浙麥冬黑斑病病原菌的分離鑒定及淀粉酶產色鏈霉菌對其生物防治效果

徐亦雯，張 諾，曹瑱艷，申屠旭萍，俞曉平

（中國計量大學生命科學學院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，杭州 310018）

麥冬Ophiopogon japonicas為百合科沿階草屬植物，其作為我國傳統(tǒng)浙八味中的一種，具有較高的藥用價值。麥冬不僅可以作為疾病防治的治療劑，也可以作為健康食品進行使用。麥冬在臨床上以其干燥塊根入藥[1]，其主要成分包括甾體皂苷、高異黃酮和多糖等，具有保護心血管、抗炎、抗癌、抗氧化、免疫調節(jié)、止咳、抗菌和抗糖尿病等多種理化活性[2]。我國麥冬主要有浙江的浙麥冬和四川的川麥冬，而浙麥冬質量優(yōu)于川麥冬[3]。統(tǒng)計顯示，浙江省麥冬種植面積約為 6000多畝，畝產120公斤左右，年產量約為720噸[4]，主要應用于生產中成藥如參麥注射液、生脈膠囊等，給浙江中藥材產業(yè)帶來了巨大的經濟效益。隨著對浙麥冬需求量的不斷增長，浙麥冬的栽植量也日益擴增，隨之而來產生了栽培技術不規(guī)范、病蟲害發(fā)生頻繁和農藥使用不當等問題，對浙麥冬產量和品質產生了嚴重的影響[5]。

根據我們前期調研，黑斑病為浙麥冬主要病害之一，常發(fā)于5月中旬，6—7月為發(fā)病盛期。引起麥冬真菌病害的病原菌主要有尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum[6]、膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides[7]和鏈格孢菌Alternaria alternata[8]等。浙江省慈溪市是浙麥冬的主要種植基地，2019年5月在該基地發(fā)現(xiàn)麥冬植物葉片發(fā)生紅褐色或黃色斑塊，斑塊漸漸擴大導致整個葉片枯死，其傳染速度極為迅速，最終導致整株麥冬死亡，田間染病率可達40%，嚴重時可以高達70%及以上，其田間病害性狀接近于麥冬黑斑病，但相關浙麥冬黑斑病病原菌及其防治的研究尚未見報道。因此，明確浙麥冬黑斑病的病原菌，建立有效防控技術，大大降低浙麥冬中黑斑病的發(fā)病率，對于浙麥冬產增產提質至關重要。

本研究對采集自慈溪浙麥冬種植基地的黑斑病病株進行病原菌分離、純化以及柯赫法則驗證，并利用形態(tài)學觀察和分子序列比對明確其分類地位，進一步利用本實驗室具有自主知識產權的淀粉酶產色鏈霉菌1628代謝產物研究其對浙麥冬黑斑病的室內和田間防效，為浙江省慈溪市浙麥冬黑斑病的有效防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 黑斑病病原菌來自于2018—2019年5—7月從浙江省慈溪市麥冬種植區(qū)采集具有典型黑斑病癥的麥冬病株；盆栽健康麥冬由浙江麥冬種植基地提供。淀粉酶產色鏈霉菌1628: 由浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar, PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL；淀粉酶產色鏈霉菌1628發(fā)酵培養(yǎng)基（TPM）：可溶性淀粉2%，CaCO30.5%，KH2PO40.3%，NH4Cl 0.3%，F(xiàn)eCl20.1%，黃豆粉4.3%。

1.1.3 試劑與儀器 DNA提取試劑盒、EXTaq聚合酶、DNA marker（上海生工生物工程（上海）股份有限公司）；CTAB提取液（北京索萊寶科技有限公司）；無水乙醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；PCR儀，Sub-Cell GT核酸電泳儀，Gel Doc XR凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；YS顯微鏡（日本尼康公司）；MP Fast-prep-24均質儀（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司）；Nanodrop2000蛋白核酸定量分析儀（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原真菌分離純化 通過平板分離方法對病原菌進行分離純化。用75%酒精棉球對浙麥冬帶病組織進行擦拭，將患病組織處切成1.0 cm×1.0 cm的小塊組織，浸泡于75%酒精中30 s，用1% NaClO表面消毒4 min，再用75 %的酒精清洗30 s除去表面殘留的NaClO，無菌水漂洗3次，將組織水分吸干后置于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d左右長出單菌落，挑取單菌落接種于新的PDA培養(yǎng)基上純化，于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫黑暗培養(yǎng)7～14 d后, 觀察菌落形態(tài)和色素的產生情況等，最后將純化菌的孢子用25%的甘油保存于-80 ℃冰箱備用[9]。

1.2.2 致病性測定 試驗利用柯赫法則[10]對浙麥冬黑斑病病株上分離到的病原真菌進行致病性測定。將分離純化后的病原真菌接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，用無菌水沖洗菌落表面，稀釋后制得濃度為1×106孢子/mL的孢子懸浮液。采用噴霧法進行接種，用金剛砂對健康植株葉片的表面進行摩擦，將孢子懸浮液噴灑在摩擦過的葉片上，用塑料膜將其罩住保濕48 h，無菌水作為對照。該試驗在26 ℃、光照時間12L:12D、相對濕度60%的人工氣候室中培養(yǎng)，每組設置3組重復。15 d后觀察并記錄噴霧孢子懸浮液與無菌水的植株染病及對比情況，并分離病變組織，病變組織分離步驟同1.2.1。對該組織進行鑒定比對是否與原始病原菌相同。

1.2.3 形態(tài)學鑒定 將純化后的病原菌接種于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d。觀察其菌落生長速率、形態(tài)和顏色等。孢子形態(tài)觀察：用無菌水將孢子沖洗過濾后取20 μL于玻片上在400倍顯微鏡下觀察，記錄孢子形態(tài)大小、有無橫隔縱膈等。產孢鏈觀察：將PDA平板直接置于200倍顯微鏡下觀察其產孢鏈[11-13]。

1.2.4 病原真菌分子生物學鑒定 病原真菌DNA的提?。翰捎肅ATB法進行DNA的提取[14]，并使用基因EF-1α、RPB2、Alt a 1、His 3、ATP和ITS的引物（表1），擴增相應基因序列片段[15,16]。PCR反應總體積為 50 μL，ExTaq25 μL，上下游引物各 1.5 μL，DNA 模板 0.5 μL，ddH2O 21.5 μL。PCR 反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，51 ℃～62 ℃退火溫度30 s，72 ℃延伸45 s，共34個循環(huán)，最終72 ℃延伸10 min。將PCR產物送至杭州有康生物有限公司進行測序，所獲序列在NCBI上進行BLAST序列比對分析，通過MEGA X鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建發(fā)育樹。

表1 本試驗中所用的引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.5 淀粉酶產色鏈霉菌 1628代謝產物對麥冬黑斑病的室內防效測定 淀粉酶產色鏈霉菌 1628于TPM培養(yǎng)基中發(fā)酵7 d制備其代謝產物溶液[17-19]。菌絲生長抑制測定：將淀粉酶產色鏈霉菌1628代謝產物按體積比稀釋成不同的濃度梯度（10%、1%、0.33%），用0.22 μm過濾器過濾后取2 mL加入到18 mL的PDA培養(yǎng)基中，將其混勻后倒平板。將直徑為5 mm的浙麥冬黑斑病病原菌菌餅置于PDA平板中央，28 ℃培養(yǎng)5 d，用無菌水作為陰性對照，5%多菌靈作為陽性對照，每組3皿，試驗重復3次。5 d后采用十字交叉法測定平板上菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－5）×100。

1.2.6 淀粉酶產色鏈霉菌1628代謝產物對浙麥冬黑斑病田間防效測定 試驗用田面積約為16 m2。于2019年9月采集浙江省慈溪市麥冬種植基地的一年生健康麥冬植株，采集當天帶回實驗室進行栽培。2020年5月麥冬進入發(fā)病期，對病情進行記錄并統(tǒng)計數據。將體積比為100%的淀粉酶產色鏈霉菌（1區(qū)）1628代謝產物和6.25%的淀粉酶產色鏈霉菌1628代謝產物（2區(qū)）作為生物防治藥劑于浙麥冬黑斑病高發(fā)期進行田間防效測定，并用清水作為陰性對照，50%多菌靈為陽性對照，且每塊處理田之間用陰性對照作為間隔田，以免試驗產生影響。采用手動壓力式噴霧器對整株麥冬均勻噴灑不同供試劑，噴灑量為500 kg/hm2，每個分區(qū)樣本量為30株。在7和14 d后分別調查發(fā)病情況，以每塊分區(qū)施藥前的發(fā)病情況為基礎，對病情指數進行統(tǒng)計并校正防效。將發(fā)病情況分為4級：0級，健康苗；1級，0～25%病株；2級，26%～50%病株；3級，51%～75%病株；4級，76%～100%病株[20]。病情指數=∑（各級病株數×對應各級代表數值）/（調查總株數×發(fā)病最高級的代表數值）×100；校正防效（%）=100×[1－（處理藥后病指×對照藥前病指）/（處理藥前病指×對照藥后病指）][21]。通將數據通過SPSS軟件進行單因素方差分析，采用t-test進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀描述

該病原菌主要侵害浙麥冬葉片，發(fā)病初期病葉表面出現(xiàn)少量棕色斑點，發(fā)病中期葉片上斑點變多并不斷擴大，后期染病部位從初期的棕色斑點變成不規(guī)則的形狀，呈凹陷的紅褐色病斑擴散至整株麥冬葉片，尖端葉片枯黃（圖1A），最終導致葉片枯死進而引起整株麥冬死亡。根據發(fā)病特征將其鑒定為黑斑病[22]。

2.2 浙麥冬黑斑病病原真菌的致病性測定

對分離自浙麥冬上黑斑病的病原真菌（編號MD-1）進行致病性測定。7 d左右觀察到初始發(fā)病癥狀與田間病原菌感染植株一致，葉片上出現(xiàn)少量棕色斑點，一周之后葉片上斑塊不斷擴大呈現(xiàn)紅褐色凹陷的不規(guī)則形狀，從葉片尖端逐漸擴散至根部（圖1B，C）。從病株葉片感染處重新采集病原組織后再次分離純化后得到的菌株與原始病原菌MD-1形態(tài)一致，說明經柯赫氏法則驗證MD-1為引起浙麥冬黑斑病的病原菌。

圖1 浙麥冬黑斑病的病害特征及致病性測定Fig.1 Disease characteristics and the pathogenicity assay of black spot in O.japonicas

2.3 浙麥冬黑斑病病原菌形態(tài)學鑒定

病原菌MD-1在PDA平板上呈放射狀生長，初期菌絲呈現(xiàn)淺灰色，菌落逐漸向四周擴散，平板中心呈深灰色，周圍由淺灰至白色散開，菌絲呈棉絮狀覆蓋在表面，平板背面顏色呈現(xiàn)黑色，周圍一圈呈現(xiàn)灰白色，在28 ℃下培養(yǎng)14 d菌落直徑為7.5 cm（圖2A）。顯微鏡下單個孢子呈倒棒狀或梨形，具有3～8個橫隔，1～4個縱隔；孢子大小約為（17.0～81.0）μm×（8.0～23.5）μm，部分孢子頂部含有假喙，大小約為（0～23.5）μm×（2.5～9.0）μm（圖 2B，C）。菌絲有隔、細長型（圖 2D，E），初步鑒定該病原真菌為鏈格孢菌A.alternata。

圖2 MD-1菌落與孢子形態(tài)學觀察Fig.2 The morphology of MD-1 colony and conidiospore

2.4 病原菌分子生物學鑒定

用特異性引物對病原菌MD-1進行分子鑒定，6個基因部分序列片段的電泳圖如圖3所示。將序列在NCBI上進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)ITS序列與Genbank中鏈格孢菌（登錄號：MN245900.1）同源性為100%；ALT a1序列與Genbank中鏈格孢菌（登錄號：MN304714.1）同源性為100%；RPB2與Genbank中鏈格孢菌（登錄號：DQ677980.1）同源性為99.91%；TEF-1α與Genbank中鏈格孢菌（登錄號：MK637432.1）同源性為100%；ATPase序列與Genbank中鏈格孢菌（登錄號：MW541763.1）同源性為99.83%；His 3序列與Genbank中鏈格孢菌（登錄號：MK460236.1）同源性為99.77%；結合形態(tài)學鑒定結果，確定該病原菌為鏈格孢菌A.alternata（圖 4），并將序列上傳至 NCBI獲得登錄號 ITS（MW989987）、ALT a1（MW995953）、RPB2（MW995956）、TEF-1α（MW995955）、ATPase（MW995957）、His 3（MW995954）。

圖3 ITS、ALT a1、RPB2、TEF-1α、ATPase和His 3 PCR擴增產物的電泳分析圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification products of ITS, ALT a1, RPB2, TEF-1α, ATPase and His 3 sequences

圖4 基于ITS、ALT a1、RPB2、TEF-1α、ATPase和His 3序列構建MD-1相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of MD-1 based on ITS、ALT a1、RPB2、TEF-1α, ATPase and His 3 sequences

2.5 淀粉酶產色鏈霉菌1628代謝產物對浙麥冬黑斑病菌抑制作用

菌絲生長抑制試驗結果表明，淀粉酶產色鏈霉菌 1628代謝產物對浙麥冬黑斑病病原菌菌絲生長具有較好的抑制作用。其中10%的淀粉酶產色鏈霉菌1628代謝產物對黑斑病病原菌菌絲生長抑制率高達98%。根據毒理學回歸方程可得，當代謝產物濃度為0.764%時，其對菌絲的抑制效果仍達到50%（表2）。0.33%淀粉酶產色鏈霉菌1628代謝產物對浙麥冬黑斑病菌的抑制效果顯著高于5%的多菌靈。

表2 淀粉酶產色鏈霉菌1628代謝產物對浙麥冬黑斑病病原菌菌絲生長的影響Table 2 Effects of Streptomyces diastatochromogenes 1628 metabolites on mycelial growth of the pathogen of O.japonicus black spot

2.6 田間防效測定結果

田間防效測定結果顯示，100%的淀粉酶產色鏈霉菌1628代謝產物對浙麥冬黑斑病具有較好的防治效果，7 d時校正防效可達74.08%，其防效高于50%濃度的淀粉酶產色鏈霉菌1628代謝產物；且50%的1628代謝產物和50%的多菌靈對浙麥冬黑斑病的田間防效無顯著性差異。試驗結果表明，7和14 d對于不同濃度的 1628代謝產物對病原菌防治效果都較為穩(wěn)定，不同時間的防治效果在大多數情況下無顯著性差異。且14 d時多菌靈對浙麥冬黑斑病的防治效果相較于7 d時的防治效果顯著下降，由此表明，1628代謝產物對病原菌能持續(xù)穩(wěn)定地抑制（表3）。

表3 供試殺菌劑對浙麥冬的田間防效Table 3 Control effects of fungicides on the O.japonicus

3 討論

浙麥冬是一種具有較高價值的藥食同源植物[23]，黑斑病作為浙麥冬上常見的病害在浙江省慈溪市麥冬種植基地發(fā)生，且其傳染速度極快，嚴重時導致浙麥冬植株死亡可達總數的70%，影響浙麥冬的生長和產出。因此，明確鑒定浙麥冬黑斑病病原菌，并且找到有效安全的防治手段成為當前的主要任務。本文首先通過孢子與菌絲的形態(tài)初步鑒定出引起浙麥冬黑斑病的病原菌為鏈格孢屬。由于鏈格孢菌形態(tài)較為多樣復雜，在不同溫度、光照等條件下其孢子形狀大小、假喙、分隔數等也具有較大差異，給鏈格孢菌種的鑒定帶來很大困難[24]。單純使用真菌分類中的標記序列ITS無法對浙麥冬黑斑病病原真菌進行準確的種屬鑒定。因此，利用TEF-1α、RPB2、Alt a1、His 3、ATP和ITS六個最為常見的鏈格孢菌特異性引物進行擴增，對鏈格孢小孢子種進行分類鑒定，從而更加準確地鑒定。對序列分析后鑒定出浙麥冬黑斑病病害的病原菌為鏈格孢菌。

目前，對于浙麥冬黑斑病有效的生物防治手段相對較少，化學防治作為主要的手段，容易導致吡蟲啉、啶蟲脒、福美雙等化學農藥濫用、病原菌產生抗藥性等問題，不僅無法對病害進行有效防治還使得浙麥冬中農藥殘留超標，嚴重影響人們生命健康與安全。生物防治手段通過微生物及其代謝產物對病害進行防治，其毒性相對較低、對環(huán)境污染、殘留較少，在植物病害防治中具有較為廣闊的應用前景。本實驗中的淀粉酶產色鏈霉菌 1628是一種效果較高的拮抗菌，其代謝產物主要包括核苷類抗生素和多烯大環(huán)內酯類抗生素。對于鏈格孢菌、鐮刀菌等多種病原菌都具有較好的抑制作用[25]。通過菌絲生長速率法與田間防效測定結果顯示，淀粉酶產色鏈霉菌1628代謝產物對浙麥冬黑斑病病原菌具有較好的抑制作用，100%的代謝產物對病原菌菌絲的抑制率高達近100%。根據校正防效數據顯示，在14 d時100%和50%的淀粉酶產色鏈霉菌1628的校正防效分別為65.28%和59.62%，而50%的多菌靈在14 d的校正防效為51.28%，相較于多菌靈具有較強持久的抑制效果。在后續(xù)田間防效試驗結果中顯示，淀粉酶產色鏈霉菌 1628代謝產物相較于多菌靈對浙麥冬黑斑病的防治效果更好更穩(wěn)定。因此，淀粉酶產色鏈霉菌 1628代謝產物可以作為浙麥冬黑斑病較好的生物防治劑。

相關浙麥冬黑斑病病原菌的研究報道較少，本論文開展浙麥冬黑斑病病原菌分離鑒定研究，并為后續(xù)該病害的生物防治提供依據。從而為浙江慈溪浙麥冬種植基地常發(fā)的黑斑病更有效生物防治與低殘留、優(yōu)生態(tài)提供依據，保障浙麥冬產量和質量。