效的病犬的瘙癢程度（1周改善）和犬類AD評(píng)分（1月改善）都有顯著改善[25]。在NC/Nga小鼠AD模型病變區(qū)域內(nèi)注射自體ADSCs或者自體ADSCs培養(yǎng)基，也能顯著減輕小鼠體內(nèi)炎癥因子表達(dá)水平和皮損表現(xiàn)[26]。研究表明，局部注射可以誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺和二氫神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生，同樣可以減少經(jīng)表皮水分流失，同時(shí)增強(qiáng)角質(zhì)層水化，顯著降低炎性細(xì)胞因子水平，并且呈劑量依賴性，進(jìn)而修復(fù)破損的皮膚屏障和抑制皮膚炎癥。

2.3 ADSCs用于治療銀屑病 銀屑病是一種全身性的、免疫介導(dǎo)的疾病，以皮膚和關(guān)節(jié)炎癥為特征的疾病[27]。銀屑病的發(fā)病可能和T淋巴細(xì)胞在表皮浸潤(rùn)有關(guān)，包括Th1和目前認(rèn)為起關(guān)鍵作用的Th17[28]。T淋巴細(xì)胞可以釋放刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增生的細(xì)胞生長(zhǎng)因子IL-17 、IL-22、IFN-γ、TNF-α等[29]，使得銀屑病患者皮膚MSCs對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制能力減弱。而在編碼Th1和Th17細(xì)胞因子的大部分基因中有相對(duì)更高的表達(dá)，所以有觀點(diǎn)認(rèn)為MSCs異?？赡苁倾y屑病的發(fā)病因素之一[30]。2016年，有研究者嘗試在1例尋常型銀屑病患者和另1例銀屑病關(guān)節(jié)炎患者靜脈注射自體ADSCs，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)2例患者的銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）分別都得到了改善。尋常型銀屑病患者TNF-α略有降低，并且與銀屑病臨床癥狀有關(guān)的活性氧濃度也顯著降低[31]。無獨(dú)有偶，另一研究使用富含ADSCs的基質(zhì)血管碎片單獨(dú)治療難治性銀屑病患者，經(jīng)過單次靜脈注射后，患者在1個(gè)月后銀屑病斑塊便得到了極大的改善，銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)評(píng)分由基線時(shí)的50.4分，在1個(gè)月后降至0.3分。12個(gè)月內(nèi)無嚴(yán)重不良事件發(fā)生[32]。

2.4 ADSCs用于治療系統(tǒng)性硬化癥系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis,SSC） SSC也叫硬皮病，是一種免疫介導(dǎo)的風(fēng)濕性疾病，其特征是膠原和其他基質(zhì)成分在皮膚和靶器官中的積累導(dǎo)致的皮膚和臟器的纖維化以及血管病變。SSC的早期階段，細(xì)胞浸潤(rùn)主要由Th2型細(xì)胞組成，同時(shí)伴隨血清中TGF-β、血小板源性生長(zhǎng)因子和IL-1水平的顯著增加，增強(qiáng)炎性反應(yīng)[33]。研究者在次氯酸誘導(dǎo)的SSC小鼠模型中靜脈注射自體ADSCs或人ADSCs后均可看到皮膚厚度減少，Ⅰ型膠原（Col1）、α-SMA轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及皮膚和肺部膠原含量減少。值得注意的是，在減少皮膚纖維化方面，ADSCs注射比骨髓來源的MSCs注射效果更為顯著[34]。同時(shí)在博來霉素誘導(dǎo)的SSC小鼠模型中，靜脈注射ADSCs也可以使皮膚和肺的纖維化減輕；CD4+、CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向真皮的浸潤(rùn)減少；皮膚中膠原蛋白和成纖維細(xì)胞因子IL-6、IL-13等的mRNA表達(dá)減少[35]。另外，通過離心提取富含ADSCs的SVF局部注射治療SSC手部病變患者時(shí)，患者皮膚纖維化，手部水腫，生活質(zhì)量明顯改善，31.6%的活動(dòng)性手部潰瘍?cè)谧⑸浜?4周愈合，甲襞毛細(xì)管顯微鏡半定量結(jié)果得到改善[36]?？偟膩碚f，ADSCs在SSC的治療中，可能通過限制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和增加膠原酶活性來減少纖維化；通過調(diào)節(jié)基礎(chǔ)的肥厚性瘢痕成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外間質(zhì)重塑；并通過干細(xì)胞增殖和分化提供結(jié)構(gòu)支持[37]。

2.5 ADSCs用于治療天皰瘡 天皰瘡的發(fā)病與針對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞黏附分子的自身抗體IgG的產(chǎn)生相關(guān)。自身抗體與黏附分子橋粒芯蛋白Ⅰ、橋粒芯蛋白Ⅲ的結(jié)合會(huì)破壞角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)黏附力，導(dǎo)致棘皮松解和天皰瘡中常見的病灶，包括水皰和表皮內(nèi)膿皰的形成[38]。常見的治療天皰瘡的方法存在較多不良反應(yīng)，尤其是治療后的低存活率[39]。2015年有學(xué)者報(bào)道了1例在使用激素或免疫抑制劑無效的落葉型天皰瘡病犬模型中，經(jīng)過20個(gè)月共21次的ADSCs靜脈注射治療，病犬的激素使用量逐漸下降，皮損改善，并且在ADSCs治療結(jié)束后12個(gè)月的低劑量潑尼松龍維持治療中基本無新發(fā)皮損[40]。由此提示ADSCs應(yīng)用可作為輔助治療天皰瘡的新思路，在緩解天皰瘡引起的皮膚損傷中具有重要意義。

2.6 ADSCs用于治療白癜風(fēng) 白癜風(fēng)是一種臨床上常見的后天性局限性或泛發(fā)性皮膚色素脫失性疾病，任何部位皮膚均可發(fā)生，但好發(fā)于受光照和摩擦損傷部位，如面頸部、軀干部和四肢等部位。其始發(fā)因素是各種原因造成的黑素細(xì)胞破壞[41]。經(jīng)過長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，大量的CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)在白癜風(fēng)皮損真皮淺層內(nèi)[42]，并具有黑色素細(xì)胞抗原特異性，可以針對(duì)性地殺傷黑色素細(xì)胞，從而指導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞不可逆的凋亡，造成正常皮膚色素減退。這也是導(dǎo)致白癜風(fēng)發(fā)病的可能機(jī)制之一。因此如何抑制白癜風(fēng)皮損周圍浸潤(rùn)的CD8+T淋巴細(xì)胞，有效調(diào)節(jié)皮損周圍的免疫環(huán)境，將成為治療白癜風(fēng)的有效手段。Kim等[43]發(fā)現(xiàn)與ADSCs共同培養(yǎng)的黑素細(xì)胞相比較而言，其向表皮遷移的數(shù)量明顯增加。這可能與ADSCs可以促進(jìn)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子分泌等有關(guān)[44]。Lim等[45]將不同比例的原代培養(yǎng)的人ADSCs和原代培養(yǎng)的人黑色素細(xì)胞移植到SD大鼠和裸鼠中取得良好效果，進(jìn)一步證實(shí)了ADSCs聯(lián)合治療膚色恢復(fù)的安全性及持久性。這為白癜風(fēng)治療提供了一種更有效的新療法。

2.7 ADSCs用于治療免疫性脫發(fā) 免疫性脫發(fā)是由于反應(yīng)性T細(xì)胞的過度活化,毛囊自身免疫赦免的破壞[46-47]引起自身免疫系統(tǒng)攻擊毛囊組織，發(fā)生脫發(fā)。治療免疫性脫發(fā)的傳統(tǒng)藥物主要為米諾地爾和糖皮質(zhì)激素類。米諾地爾通過擴(kuò)張血管、刺激毛囊真皮乳頭細(xì)胞,促使毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期。糖皮質(zhì)激素具有免疫抑制的作用,減少免疫細(xì)胞對(duì)毛囊的攻擊，促進(jìn)毛囊的正常生長(zhǎng)。但這兩種藥物均有明顯的不良反應(yīng),臨床應(yīng)用具有局限性。有學(xué)者將ADSCs和毛囊真皮乳頭細(xì)胞（DPCs）共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)ADSCs可以有效促進(jìn)DPCs的增殖能力,增強(qiáng)DPCs的分泌功能及DPCs誘導(dǎo)毛囊形成的能力，促進(jìn)毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期[48]。同時(shí)在免疫性脫發(fā)小鼠模型中,經(jīng)ADSCs混合培養(yǎng)基注射治療，小鼠毛發(fā)質(zhì)量增加,毛發(fā)生長(zhǎng)情況改善，免疫組化顯示ADSCs可以下調(diào)毛囊周圍的免疫功能,降低局部炎癥因子水平[49]。國(guó)外也有研究通過隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ADSCs治療的安全性[50-51],結(jié)果顯示無嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生。ADSCs的應(yīng)用為治療免疫性脫發(fā)提供良好理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3 小結(jié)

自身免疫性皮膚疾病的治療始終是個(gè)亟待研究的難題。目前傳統(tǒng)的治療方案包括糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，以對(duì)癥治療、延緩病情進(jìn)展為主。近年來生物制劑也被廣泛研究和應(yīng)用。但是無論是哪種方案，都存在長(zhǎng)期使用后不良反應(yīng)大、成本高昂、易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)。ADSCs同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)與再生作用，在創(chuàng)傷、腫瘤、糖尿病等物理因素造成的皮膚創(chuàng)面修復(fù)方面應(yīng)用價(jià)值得到了認(rèn)同，對(duì)于自身免疫性皮膚病的治療也存在很大潛力。ADSCs的免疫調(diào)節(jié)作用涉及T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和NK細(xì)胞等，控制免疫細(xì)胞的炎癥狀態(tài)，促進(jìn)免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子。ADSCs也可以通過旁分泌功能——分泌可溶性介質(zhì)和EVs，達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的目的。

目前，ADSCs體外誘導(dǎo)和分化技術(shù)已經(jīng)十分成熟，而在生物體內(nèi)移植后的成活時(shí)間卻是個(gè)難以解決的問題。有研究表明，通過靜脈輸注ADSCs后，經(jīng)由接受者的免疫系統(tǒng)抵抗，ADSCs難以在損傷組織維持一個(gè)長(zhǎng)時(shí)間的移植狀態(tài)[64]。雖然ADSCs也可以分泌可溶性分子達(dá)到免疫調(diào)節(jié)目的，但是往往在幾天以后便難以在組織中檢測(cè)到。并且，由于其固有的生物特性和多樣分化的能力，ADSCs是否具有潛在致瘤可能仍未有明確答案。但總的來說，ADSCs在免疫性皮膚病中具有良好的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步研究。