蘭州百合防病促生細(xì)菌篩選及其效果評(píng)價(jià)

李雪萍，張怡忻，李建軍，許世洋，漆永紅，荊卓瓊，郭致杰*，李敏權(quán)*

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，蘭州 730070）

蘭州百合Lilium davidiivar.unicolor是甘肅省蘭州市及周邊地區(qū)的特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，是我國唯一的甜百合。因其球莖大、色澤白、口感鮮美而享譽(yù)國內(nèi)外，具有可觀的食用、醫(yī)藥、保健和裝飾價(jià)值；其富含蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有清熱安神、滋陰養(yǎng)肺、美容養(yǎng)顏及提高免疫力等功能[1,2]。因此，蘭州百合越來越受消費(fèi)者歡迎，需求量逐年增加，但種植條件較為苛刻，適宜種植的土地有限，從而導(dǎo)致連作重茬現(xiàn)象日益嚴(yán)重，其產(chǎn)量和品質(zhì)大幅下降[3]。究其原因，一是植物根系分泌物的自毒作用[4]，二是土壤養(yǎng)分失衡[5]，如土壤酸性增強(qiáng)、速效鉀流失、有機(jī)質(zhì)缺乏等[6]，三是土壤板結(jié)等物理因素以及枯萎病[7]。針對(duì)蘭州百合連作引起的一系列土壤問題及枯萎病等尚未得到有效解決。

土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)的作用顯著，研究發(fā)現(xiàn)[8]，其在促進(jìn)土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)，以及維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和可持續(xù)性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。尤其當(dāng)植物發(fā)生連作障礙時(shí)，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生變化，有益微生物豐度降低，有害物種及病原菌的豐度升高[9]；加之土壤養(yǎng)分失衡、土壤酸化、硬化及鹽漬化，導(dǎo)致有益微生物活性進(jìn)一步降低，病原菌等有害微生物大量繁殖[10]。在綜合考慮生態(tài)、環(huán)境及經(jīng)濟(jì)效益的前提條件下，從微生態(tài)角度去解決百合連作障礙引起的問題，是一種有效的手段。

植物根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）在土壤微生物群落中扮演著重要的角色，其具有溶磷、固氮、解鉀及產(chǎn)生植物生長激素和抑制病原真菌生長的能力，在促進(jìn)植物生長以及協(xié)助植物抵抗脅迫條件、保持土壤肥力、改善土壤微生態(tài)環(huán)境方面發(fā)揮著不可或缺的作用[11-13]，能部分取代化肥、農(nóng)藥和一些生長調(diào)節(jié)劑[14]。在小麥[15]、玉米[16]、青稞[17]等糧食作物及辣椒[18]、番茄[19]等經(jīng)濟(jì)作物均有研究和應(yīng)用，但針對(duì)蘭州百合的研究應(yīng)用尚未發(fā)現(xiàn)。本研究從健康百合根際土壤中篩選能抑制百合枯萎病病原茄鐮孢Fusarium solani和尖鐮孢Fusarium oxysporum拮抗細(xì)菌及能溶磷、解鉀及固氮的促生細(xì)菌，并初步制成菌劑，研究其防病促生效果，以期為百合生產(chǎn)上連作障礙的解決及病害防控提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土壤 采自甘肅省蘭州市榆中縣馬坡鄉(xiāng)及園子鄉(xiāng)不同生長時(shí)期的健康百合根際，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試病原真菌 蘭州百合枯萎病病原茄鐮孢Fusarium solani和尖鐮孢Fusarium oxysporum由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生防研究室提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基（Luria-Bertani培養(yǎng)基）[20]；PDA 培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar）[20]；Pikovaskaia’s（PKO）無機(jī)磷培養(yǎng)基[21]；蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基[21]；無氮培養(yǎng)基（Nitrogen free medium，NFM）：CaCl2·2H2O 0.02 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，NaMoO4·2H2O 0.002 g，NaCl 0.1 g，蘋果酸 5.0 g，生物素10 μg，0.5%溴百里酚藍(lán)5 mL，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0；鉀長石培養(yǎng)基：蔗糖5 g，葡萄糖 5 g，(NH4)2SO40.5 g，酵母粉 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，磷酸氫二鈉 2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·7H2O 0.03 g，鉀長石2 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2。

1.1.4 供試百合種球 本地市售健康蘭州百合。

1.2 防病促生細(xì)菌篩選

分別制作LB、PKO、蒙金娜有機(jī)磷、NFM、鉀長石平板，稱取供試土壤10 g，稀釋至10-5，用移液槍吸取500 μL稀釋液注入各平板中，用涂布器涂布均勻，每樣品每平板10個(gè)重復(fù)，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，挑取LB平板上的單菌落，采用平板劃線法進(jìn)行純化后，采用平板對(duì)峙法篩選拮抗菌株，即將已活化的病原真菌（菌餅直徑=0.6 cm）接種于PDA平板中央，并在四周等距離（距離培養(yǎng)中心2.5cm處）接種已純化的細(xì)菌，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，測定抑菌圈大小，得到拮抗菌；同時(shí)觀察PKO無機(jī)磷平板、蒙金娜有機(jī)磷平板上的單菌落是否有溶磷圈，挑取有溶磷圈的單菌落經(jīng)平板劃線法純化后，點(diǎn)接于相應(yīng)的PKO無機(jī)磷平板、蒙金娜有機(jī)磷平板上，30 ℃培養(yǎng)5 d后，測定其溶磷圈直徑，得到溶磷菌；挑取NFM平板上的單菌落采用平板劃線法純化得到固氮菌；挑取鉀長石平板上的單菌落采用平板劃線法純化得到解鉀菌。最后將篩選得到的各菌株分別接種于 PKO、蒙金娜、NFM、鉀長石平板上，觀察在PKO和蒙金娜有機(jī)磷平板上是否有溶磷圈、在NFM和鉀長石平板上能否生長判斷各菌株是否具有溶磷、固氮及解鉀功能，以及采用平板對(duì)峙法進(jìn)行拮抗功能測定，確定各菌株所具有的性能[18]。

1.3 定量測定各菌株防病促生性能

1.3.1 拮抗菌株抑菌率的測定 將1.2中有拮抗功能的菌株經(jīng)LB平板活化后，接入LB培養(yǎng)液中（裝液量：50 mL/150 mL三角瓶，下同），30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)3 d后，將發(fā)酵液裝入10 mL離心管中，10000×g離心10 min，將上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾，取1 mL濾液于涂布于PDA平板上，制成帶毒平板，并以未涂布發(fā)酵液的PDA平板上為對(duì)照，分別接入供試病原真菌茄鐮孢（FS）和尖鐮孢（FO）（菌餅直徑=0.6 cm），每處理3重復(fù)，于25 ℃下恒溫培養(yǎng)5 d后，測量病原菌直徑，計(jì)算生長抑制率。生長抑制率（%）=（對(duì)照平板病原菌菌落直徑－帶毒平板病原菌菌落直徑）/（對(duì)照平板菌落直徑－接入菌餅直徑）×100[18]。

1.3.2 溶磷菌株溶磷量的測定 選取溶磷圈D/d＞1.5的菌株，經(jīng)LB平板活化后，接入LB培養(yǎng)液中，30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)36～48 h后，取1 mL濃度為108CFU/mL的菌液分別接入PKO、蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)液中，每菌株3重復(fù)，以不接菌的培養(yǎng)液為對(duì)照，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)10 d后，采用鉬銻抗比色法測定磷含量[22]。

1.3.3 固氮菌株固氮量的測定 將1.2中確定有固氮功能的菌株經(jīng)LB平板活化后，接種于LB培養(yǎng)液中，30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)36～48 h后，取1 mL濃度為108CFU/mL的菌液接入NFM培養(yǎng)液中，每菌株3重復(fù)，以不接菌的培養(yǎng)液為對(duì)照，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)7 d后，委托甘肅國信潤達(dá)分析測試中心測定各培養(yǎng)液的氮含量[18]。

1.3.4 解鉀菌株解鉀量的測定 將1.2中確定有解鉀功能的菌株經(jīng)LB平板活化后，接種于LB培養(yǎng)液中，30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)36～48 h后，取1 mL濃度為108CFU/mL的菌液接入鉀長石培養(yǎng)液中，每菌株3重復(fù)，以不接菌的培養(yǎng)液為對(duì)照，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)7 d后，委托甘肅國信潤達(dá)分析測試中心測定各培養(yǎng)液中水溶性鉀的含量[18]。

1.4 優(yōu)良菌株的互作效應(yīng)及菌劑配方篩選

選取1.3中各功能良好的菌株若干，兩兩采用劃十字線的方法測定各菌株間是否有拮抗或抑制作用。然后將相互無拮抗作用的各菌株隨機(jī)組合，每組合3次重復(fù)，按照1.3中的方法測定各復(fù)合菌液的生長抑制率、溶磷量、固氮量及解鉀量，最后進(jìn)行Topsis綜合分析，得到最優(yōu)組合及菌劑配方[18]。

1.5 優(yōu)良菌株鑒定及安全性測定

采用DNA提取試劑盒（OMEGA），參照說明書按步驟提取1.4中最優(yōu)組合及菌劑配方所涉及菌株的DNA，采用細(xì)菌 16S rDNA 通用引物 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGCT ACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參考李雪萍等[23]體系進(jìn)行，1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，最后將所獲得的序列在GenBank基因庫進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，并用MEGA7.0中的UPGMA方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 1000重復(fù)檢驗(yàn)其可信度。

1.6 菌劑制備及其防病促生效果測定

1.6.1 菌劑制備 將優(yōu)良組合中的菌株活化后分別按5%的接種量接種于LB培養(yǎng)液中，在30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min條件下，培養(yǎng)36～48 h，實(shí)時(shí)監(jiān)測培養(yǎng)液中活菌濃度，當(dāng)活菌濃度達(dá)到109CFU/mL時(shí)，終止培養(yǎng)，形成接種劑。在無菌條件下，將接種劑與菌劑載體（專利公布號(hào)：CN113583878A）按1:5的比例混合，置于30 ℃下培養(yǎng)7 d，形成蘭州百合防病促生微生物菌劑。

1.6.2 田間小區(qū)試驗(yàn)評(píng)定菌劑效果 采用田間小區(qū)試驗(yàn)對(duì)菌劑效果進(jìn)行評(píng)定，試驗(yàn)設(shè)在蘭州市榆中縣園子鄉(xiāng)，設(shè)CK、TB1、TB2、TB3等4個(gè)處理，CK不施肥不施藥；TB1施磷酸二銨35 kg/畝，硫酸鉀20 kg/畝（基肥），種球在50%多菌靈粉劑500×液中浸泡15 min；TB2施菌劑8 kg/畝（拌種），不施農(nóng)藥；TB3施菌劑8 kg/畝（拌種），磷酸二銨21 kg/畝，硫酸鉀16 kg/畝（基肥），不施農(nóng)藥。百合種球?yàn)槎?jí)種球，平均重量16 g，株距15 cm，行距25 cm，每個(gè)小區(qū)面積50 m2（5 m×10 m），每處理4重復(fù)，坡度小于10°，隨機(jī)分區(qū)，栽植時(shí)間2020年3月28日，多云。后期管理為5月15日中耕一次，7月8日中耕一次。于9月28日統(tǒng)計(jì)百合枯萎病發(fā)病率，計(jì)算防效，防效（%）=（對(duì)照組發(fā)病率－處理組發(fā)病率）/對(duì)照組發(fā)病率×100，并于11月28日對(duì)百合進(jìn)行采挖，統(tǒng)計(jì)其產(chǎn)量，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室測定其品質(zhì)、根際土壤養(yǎng)分。

1.6.3 百合品質(zhì)測定 參照相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)百合品質(zhì)指標(biāo)可溶性糖[24]、粗纖維[25]、粗灰分[26]、粗蛋白[27]、粗脂肪[28]、還原糖[29]含量進(jìn)行測定，采用直接碘量法測定 Vc含量[30]、flavone含量的測定參照姜喜等[31]方法進(jìn)行。

1.6.4 土壤養(yǎng)分測定 采用堿解擴(kuò)散法測定堿解氮含量，碳酸氫納法測定速效磷含量，采用乙酸銨浸提、火焰光度法測定速效鉀含量[32]；采用容量法測定過氧化氫酶活性，靛酚藍(lán)比色法測定脲酶活性，3,5-二硝基水楊酸比色法測定蔗糖酶活性，磷酸苯二鈉比色法測定堿性磷酸酶活性[33]；參考吳小虎[34]、姚拓等[35]方法對(duì)土壤固氮酶基因nifH的相對(duì)豐度、好氣性自生固氮菌及嫌氣性自生固氮菌的含量進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 防病促生細(xì)菌的篩選

共篩選得到防病促生菌株140株，其中拮抗菌81株，溶有機(jī)磷菌102株，溶無機(jī)磷菌82株，固氮菌118株，解鉀菌32株。部分生防菌株抑菌圈直徑如表1所示，JK7、JK9、JK4、JK3、M16的抑菌效果較好，抑菌圈直徑在25 mm以上，并和其他菌株間差異顯著（P＜0.05）。JK7和JK9對(duì)兩種病原均有較好的抑菌效果，JK3對(duì)尖鐮孢（FO）的抑菌效果最明顯，菌圈直徑達(dá)31.64 mm，部分菌株的抑菌效果圖如圖1所示。

圖1 部分拮抗菌株的抑菌效果Fig.1 Fungistatic effect of some antagonistic strains

表1 部分拮抗菌株的抑菌圈直徑Table 1 Inhibition zone diameters of some antagonistic strains

如表2所示，O3、JK10、JK22、N11、N2等表現(xiàn)出較好溶有機(jī)磷（OP）能力，其溶磷圈直徑均大于15 mm，與其他各溶有機(jī)磷磷菌株差異顯著（P＜0.05）。溶無機(jī)磷（IP）能力較好的菌株則有O1、O5、M53、M26、M14等5株菌，其溶磷圈直徑均大于10 mm，與其他各溶無機(jī)磷菌株亦差異顯著（P＜0.05）。部分菌株溶磷效果如圖2所示。

表2 部分溶有機(jī)磷（OP）、無機(jī)磷（IP）菌株的溶磷圈直徑Table 2 Phosphorus cycle diameters of some organophosphorus (OP) and inorganic phosphorus (IP) strains

圖2 部分菌株溶磷效果Fig.2 Phosphorus dissolving effect of some strains

2.2 防病促生細(xì)菌的性能

2.2.1 拮抗菌株的抑菌效果 如表3所示，部分拮抗菌株抑菌效果不明顯，對(duì)茄鐮孢（FS）有抑菌作用的菌株僅有3株，分別為JK7、M54、M16，其抑菌率均較低；對(duì)尖鐮孢（FO）抑菌效果較好的菌株有M6、N4、JK22等，其抑菌率均大于40%，與對(duì)照（CK）的差異均顯著（P＜0.05），M6的抑菌效果最好，抑菌率為46.15%。

表3 部分拮抗菌株的抑菌率Table 3 Inhibition rate of some antagonistic strains

2.2.2 溶磷菌株的溶磷量 如表4所示，菌株N11溶有機(jī)磷能力最強(qiáng)，溶有機(jī)磷量達(dá)71.73 μg/mL，其pH也最低，為5.91，與其他菌株的差異顯著（P＜0.05）；其次為JK21和B7，溶有機(jī)磷量分別為46.21和42.08 μg/mL，其他菌株的溶有機(jī)磷量最低為5.29 μg/mL，最高為36.45 μg/mL。各菌株溶無機(jī)磷能力均較強(qiáng)，最高為M40，達(dá)913.89 μg/mL，其次為JK5，溶無機(jī)磷量為741.22 μg/mL，其他各菌株的溶無機(jī)磷量在207.81 μg/mL～686.22 μg/mL之間，多數(shù)菌株間溶磷能力差異顯著（P＜0.05），pH也隨溶無機(jī)磷量增加呈降低趨勢，各菌株間pH差異不顯著（P＜0.05）。

表4 部分溶有機(jī)磷（OP）、無機(jī)磷（IP）溶磷量Table 4 Phosphorus solubility of some organophosphorus (OP) and inorganic phosphorus (IP) strains

2.2.3 菌株的固氮量及解鉀量 菌株的固氮量及解鉀量如表5所示，其中菌株JK19的固氮能力最好，固氮量達(dá)0.102 g/L，其次為M18，固氮量為0.091 g/L，其他菌株的固氮量集中在0.049～0.086 g/L，與對(duì)照的差異顯著（P＜0.05）。各菌株的解鉀能力差異較大（P＜0.05），JK16、JK4、JK18的解鉀量均較高，達(dá)98 mg/L，JK14、JK19的解鉀量則達(dá)96.23和96.73 mg/L，解鉀能力最低為菌株N11，解鉀量僅為7.97 mg/L。

表5 部分菌株的固氮量及解鉀量Table 5 Nitrogen fixation and potassium release amount of some strains

2.3 優(yōu)良菌株的互作效應(yīng)

挑選若干優(yōu)良菌株通過十字劃線法兩兩進(jìn)行拮抗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各組合菌株間無拮抗作用。測定各優(yōu)良菌株組合的抑菌、溶磷、固氮及解鉀能力發(fā)現(xiàn)，其中有5個(gè)組合BP1～BP5各項(xiàng)能力較優(yōu)（表6），組合BP3、BP4、BP5的抑菌能力相當(dāng)，均達(dá)到了70%以上；組合BP5溶有機(jī)磷能力最強(qiáng)，BP2次之；BP4溶無機(jī)磷、固氮和解鉀能力均最強(qiáng)，BP5和BP3次之。各組合間的各項(xiàng)性能不一，差異較大（P＜0.05），經(jīng)Topsis綜合分析發(fā)現(xiàn)，BP5綜合性能最佳，統(tǒng)計(jì)量為0.6911，其次是BP3和BP4。

表6 優(yōu)良菌株組合的功能特性Table 6 Functional characteristics of superior strain combinations

2.4 優(yōu)良菌株分類地位的確定及安全性

對(duì)最優(yōu)組合 BP5所涉及的 4株菌進(jìn)行分子鑒定發(fā)現(xiàn)（圖 3），JK21與耐寒短桿菌Brevibacterium frigoritolerans的遺傳距離為0，1000次重復(fù)自展支持率為100，序列提交至GenBank登錄號(hào)為OM722062；JK22與蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus的遺傳距離為0，1000次重復(fù)自展支持率為100，登錄號(hào)為OM722059；

圖3 基于16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA

N11和M40與枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis的遺傳距離為0，1000次重復(fù)自展支持率亦為100，提交至GenBank登錄號(hào)分別為OM722061和OM722060。因此，JK21鑒定為耐寒短桿菌，JK22鑒定為蠟樣芽胞桿菌，N11和M40鑒定為枯草芽胞桿菌。

2.5 蘭州百合防病促生微生物菌劑效果

2.5.1 對(duì)百合枯萎病的防效 如圖4所示，3組處理較CK而言，其發(fā)病率均顯著降低，但各處理間差異不顯著（P＜0.05），說明菌劑防效與化學(xué)藥劑多菌靈處理效果相當(dāng)，菌劑處理TB2的百合枯萎病發(fā)病率為9.15%，防效為68.93%，菌劑加施基肥處理TB3枯萎病的發(fā)病率為8.95%，防效為69.91%。

圖4 不同處理百合枯萎病發(fā)病率Fig.4 Incidence of lily fusarium wilt under different treatments

2.5.2 對(duì)百合產(chǎn)量的影響 如表 7所示，純菌劑處理組（TB2）低于藥劑處理組（TB1），但其使單株百合母鱗莖鮮重較對(duì)照而言增加了2倍，為61.40 g，菌劑加基肥處理組（TB3）增加更顯著，達(dá)81.20 g，為對(duì)照組的2.6倍，各處理間差異顯著（P＜0.05）。同樣，單株總小鱗莖鮮重的3組處理（TB1、TB2、TB3）較對(duì)照（CK）均大幅提升，藥劑處理（TB1）單株總小鱗莖鮮重最大，為65.00 g，純菌劑處理組（TB2）與菌劑加基肥處理組（TB3）的單株總小鱗莖鮮重分別為54.03和60.57 g，比對(duì)照組（CK）增加40 g左右。除此之外，各處理小鱗莖數(shù)量較對(duì)照（CK）而言，顯著增加2～3個(gè)（P＜0.05）。與鮮重不同的是，菌劑處理（TB2）和菌劑加基肥處理（TB3）的小鱗莖數(shù)量高于藥劑處理（TB1），說明菌劑處理發(fā)揮效果較藥劑慢，但作用更長久，下一季百合總產(chǎn)量可能較藥劑處理更高。

表7 不同處理的百合產(chǎn)量Table 7 The lily yields of different treatments

2.5.3 對(duì)百合品質(zhì)的影響 如表8所示，不同處理方式對(duì)各指標(biāo)的影響較大，較對(duì)照CK而言，除flavone的藥劑處理（TB1）含量有所降低之外，其他處理可溶性糖、還原糖、粗蛋白、粗脂肪、Vc和flavone含量均升高，粗灰分和粗纖維的含量降低，說明菌劑處理可以使百合口感、營養(yǎng)價(jià)值、保健價(jià)值及藥用價(jià)值等品質(zhì)提升。其中，可溶性糖、粗蛋白、粗脂肪、Vc含量均呈現(xiàn)出菌劑加基肥處理組（TB3）＞純菌劑處理組（TB2）＞藥劑處理組（TB1）＞對(duì)照組（CK）的趨勢，粗纖維和粗灰分的含量則呈現(xiàn)出菌劑加基肥處理組（TB3）＜純菌劑處理組（TB2）＜藥劑處理組（TB1）＜對(duì)照組（CK）的趨勢，還原糖的含量呈現(xiàn)出純菌劑處理組（TB2）＞菌劑加基肥處理（TB3）＞藥劑處理組（TB1）＞對(duì)照組（CK）的趨勢，F(xiàn)lavone的含量則呈現(xiàn)出（TB3）＞純菌劑處理組（TB2）＞對(duì)照組（CK）＞藥劑處理組（TB1）的趨勢，由此可見，除還原糖為純菌劑處理效果最好之外，其他均為菌劑加基肥處理效果最好，可溶性糖含量高達(dá)22.6 g/100 g，粗蛋白和粗脂肪含量分別為11.53和0.88 g/100 g，粗灰分和粗纖維的含量則分別低至2.85和0.72 g/100 g，Vc含量高達(dá)8.73 mg/100g，flavone含量較對(duì)照而言提高了0.1 mg/g；除此之外，藥劑處理（TB1）對(duì)flavone含量的影響不大，使其含量略有降低，但與對(duì)照（CK）差異不顯著。

表8 不同處理的百合品質(zhì)Table 8 The lily qualities of different treatments

2.5.4 對(duì)土壤養(yǎng)分的影響 如表9所示，藥劑處理（TB1）、純菌劑處理（TB2）和菌劑加基肥處理（TB3）均可以使百合根際土壤中堿解氮、速效鉀和速效磷含量升高，但除堿解氮外，藥劑處理（TB1）使速效鉀和速效磷含量增加不顯著（P＞0.05），速效磷僅增加了1.03 mg/kg，加有菌劑的處理TB2和TB3的各土壤養(yǎng)分含量增加顯著（P＜0.05），如速效磷含量純菌劑處理（TB2）達(dá)40.44 mg/kg，較對(duì)照（CK）翻一番，說明菌劑的使用有助于提升百合根際土壤養(yǎng)分。藥劑處理（TB1）使過氧化氫酶含量升高，菌劑處理使過氧化氫酶含量降低，尤其是純菌劑處理（TB2）使過氧化氫酶含量降低更為顯著（P＜0.05），至1.21 mL/g，過氧化氫酶反應(yīng)的是土壤能量代謝情況，說明藥劑的使用使土壤能量消耗提高，菌劑則可以降低土壤能量消耗。同樣，藥劑處理（TB1）使脲酶、蔗糖酶和堿性磷酸酶的含量降低，而菌劑處理TB2和TB3使脲酶、蔗糖酶和堿性磷酸酶的含量升高，說明菌劑能使百合根際土壤碳、氮、磷代謝增強(qiáng)，有助于土壤質(zhì)量改善。除此之外，純菌處理組（TB2）百合根際土壤中固氮基因、好氧自生固氮菌和厭氧自生固氮菌含量均顯著增高（P＜0.05），分別為 2.09×103、4.86×104、1.35×104CFU/g，而藥劑處理（TB1）的固氮基因含量有所降低，好氧自生固氮菌增加量不高，厭氧自生固氮菌的增加不顯著，說明藥劑和肥料的使用均會(huì)對(duì)百合根際有益菌產(chǎn)生不良影響。

表9 不同處理百合根際土壤養(yǎng)分Table 9 Soil nutrients in lily rhizosphere under different treatments

3 討論

植物根際促生細(xì)菌因具有溶磷、固氮、解鉀等促進(jìn)植物生長的功能在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上越來越被重視，在改良土壤養(yǎng)分、土壤質(zhì)地以及增加土壤調(diào)節(jié)能力方面發(fā)揮重要作用。而針對(duì)百合所生長特殊的地理環(huán)境及氣候條件，引進(jìn)菌劑作用效果不明顯，加之枯萎病發(fā)生嚴(yán)重，使得研發(fā)百合防病促生菌劑勢在必行。本研究從健康百合根際土壤中篩選了具有本土化的百合根際促生菌同時(shí)考慮其對(duì)百合枯萎病的防效，篩選得到高效溶有機(jī)磷（71.73 μg/mL）、無機(jī)磷（913.39 μg/mL）、固氮（0.091 g/L）、解鉀（98 mg/L）能力的菌株，較Mahdi等[36]、撖冬榮等[37]所篩選的促生菌能力高出2～5倍，但就其拮抗能力較目前研究而言[38]，處于中等水平，這可能與生境、作物種類不同有關(guān)。

百合種植環(huán)境及條件特殊，加之不同菌株的功能不同，單一菌株所制成的菌劑發(fā)揮的作用有限，而復(fù)合菌劑具有功能全、效果發(fā)揮穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。在多株菌聯(lián)合施用的情況下，不同菌株間的協(xié)同作用提高了菌株在土壤中的存活幾率，在防治植物病害，促進(jìn)植物生長、改善土壤性質(zhì)等方面相對(duì)于單菌劑均具有更大的優(yōu)勢。本研究將所篩選的優(yōu)良菌株進(jìn)行組合發(fā)現(xiàn)，其抑菌率、溶磷、解鉀及固氮能力均大幅提升，尤其是抑菌能力幾乎翻一番，說明采用優(yōu)良的菌株組合效果要好于單一菌株，其互相協(xié)同機(jī)制如何還需要進(jìn)一步研究。鑒定發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)組合所涉及的菌株為枯草芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌及耐寒短桿菌。研究[39,40]表明，枯草芽胞菌和蠟樣芽胞桿菌是良好的防病促生菌種，與本研究結(jié)果一致；耐寒短桿菌則在生物修復(fù)和防控病害方面作用突出[41,42]，本研究則發(fā)現(xiàn)其具有良好溶磷能力、固氮和解鉀作用，說明耐寒短桿菌的功能多樣，其價(jià)值有待進(jìn)一步開發(fā)。

眾多研究表明[43-46]，功能微生物菌劑對(duì)病害防控、作物品質(zhì)提升、土壤養(yǎng)分調(diào)節(jié)有積極的作用。同時(shí)能達(dá)到廢棄物利用[47]、生態(tài)修復(fù)及環(huán)境保護(hù)[48]的效果。如王國麗等[49]研究發(fā)現(xiàn)，使用功能微生物菌劑使向日葵的葉面積、株高、地上部干物質(zhì)量分別提高7.52%、57.67%和46.51%；王麗麗等[50]研究發(fā)現(xiàn)，施用微生物菌肥和菌劑能促進(jìn)番茄植株生長，增加番茄產(chǎn)量，提高果實(shí)品質(zhì)，但其和基肥搭配使用效果較好。本研究發(fā)現(xiàn)，使用微生物菌劑可以大幅降低百合枯萎病發(fā)生率，提高產(chǎn)量及百合品質(zhì)，同時(shí)改善了土壤質(zhì)量，與在其他作物上報(bào)道的效果相似，但純菌劑處理部分指標(biāo)與菌劑加基肥處理相比存在差異（P＜0.05）。因此，菌劑在如何快速穩(wěn)定起效方面還有待進(jìn)一步加強(qiáng)研究。