防風(fēng)根腐病拮抗真菌的篩選鑒定及生防作用研究

韓忠明，孫 卓，王 妍，張福軍，馬峰敏，羅秋菊，楊利民*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院/省部共建生態(tài)恢復(fù)和生態(tài)系統(tǒng)管理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，長春 130118； 2.集安市太王鎮(zhèn)林業(yè)工作站，集安 134200；3.吉林查干湖國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，松原 131111）

防風(fēng)Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schisck.為傘形科防風(fēng)屬植物，以未抽花莖植株的干燥根入藥。味辛、微甘、性溫，具有止痙、祛風(fēng)解表、勝濕止痛的功效[1]。防風(fēng)作為新型冠狀病毒診療方案推薦中成藥“防風(fēng)通圣丸”等中成藥的重要原料，同時也是我國傳統(tǒng)的出口藥材，具有廣闊的應(yīng)用前景和可觀的經(jīng)濟(jì)價值。隨著防風(fēng)用量不斷增加，并出口韓國、日本及東南亞各國，導(dǎo)致野生資源銳減，價格逐年上漲，為此，防風(fēng)的栽培面積逐漸擴(kuò)大，主要集中在東北和內(nèi)蒙古等地區(qū)，其中吉林省白城地區(qū)防風(fēng)的栽培面積占全國面積的60%以上，但隨著栽培面積的不斷擴(kuò)大，防風(fēng)根腐病逐年加重，發(fā)病范圍逐漸擴(kuò)大，造成防風(fēng)大面積減產(chǎn)。木賊鐮刀菌是引起防風(fēng)根腐病的主要病原菌，通過入侵根部成為優(yōu)勢種，并破壞維管束組織來減少根部內(nèi)生真菌的聯(lián)合[2]。防風(fēng)根腐病發(fā)病初期根部產(chǎn)生褐色腐爛病斑，發(fā)病后期，染病根莖部有黑褐色、水漬狀、長條形的腐爛病斑。地上部分葉片變黃、細(xì)小，最后整株枯死[3]，已成為嚴(yán)重危害防風(fēng)根莖類中藥材的主要病害之一。目前，對于防風(fēng)根腐病主要采用惡霉靈、多菌靈、50%托布津等[3]化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治。然而長期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅容易導(dǎo)致農(nóng)藥殘留[4]，還會形成病害抗藥性[5]、破壞生態(tài)平衡[6]、造成環(huán)境污染并且對人類身體健康構(gòu)成威脅[7]。而生物防治具有綠色安全無污染等特點(diǎn)，為此，生防菌的開發(fā)與應(yīng)用成為了植物病害合理化防控的研究熱點(diǎn)[8]。

藥用植物根際微生物作為寶貴的微生物資源，在植物病害生物防治方面越來越引起研究者們的關(guān)注。根際微生物種類豐富，可通過競爭、寄生、拮抗等作用方式抑制病原菌生長，提高植物防御酶活性、分泌促生長物質(zhì)等促進(jìn)植物生長。近年來，利用根際微生物防治中藥材土傳病害研究已取得部分進(jìn)展，杜用璽[9]從丹參根際土壤中分離出對丹參根腐病具有拮抗效果菌株SMRA-220，且可產(chǎn)生IAA，促進(jìn)丹參生物量的積累。高芬等[10]從黃芪根圍土中分離出一株對黃芪根腐病具有較強(qiáng)拮抗效果的萎縮芽胞桿菌。目前，從防風(fēng)分離得到病原菌主要有防風(fēng)殼狀孢、獨(dú)活白粉菌和旱芹葉點(diǎn)霉等[11]，而關(guān)于防風(fēng)根際土壤生防菌的分離和鑒定鮮有報(bào)道，因此從防風(fēng)根際土壤中分離篩選對根腐病具有較高防治效果的生防菌株，并用于防治防風(fēng)根腐病具有重要的理論和意義和實(shí)際指導(dǎo)意義。本研究以防風(fēng)根際土壤為研究材料，分離獲得一株對木賊鐮刀菌具有較強(qiáng)抑菌活性的拮抗菌株，并對其進(jìn)行了形態(tài)、顯微特征和ITS基因序列鑒定，并對此拮抗真菌的抑菌機(jī)理及在土壤中的定殖和對防風(fēng)的防病效果進(jìn)行了初步研究。為防治防風(fēng)根腐病、提高防風(fēng)產(chǎn)量具有指導(dǎo)意義，同時為微生物農(nóng)藥的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

防風(fēng)根際土壤采集于2020年7月從吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物園（43°48′23″N，125°24′57″） 采集人工栽培健康的1年生防風(fēng)植株的根際土壤，采用五點(diǎn)取樣法結(jié)合抖落法，采集健康防風(fēng)植株根際土壤（距離主根及須根根軸表面0～3 mm土壤），裝于無菌自封袋中，放入4 ℃ 冰箱內(nèi)保存，備用。

木賊鐮刀菌Fusarium equiseti、尖孢鐮刀菌F.oxysporum、腐皮鐮刀菌F.solani、細(xì)極鏈格孢Alternaria tenuissima、鵝掌楸鏈格孢A.liriodendra、毀滅柱孢菌Cylindrocarpon destructans、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、灰葡萄孢Botrytis cinerea、惡疫霉Phytophthora cactorum、核盤菌Sclerotinia sclerotiorum均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂17.0 g，去離子水1000 mL；馬鈴薯葡萄糖水（Potato Dextrose Broth，PDB）：去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，去離子水1000 mL。

供試藥劑70%代森錳鋅可濕性粉劑（四川潤爾科技有限公司）、枯草芽胞桿菌可濕性粉劑（山東魯抗生物農(nóng)藥有限責(zé)任公司）、哈茨木霉可濕性粉劑（山東綠隴生物科技有限公司）、97%利福平（上海麥克林生化科技有限公司）、DNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（TaKaRa寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）。

Nikon eclipse 50i 三目顯微鏡（尼康儀器有限公司）、THZ-702B全溫度振蕩培養(yǎng)箱（太倉市華美生化儀器廠）、PTC-300光照培養(yǎng)箱（上海三騰儀器有限公司）、DYY-8C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、Applied Biosystems ProFlex PCR儀（賽默飛世爾科技有限公司）、Multifug1 X1R高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 拮抗真菌的分離純化 采用稀釋培養(yǎng)法分離土壤中的真菌，將防風(fēng)根際土風(fēng)干后過 20目篩，稱取10 g放入裝有90 mL 無菌生理鹽水的錐形瓶中充分震蕩搖勻，依次以10倍梯度稀釋得到各濃度土壤稀釋液。分別取10-3、10-4和10-5的稀釋液200 μL涂布于PDA培養(yǎng)基平板中，在25 ℃倒置暗培養(yǎng)3 d，挑取培養(yǎng)基上形態(tài)各異的單菌落進(jìn)行分離純化，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗菌株的篩選 以木賊鐮刀菌為靶標(biāo)菌，對分離出的真菌采用兩點(diǎn)對峙法進(jìn)行篩選。用打孔器分別在純化好的根際真菌與病原菌邊緣打孔，得到直徑為8 mm的菌餅。將病原菌菌餅接入直徑為90 mm的PDA培養(yǎng)皿中央，在距病原菌菌餅25 mm的兩個對稱點(diǎn)接入根際真菌菌餅，以只接木賊鐮刀菌為對照，重復(fù)3次。置于25 ℃黑暗下倒置培養(yǎng)7 d，計(jì)算每株菌株的抑菌率。抑菌率（%）=[（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/對照菌落直徑]×100%

1.2.3 拮抗菌株的鑒定 選取已純化的待測菌株用打孔器打取8 mm菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央，25 ℃暗培養(yǎng) 14 d，觀察菌落形態(tài)、菌落直徑、孢子大小、形態(tài)和著生方式的特征等，并參照《真菌鑒定手冊》[12]對于病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)的鑒定。

采用TaKaRa DNA提取試劑盒提取菌株MR-47的基因組總DNA。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTA GGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對菌株 MR-47 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：Master Mix 12.5 μL、ITS1 1 μL、ITS4 1 μL、rDNA 2 μL、ddH2O 8.5 μL，擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min[13]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生工進(jìn)行純化測序，測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對。通過MEGA 7.0軟件采用neighbor-joining法構(gòu)建菌株MR-47的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 拮抗菌株發(fā)酵液對木賊鐮刀菌菌絲生長的影響 將待測菌株與木賊鐮刀菌在對峙培養(yǎng)下，挑取兩菌落相交部位菌絲制成玻片，于顯微鏡下觀察待測菌株與木賊鐮刀菌相互作用后病原菌菌絲形態(tài)特征。

1.2.5 拮抗菌株的抑菌譜 以立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、惡疫霉、灰葡萄孢等 10株病原真菌為靶標(biāo)菌，用平板對峙法對拮抗菌株進(jìn)行抑菌譜測定，將10種病原菌打取8 mm菌餅分別接種于PDA平板中央，待測菌株接種于距PDA中心25 mm的兩個對稱點(diǎn)中，培養(yǎng)7 d，計(jì)算抑菌率，抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.2.6 拮抗菌株的定殖 利用抗生素標(biāo)記法[14]標(biāo)記待測菌株，相繼在含有不同濃度利福平的 PDB培養(yǎng)基中對菌株MR-47進(jìn)行逐級誘導(dǎo)，使菌株可在含有抗利福平濃度達(dá)300 μg/mL的PDB培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長的菌株MRRif-47，經(jīng)遺傳穩(wěn)定性后保存、備用。收集標(biāo)記菌株MRRif-47分生孢子（1×108CFU/mL）均勻拌土，每盆土300 g，倒入孢子懸液30 mL，3次重復(fù)。拌土結(jié)束后第7、14、21、28、35d分離土壤中的菌株MRRif-47。菌株MRRif-47的分離：采用梯度稀釋法同1.2.1，取梯度10-4濃度溶液200 μL涂布于含有300 μg/mL利福平的PDA培養(yǎng)皿中，3次重復(fù)，25 ℃培養(yǎng)3 d后統(tǒng)計(jì)每個培養(yǎng)皿中菌落數(shù)量，計(jì)算土壤中含菌量（CFU/g）。

1.2.7 菌株MR-47的盆栽防效試驗(yàn) 挑選長勢一致的1年生健康防風(fēng)幼苗40株，每盆1株，采用針刺法于防風(fēng)莖基部劃傷約1 mm傷口，并以灌注方式沿植株莖基接種木賊鐮刀菌孢子懸液10 mL（孢子濃度為1×107CFU/mL）。試驗(yàn)共設(shè)5個處理組，每組處理8次重復(fù)，各處理組獨(dú)立且完全隨機(jī)分布，具體為：（1）清水50 mL，對照；（2）70%代森錳鋅800倍液50 mL；（3）1×107CFU/mL枯草芽胞桿菌可濕性粉劑50 mL；（4）1×107CFU/mL哈茨木霉可濕性粉劑50 mL；（5）菌株MR-47孢子懸液1×107CFU/mL接種50 mL。接種30 d后調(diào)查防風(fēng)根腐病發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)與防效。

防風(fēng)根腐病病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0級：健株，無病斑；1級：全株10 %以下的葉片發(fā)?。?級：全株11%～25%的葉片發(fā)??；5級：全株26%～50%的葉片發(fā)??；7級：全株51%～75%的葉片發(fā)?。?級：全株76%以上的葉片發(fā)病[15]。病情指數(shù)＝∑（各級病株數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值）×100，防治效果（%）＝（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS12.01軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離和篩選

通過稀釋涂布法共分離到104株真菌菌株，將分離得到的菌株與木賊鐮刀菌做生長對峙實(shí)驗(yàn)，篩選出29株對木賊鐮刀菌具有抑菌效果的拮抗菌株，菌株 MR-47對木賊鐮刀菌有較強(qiáng)抑菌效果，其抑菌率為69.26%（圖1）。因此，選定菌株MR-47進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 菌株MR-47對木賊鐮刀菌的抑菌效果Fig.1 The inhibitory effect of antagonistic strain MR-47 on F.equiseti

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株在PDA中25 ℃暗培養(yǎng)14 d，菌落直徑為53～55 mm，菌絲密實(shí)、絨氈狀、無白邊，形成環(huán)狀輪紋，菌落正面淡粉色；背面有放射狀皺紋、呈橙褐色，有橙黃色分泌物滲入培養(yǎng)基中（圖2a）。菌絲無色，產(chǎn)孢瓶體自菌絲側(cè)生，不分枝、細(xì)長、近無色，長20～35 μm，基部寬1.5～3 μm，端部變窄，寬1～2.5 μm。分生孢子無色、近球形，直徑為3～6 μm（圖2-b）。根據(jù)菌落及顯微形態(tài)鑒定該菌株為枝頂孢屬。

圖2 菌株MR-47菌落及顯微形態(tài)特征Fig.2 Colony and morphological characteristics of strain MR-47

2.2.2 分子鑒定 菌株MR-47的ITS序列長度為476 bp，GenBank登錄號為OK287149.1。將該序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)菌株MR-47與桃色頂孢霉Acremonium persicinum（KT315412.1）的相似度達(dá)99.77%。選擇相似性較高的菌株ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)合形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果最終確定菌株MR-47為桃色頂孢霉Acremonium persicinum。

圖3 菌株MR-47基于18S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain MR-47 based on 18S rDNA sequence

2.3 拮抗菌株對木賊鐮刀菌菌絲的影響

在光學(xué)顯微鏡下，對照菌絲光滑順直、粗細(xì)均勻（圖4a）；與MR-47對峙生長的病原菌菌絲形成縊縮（圖4b）、膨大、扭曲畸形、粗細(xì)不均（圖4c）等現(xiàn)象，說明MR-47可通過產(chǎn)生代謝產(chǎn)物抑制病原菌生長。

圖4 菌株MR-47對木賊鐮刀菌菌絲生長的影響Fig.4 Antibacterial effect of strain MR-47 on hypha growth of F.equiseti

2.4 拮抗菌株的抑菌譜

菌株MR-47對10種病原真菌均具有較強(qiáng)抑菌作用，其中對惡疫霉與毀滅柱孢菌的抑制作用最強(qiáng)，達(dá)到70%以上，分別為72.22%與74.07%。對立枯絲核菌的抑菌效果較弱，僅40.74%。表明拮抗菌株MR-47具有較強(qiáng)的廣譜抑菌能力（表1）。

表1 菌株MR-47對10種病原真菌抑制效果Table 1 Inhibitory effect of strain MR-47 on 10 pathogenic fungi

2.5 拮抗菌株在土壤中定殖能力

經(jīng)抗利福平誘導(dǎo)之后，待測菌株MR-47經(jīng)傳代培養(yǎng)10代，仍可在含有300 μg/mL利福平的PDA中穩(wěn)定生長，標(biāo)號為MRRif-47。土壤定殖試驗(yàn)周期為35 d，未接種標(biāo)記菌株的供試土壤經(jīng)檢測，其所含微生物無法在含有300 μg/mL利福平的PDA平板生長，由此說明，該濃度下的抗生素選擇培養(yǎng)基可用于MRRif-47菌株的有效回收。如圖5所示，土壤中菌株MRRif-47接種第21 d含菌量最低，為5.57×106CFU/g土，而第28 d含菌量最大，達(dá)到8.38×106CFU/g土；隨后菌株MRRif-47的土壤含菌量平緩下降，接種后35 d，其土壤含菌量仍可達(dá)到6.13×106CFU/g。結(jié)果表明，菌株MR-47具有較好土壤定殖能力。

圖5 標(biāo)記菌株MRRif-47在土壤中的定殖量Fig.5 Colonization of MRRif-47 in the soil of S.divaricata

2.6 拮抗菌株盆栽防病效果

菌株MR-47對防風(fēng)根腐病的盆栽防控效果如表2所示，與對照相比，菌株MR-47、農(nóng)藥代森錳鋅、枯草芽胞桿菌及哈茨木霉，對防風(fēng)根腐病發(fā)病率和發(fā)病程度均表現(xiàn)出了不同程度的抑制作用。經(jīng) MR-47孢子懸液處理的防風(fēng)根腐病病情指數(shù)為16.00，相對防效達(dá)75.05 %，相較于代森錳鋅（61.54%）、枯草芽胞桿菌（49.99%）及哈慈木霉（51.89%）處理，具有顯著差異（P＜0.05）。由此說明，菌株MR-47對防風(fēng)根腐病具有顯著防治效果。

表2 菌株MR-47對盆栽防風(fēng)根腐病防效Table 2 Control effect of strain MR-47 on root rot of S.divaricata

3 討論

中藥材是農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要產(chǎn)業(yè)之一，目前我國大力支持以中藥材為基礎(chǔ)的中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)協(xié)同發(fā)展的振興之路。隨著中藥材種植業(yè)的發(fā)展，農(nóng)藥殘留問題受到廣泛關(guān)注[16]。土壤中微生物資源豐富，是拮抗菌篩選的重要來源，本研究從防風(fēng)根際土中分離出 104株根際真菌，并篩選出一株對木賊鐮刀菌抑菌效果達(dá)69.26%的菌株MR-47，根據(jù)對菌落形態(tài)觀察、結(jié)合ITS序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終鑒定菌株MR-47為桃色頂孢霉A.persicinum。

桃色頂孢霉A.persicinum是一株廣泛分布于土壤與海洋中的真菌[17]。目前，關(guān)于桃色頂孢霉的研究較少，主要集中于次生代謝產(chǎn)物的研究，并從中分離出多種環(huán)肽化合物[18]。如Ikuko等[19]從中分離出一種具有較強(qiáng)殺菌能力的螯合鋁離子的環(huán)狀六肽化合物ASP2397。Mohammadian等[20]研究發(fā)現(xiàn)A.persicinum對Zn和Cu具有較強(qiáng)積累能力，可應(yīng)用于土壤修復(fù)。此外，董雪梅等[21]研究發(fā)現(xiàn)頂孢霉菌可明顯抑制玉米圓斑病菌菌絲生長及孢子萌發(fā)。本研究表明，桃色頂孢霉MR-47對尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌等常見病原真菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，表現(xiàn)了良好的廣譜抑菌能力。MR-47與木賊鐮刀菌共培養(yǎng)時，病原菌菌絲出現(xiàn)膨大、縊縮、扭曲等畸形現(xiàn)象，嚴(yán)重影響木賊鐮刀菌菌絲的正常生長。由此推測，桃色頂孢霉MR-47可能通過產(chǎn)生具有抑菌作用的胞外產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)其對防風(fēng)根腐病致病菌木賊鐮刀菌的生長抑制。但桃色頂孢霉 MR-47產(chǎn)生抑菌效應(yīng)的具體物質(zhì)尚不明確，仍需開展后續(xù)工作挖掘研究。

國內(nèi)外許多研究表明，生防菌的定殖能力是影響其生防效果的重要因素[22]。因此，生防菌在植物體內(nèi)和根際土壤中的定殖能力成為評定其是否具有產(chǎn)業(yè)化前景的一個重要指標(biāo)。焦蓉等[23]對生防菌YN201728在煙草內(nèi)的定殖規(guī)律及防病機(jī)制的研究中表明，生防菌密度的定殖規(guī)律為根表土＞根際土＞根＞莖＞葉，在煙草葉片中內(nèi)生菌的定殖量與防效呈正相關(guān)。目前，本研究對菌株MR-47土壤中的定殖能力進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)菌株MR-47定殖于土壤中35 d后，在土壤中仍可達(dá)到較高活菌數(shù)，達(dá)到6.13×106CFU/g。對防風(fēng)根腐病具有較強(qiáng)防治效果，其防效可達(dá) 75.05%，對照組枯草芽胞桿菌與哈茨木霉的防效分別為49.99%、51.89%。綜上所述，分離篩選自防風(fēng)根際土壤的桃色頂孢霉 MR-47在防風(fēng)生態(tài)友好型病害防控方面具有開發(fā)及應(yīng)用潛力。