褐飛虱clip絲氨酸蛋白酶基因NlCSP4的克隆及功能分析

鄔 偉，程依情，王正亮，俞曉平

（中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018）

Clip絲氨酸蛋白酶（clip-domain serine protease，CSP）是廣泛存在于昆蟲等節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)的一類結(jié)構(gòu)保守、功能多樣的蛋白質(zhì)水解酶類[1]。CSP蛋白質(zhì)序列一級(jí)結(jié)構(gòu)的N-末端和C-末端分別存在clip結(jié)構(gòu)域（至少1個(gè)）和催化結(jié)構(gòu)域，其中clip結(jié)構(gòu)域一般由30～60個(gè)氨基酸殘基組成，含有6個(gè)保守的Cys殘基，并形成3對(duì)二硫鍵以維持空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；催化結(jié)構(gòu)域含有特異性保守的His-Asp-Ser催化三聯(lián)體，并分別存在于TAAHC、DIAL和GDSGG三個(gè)保守基序中，其發(fā)生缺失或突變會(huì)嚴(yán)重影響酶的催化活性[2]。研究表明，CSP在胞內(nèi)一般以無活性的酶原形式存在，需要在特定位點(diǎn)經(jīng)蛋白酶剪切后才具有活性，活化后的CSP可通過介導(dǎo)蛋白酶水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)來精密調(diào)控昆蟲胚胎發(fā)育、蛻皮生長(zhǎng)和免疫防御等諸多生理過程[3-6]。

節(jié)肢動(dòng)物CSP首次在中國(guó)鱟Tachypleus tridentatus的血淋巴中被發(fā)現(xiàn)[7]，之后陸續(xù)在各種昆蟲體內(nèi)被檢測(cè)到[7-11]。迄今為止，已在家蠶Bombyx mori[12]、煙草天蛾Manduca sexta[13]、黑腹果蠅Drosophila melanogaster[14]和意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica[15]等昆蟲全基因中分離鑒定到百余種CSP，如在煙草天蛾和黑腹果蠅體內(nèi)分別鑒定到42和37個(gè)CSP[13,14]。當(dāng)前，關(guān)于CSP的生物學(xué)功能研究主要集中于果蠅和家蠶等模式昆蟲中。研究顯示，不同于通過對(duì)食物蛋白的酶解消化而參與昆蟲營(yíng)養(yǎng)代謝的絲氨酸蛋白酶，CSP主要通過對(duì)蛋白酶原的激活或抑制等信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞方式來調(diào)節(jié)昆蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和免疫等生理過程[16-18]。Liu等[12,19]通過全序列比對(duì)的方法從家蠶全基因組中分離鑒定了26個(gè)CSP編碼基因，定量表達(dá)分析顯示CSP具有明顯的時(shí)空表達(dá)特異性，且其中5個(gè)CSP的表達(dá)水平受到病原微生物的顯著誘導(dǎo)，通過RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)敲低其中一個(gè)CSP編碼基因（BmSP95）可導(dǎo)致家蠶幼蟲化蛹周期顯著延長(zhǎng)。Sousa等[20]從岡比亞按蚊Anopheles gambiae體內(nèi)成功克隆到一個(gè)絲氨酸蛋白酶基因，序列分析顯示其隸屬CSP，功能分析表明其可通過調(diào)控蚊蟲血淋巴的黑化反應(yīng)來免疫防御外來病原微生物（如大腸桿菌和瘧原蟲）的入侵。近年來，關(guān)于CSP參與昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育和免疫防御的研究在一些重要農(nóng)業(yè)害蟲，如西花薊馬Frankliniella occidentalis[21]、煙粉虱Bemisia tabaci[22]、桃蚜Myzus persicae[23]和煙草甲Lasioderma serricorne[5,24]中也取得了一定的進(jìn)展。如煙草甲CSP基因LsCLIP3受20-羥基蛻皮激素和肽聚糖誘導(dǎo)表達(dá)，基因RNAi敲低導(dǎo)致煙草甲成蟲羽化率顯著降低，且幼蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)含量明顯下降，同時(shí)對(duì)病原細(xì)菌敏感性顯著提高[5]。

褐飛虱Nilaparvata lugensSt?l屬半翅目Hemiptera飛虱科Delphacidae，是我國(guó)水稻上的一種隨季風(fēng)遷移、r-對(duì)策型的單食性害蟲，通過刺吸水稻韌皮部汁液、產(chǎn)卵和傳播病毒病等方式產(chǎn)生為害，嚴(yán)重影響水稻質(zhì)量和產(chǎn)量[25]。鑒于CSP在昆蟲生長(zhǎng)、發(fā)育和免疫等諸多生理過程中的重要功能，褐飛虱CSP基因極有可能成為防治褐飛虱的理想靶標(biāo)。為此，本研究克隆鑒定了一個(gè)褐飛虱 CSP編碼基因NlCSP4，通過qRT-PCR技術(shù)分析了其時(shí)空表達(dá)規(guī)律以及病原微生物誘導(dǎo)表達(dá)模式，并利用RNAi技術(shù)探明了其在褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育和免疫防御過程中的生物學(xué)功能，以期為開發(fā)基于CSP的褐飛虱防治新技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx、植物和病原微生物

供試褐飛虱種群在人工氣候室內(nèi)以TN1水稻苗飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為：溫度（24±1）℃、光周期為16L∶8D、相對(duì)濕度為70%±5%。TN1水稻種植條件同褐飛虱飼養(yǎng)條件，待分蘗期后用于試驗(yàn)。大腸桿菌Escherichia coli菌株ATCC35150和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus菌株CMCC26003保存于LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)傳代；金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae菌株Ma456保存于PDA斜面培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)傳代。

1.2 褐飛虱RNA提取及cDNA合成

根據(jù)MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒說明書提取褐飛虱總RNA，利用微量分光光度計(jì)NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific，美國(guó)）和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度。以檢測(cè)合格后的RNA為模板，使用PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，日本）試劑盒參照說明書合成第一鏈cDNA，并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 NlCSP4基因克隆及序列分析

基于課題組測(cè)得的褐飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合褐飛虱全基因組信息[26]，獲得一條編碼褐飛虱CSP的全長(zhǎng)cDNA序列NlCSP4。為進(jìn)行克隆驗(yàn)證，采用Primer Premier 5設(shè)計(jì)2對(duì)PCR引物（表1）分別擴(kuò)增NlCSP4序列的5′端和3′端，再拼接獲得全長(zhǎng)cDNA序列。PCR擴(kuò)增以1.2節(jié)所得褐飛虱cDNA為模板，反應(yīng)體系為50 μL，包含10×Ex Taq buffer（Mg2+plus）5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，cDNA模板 2 μL，Ex Taq酶 0.5 μL 和 ddH2O 36.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸2.0 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物，目標(biāo)條帶經(jīng)割膠回收后連接至pMD18-T克隆載體（TaKaRa，日本），并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Escherichia coli感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。經(jīng)涂布和挑斑檢測(cè)后，將陽性轉(zhuǎn)化子送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，序列確認(rèn)無誤后進(jìn)行后續(xù)分析試驗(yàn)。

利用NCBI在線程序ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè)NlCSP4基因的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），并翻譯獲得蛋白質(zhì)序列；使用 ExPASy網(wǎng)站 Compute pI/Mw tool（https://web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量大小及等電點(diǎn)；通過SMART server（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析編碼蛋白序列中的保守結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用 SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列；利用BLASTP（http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）搜索比對(duì)其他昆蟲CSP同源序列，并通過MEGA X軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建[27]。

1.4 NlCSP4基因表達(dá)模式分析

利用SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒（TaKaRa，日本）對(duì)NlCSP4基因在褐飛虱不同發(fā)育階段、不同組織以及不同病原微生物誘導(dǎo)條件下的表達(dá)模式進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，以褐飛虱18S rRNA作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。分別收集褐飛虱卵、蛻皮24 h后的1～5齡若蟲、羽化后24 h的雌、雄成蟲以及雌成蟲的脂肪體、腸道和卵巢3種不同組織樣品，各樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)；將以PBS配制的濃度為1×107個(gè)/mL的病原細(xì)菌（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）菌體懸液和病原真菌（金龜子綠僵菌）分生孢子懸液，以及相同體積（10 nL）的PBS溶液用顯微注射儀分別注射接種褐飛虱5齡若蟲3個(gè)不同批次，分別收集接種后0 h、12 h、24 h、36 h、48h、60 h和72 h的七組褐飛虱活體。各收集樣品按1.2節(jié)所述方法進(jìn)行RNA提取和cDNA合成。qRT-PCR體系為20 μL，包含 2×SYBR?Premix Ex TaqTMII 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL（表1），適量稀釋的cDNA 2 μL和ddH2O 6 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。NlCSP4基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算[28]。

1.5 基于RNAi的NlCSP4基因功能分析

基于NlCSP4和綠色熒光蛋白GFP（對(duì)照）基因的cDNA序列，通過E-RNAi在線網(wǎng)站（https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/idseq.php）設(shè)計(jì)dsRNA合成引物（表1）。參照 T7 RiboMAXTMExpress RNAi System（Promega，美國(guó)）試劑盒說明書分別合成dsNlCSP4和dsGFP，并用NanoDrop ND-2000和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。

表1 本研究所用引物序列信息Table 1 Primers used in this study

以褐飛虱5齡若蟲為試蟲，在體視顯微鏡下用顯微注射儀于中足和后足基節(jié)之間胸部注射dsRNA，注射劑量為50 ng/頭。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40頭試蟲。平行設(shè)置四組實(shí)驗(yàn)：第一組用于測(cè)定RNAi干擾效率，分別收集dsNlCSP4和dsGFP注射后2 d、4 d、6 d和8 d的褐飛虱活體，按1.2節(jié)所述方法進(jìn)行RNA提取和cDNA合成，按1.4節(jié)所述qRT-PCR方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)NlCSP4的表達(dá)水平；第二組用于檢測(cè)RNAi對(duì)褐飛虱存活率的影響，連續(xù)10 d定時(shí)統(tǒng)計(jì)dsNlCSP4和dsGFP注射后褐飛虱的存活率；第三組用于評(píng)估NlCSP4在褐飛虱免疫防御病原真菌過程中的作用，在dsNlCSP4和dsGFP注射褐飛虱試蟲后，以噴霧法分別接種1 mL濃度為1×108個(gè)/mL的金龜子綠僵菌分生孢子懸液（0.02% Tween 80水溶液配置），置于人工氣候室中飼養(yǎng)10 d，逐日定時(shí)觀察記錄死亡數(shù)，并將蟲尸移出保濕培養(yǎng)，以確認(rèn)是否為真菌感染致死。以噴霧0.02% Tween 80的處理作為空白對(duì)照。第四組用于檢測(cè)dsRNA和病原真菌聯(lián)合處理后NlCSP4的表達(dá)動(dòng)態(tài)，褐飛虱處理方案與第三組試驗(yàn)相同，并于處理后2 d、4 d、6 d和8 d收集褐飛虱活體，分別按1.2節(jié)和1.4節(jié)所述方法進(jìn)行cDNA合成和qRT-PCR檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用 DPS軟件分析與處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[29]。利用單因素方差分析（one-way ANOVA）及 Tukey’s HSD（Tukey’s honestly significant difference）法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，差異顯著性水平為P＜0.05。利用Graphpad Prism 7.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NlCSP4基因的克隆及序列特征

基于褐飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和褐飛虱全基因組序列信息獲得NlCSP4基因全長(zhǎng)cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：OK018340），并進(jìn)行克隆和測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果表明，NlCSP4的ORF全長(zhǎng)1 911 bp，編碼636個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量大小為69.29 kD，等電點(diǎn)9.02。信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明NlCSP4蛋白包含一個(gè)長(zhǎng)度為25個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽。SMART預(yù)測(cè)顯示NlCSP4氨基酸序列在N-末端第274～317位氨基酸殘基之間含有一個(gè)CSP特有的Clip結(jié)構(gòu)域，在C-末端第391～630位氨基酸殘基之間含有一個(gè)trypsin-like serine protease（tryp_spc）催化結(jié)構(gòu)域。其中Clip結(jié)構(gòu)域中含有可形成3對(duì)二硫鍵的6個(gè)保守Cys殘基，催化結(jié)構(gòu)域含有保守的催化三聯(lián)體活性位點(diǎn)（His436、Asp491和Ser587）（圖1）。

圖1 褐飛虱NlCSP4基因cDNA序列及其編碼氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence and the encoded amino acid sequence of NlCSP4 of Nilaparvata lugens

2.2 NlCSP4蛋白的序列比對(duì)及進(jìn)化樹

BLAST比對(duì)結(jié)果表明，NlCSP4氨基酸序列與褐飛虱全基因組中預(yù)測(cè)的兩種CSP家族蛋白（GenBank登錄號(hào)分別為AGK40916和XP_039283318）氨基酸序列同源性最高（＞90%）。與其他昆蟲CSP相比，序列相似性最高的為草翅葉蟬Homalodisca vitripennisCSP（GenBank登錄號(hào)： KAG8310468），其次為溫帶臭蟲Cimex lectulariusCSP（GenBank登錄號(hào)：XP_014241309），兩者氨基酸序列一致性為分別為67.73%和66.18%。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，NlCSP4與所有其他同屬半翅目昆蟲的CSP在NJ樹上聚為一支，并與蜚蠊目昆蟲CSP互為姐妹群，而與鞘翅目和鱗翅目昆蟲CSP親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖2）。

圖2 基于褐飛虱NlCSP4和其他昆蟲CSP氨基酸序列采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（1000次重復(fù)）Fig.2 Phylogenetic tree of NlCSP4 and other insect CSPs based on amino acid sequences by neighbor-joining method (1000 replicates)

2.3 NlCSP4基因時(shí)空表達(dá)特征

qRT-PCR結(jié)果顯示，NlCSP4基因在褐飛虱不同發(fā)育階段均有表達(dá)。雌成蟲中NlCSP4的表達(dá)量最高，分別是卵、3齡若蟲和雄成蟲表達(dá)量的9.0、2.2和2.8倍。在若蟲期，NlCSP4的表達(dá)量隨蟲齡的增長(zhǎng)而逐步上調(diào)，如其在5齡若蟲中的表達(dá)量較1齡和3齡若蟲分別增加了4.8和1.8倍，均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）（圖3A）。NlCSP4基因在羽化后24 h的雌成蟲脂肪體、腸道和卵巢組織中均有不同程度表達(dá)，且在脂肪體中表達(dá)量最高，分別是腸道和卵巢組織中表達(dá)量的2.1和9.5倍（圖3B）。

圖3 NlCSP4在褐飛虱不同發(fā)育時(shí)期（A）和雌成蟲不同組織（B）中的表達(dá)模式Fig.3 Expression profiles of NlCSP4 during different developmental stages (A) and different tissues of the female adults (B) of Nilaparvata lugens

2.4 NlCSP4基因微生物誘導(dǎo)表達(dá)模式

褐飛虱5齡若蟲NlCSP4基因在不同微生物誘導(dǎo)條件下的表達(dá)模式如圖4所示。與對(duì)照組（注射PBS水溶液）相比，大腸桿菌誘導(dǎo)72 h內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)NlCSP4表達(dá)量除在48 h和60 h時(shí)呈現(xiàn)小幅上調(diào)并達(dá)到顯著水平外，其余均無顯著差異（P＞0.05）。然而，金黃色葡萄菌和金龜子綠僵菌可顯著誘導(dǎo)NlCSP4的表達(dá)，且以金龜子綠僵菌尤為突出。在金黃色葡萄菌和金龜子綠僵菌刺激12 h后，NlCSP4表達(dá)量較對(duì)照分別上調(diào)了1.7和12.4倍。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，NlCSP4表達(dá)量進(jìn)一步顯著上調(diào)，且在金黃色葡萄菌誘導(dǎo)60 h和金龜子綠僵菌刺激48 h時(shí)達(dá)到頂峰。如金龜子綠僵菌誘導(dǎo)48 h后，NlCSP4表達(dá)量分別是誘導(dǎo)24 h和72 h的2.9和2.0倍。

圖4 褐飛虱5齡若蟲NlCSP4的微生物誘導(dǎo)表達(dá)模式Fig.4 Expression pattern of NlCSP4 in the fifth instar nymphs of Nilaparvata lugens after microbial infection

2.5 RNAi對(duì)NlCSP4的干擾效率

通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)RNAi對(duì)褐飛虱5齡若蟲體內(nèi)NlCSP4的干擾效率，結(jié)果表明，與對(duì)照組（注射dsGFP）相比，顯微注射dsNlCSP4不同時(shí)間點(diǎn)后NlCSP4的表達(dá)量均呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢(shì)。如圖5所示，顯微注射NlCSP4的dsRNA 2 d、4 d、6 d和8 d后，NlCSP4的表達(dá)量水平較對(duì)照組分別下降了83.9%、88.6%、59.1%和44.1%，均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）?？梢?，合成的dsNlCSP4片段可有效抑制NlCSP4的表達(dá)。

圖5 RNAi后褐飛虱5齡若蟲NlCSP4的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of NlCSP4 in the fifth instar nymphs of Nilaparvata lugens after RNAi

2.6 NlCSP4干擾對(duì)褐飛虱存活率和抵御病原真菌侵染能力的影響

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，抑制NlCSP4的表達(dá)能顯著降低褐飛虱5齡若蟲的存活率，如顯微注射dsNlCSP4 8 d后，褐飛虱5齡若蟲的存活率為68.9%，顯著低于對(duì)照組（注射dsGFP）的92.7%。生物測(cè)定試驗(yàn)表明，NlCSP4干擾后褐飛虱對(duì)病原真菌侵染的抵御能力顯著下降。與對(duì)照組（注射dsGFP）相比，dsNlCSP4處理組褐飛虱在金龜子綠僵菌侵染5 d和10 d后的校正死亡率分別提高了35.1%和21.1%（圖6A）。金龜子綠僵菌對(duì)dsNlCSP4處理組褐飛虱5齡若蟲的半致死中時(shí)（LT50）為 3.9 d，顯著低于dsGFP對(duì)照組的5.4 d（圖6B）。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，對(duì)照組（注射 dsGFP）和處理組（注射dsNlCSP4）褐飛虱在金龜子綠僵菌侵染6 d內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)NlCSP4表達(dá)量均顯著上調(diào)。然而，與注射dsGFP的對(duì)照組相比，dsNlCSP4處理組各時(shí)間點(diǎn)NlCSP4表達(dá)量均受到顯著抑制，如dsNlCSP4處理組褐飛虱在金龜子綠僵菌侵染2 d和4 d后NlCSP4的表達(dá)水平較對(duì)照組（注射dsGFP）下降程度均超過80%，與2.5節(jié)中NlCSP4干擾效率檢測(cè)結(jié)果基本一致（圖6C）。

圖6 注射dsRNA和接種金龜子綠僵菌后褐飛虱5齡若蟲的存活率（A）、半致死中時(shí)（B）和NlCSP4的相對(duì)表達(dá)量（C）Fig.6 The survival rates (A), LT50 values (B) and relative expression level of NlCSP4 (C) in the fifth instar nymphs of Nilaparvata lugens after dsRNA injection and M.anisopliae infection

3 討論

作為絲氨酸蛋白酶超家族中的重要成員，clip絲氨酸蛋白酶在昆蟲生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和免疫等生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，是進(jìn)行害蟲防治的有效潛在靶標(biāo)[3-6]。隨著組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，大量的昆蟲clip絲氨酸蛋白酶基因已被成功檢測(cè)和鑒定[11-15]?；诤诛w虱基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，Bao等[30]從褐飛虱基因組中預(yù)測(cè)到12種clip絲氨酸蛋白酶的完整或部分基因編碼信息，并分析了其中6種clip絲氨酸蛋白酶基因的在褐飛虱不同發(fā)育階段和不同組織部位的表達(dá)規(guī)律。本研究在此基礎(chǔ)上，成功克隆和鑒定了NlCSP4基因的全長(zhǎng)cDNA序列，分析了其時(shí)空表達(dá)規(guī)律和微生物誘導(dǎo)表達(dá)特征，并初步研究了其在褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育和免疫防御過程中的作用。

氨基酸序列分析表明NlCSP4具有clip絲氨酸蛋白酶的典型特征，即蛋白質(zhì)N端和C端分別存在一個(gè)保守的clip結(jié)構(gòu)域和Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域。多序列比對(duì)顯示，與已經(jīng)鑒定的其它昆蟲clip絲氨酸蛋白酶一樣，NlCSP4的clip結(jié)構(gòu)域中含有可組成三對(duì)二硫鍵的6個(gè)Cys殘基，且Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域中亦具有特異性保守的由His、Asp、Ser殘基組成的催化中心三元件。目前研究顯示，絲氨酸蛋白酶類分子為分泌型蛋白，其N端一般存在信號(hào)肽或透膜區(qū)，如家蠶中所有檢測(cè)到的26個(gè)clip絲氨酸蛋白酶均含有信號(hào)肽，黑腹果蠅中2個(gè)clip絲氨酸蛋白酶則以透膜區(qū)代替信號(hào)肽行使分泌功能[9,14]。與上述研究結(jié)果類似，SignalP預(yù)測(cè)顯示NlCSP4在蛋白質(zhì)N端（第1～25位氨基酸殘基）亦存在信號(hào)肽序列，表明NlCSP4極可能以分泌型蛋白酶形式發(fā)揮功能。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，昆蟲CSP蛋白在進(jìn)化上相對(duì)保守，NlCSP4與同屬半翅目昆蟲的CSP蛋白在NJ進(jìn)化樹上聚為一支，暗示它們可能具有相似的生物學(xué)功能。

qRT-PCR分析結(jié)果顯示，褐飛虱NlCSP4基因具有明顯的時(shí)空表達(dá)特異性。與褐飛虱中另一個(gè)CSP編碼基因Snake4在5齡若蟲期高表達(dá)的結(jié)果類似，NlCSP4表達(dá)量在從卵到5齡若蟲發(fā)育過程中逐步上升，表明其在褐飛虱胚胎發(fā)育和若蟲生長(zhǎng)過程中發(fā)揮重要作用[31]。NlCSP4的這種齡期特異性表達(dá)模式同樣見于其它昆蟲中，如榨蠶Antheraea pernyi的CSP編碼基因ApSnake在高齡幼蟲期（4齡和5齡）表達(dá)量顯著高于卵期和1～3齡幼蟲期[32]。NlCSP4在褐飛虱脂肪體、腸道和卵巢等組織部位均有表達(dá)，但在免疫相關(guān)器官脂肪體中的表達(dá)量顯著高于消化系統(tǒng)腸道。這一表達(dá)模式與煙草甲[24]、黃粉蟲Tenebrio molitor[33]和水椰八角鐵甲Octodonta nipae[34]等昆蟲相關(guān)CSP基因表達(dá)特征研究的結(jié)果吻合，如煙草甲4個(gè)CSP編碼基因（LsCLIP1～4）均在脂肪體中呈現(xiàn)高水平表達(dá)，而在腸道組織中表達(dá)較低[24]。

不同微生物誘導(dǎo)結(jié)果顯示，NlCSP4表達(dá)水平受到金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性細(xì)菌）和金龜子綠僵菌（絲狀病原真菌）顯著誘導(dǎo)，但大腸桿菌（革蘭氏陰性細(xì)菌）短時(shí)間（36 h內(nèi)）誘導(dǎo)效果不明顯。類似現(xiàn)象同樣見于其它昆蟲CSP編碼基因的微生物誘導(dǎo)表達(dá)模式研究，如煙草天蛾MsHP8和黑腹果蠅SPE基因可被藤黃微球菌Micrococcus luteus（革蘭氏陽性細(xì)菌）和球孢白僵菌Beauveria bassiana（絲狀病原真菌）或真菌細(xì)胞壁多糖（β-1,3-葡聚糖）顯著激活，但不受革蘭氏陰性細(xì)菌誘導(dǎo)[35,36]。然而，蝶蛹金小蜂Pteromalus puparumCSP編碼基因PpcSPH1的表達(dá)水平在革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽性細(xì)菌和絲狀病原真菌誘導(dǎo)下均呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢(shì)[37]?？梢?，針對(duì)不同的入侵微生物種類，昆蟲CSP介導(dǎo)的免疫防御反應(yīng)的程度或途徑不盡相同。本研究結(jié)果表明，NlCSP4主要參與褐飛虱對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和絲狀病原真菌的免疫響應(yīng)，而在免疫防御革蘭氏陰性細(xì)菌入侵過程中的貢獻(xiàn)相對(duì)較小。

RNAi技術(shù)可高效特異的抑制靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在昆蟲基因功能解析、基因表達(dá)調(diào)控和害蟲防治等研究領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用價(jià)值[38]。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，本研究合成的NlCSP4基因dsRNA能有效干擾目標(biāo)基因的表達(dá)。NlCSP4沉默后褐飛虱5齡若蟲存活率顯著下降，證實(shí)NlCSP4參與了褐飛虱的生長(zhǎng)發(fā)育過程。Wu等[39]和Zheng等[40]應(yīng)用RNAi技術(shù)分別研究了褐飛虱CSP編碼基因NlPCE3在雌雄成蟲中的生物學(xué)功能，結(jié)果顯示沉默NlPCE3可導(dǎo)致雌雄成蟲生殖組織（卵巢和輸精管）發(fā)育嚴(yán)重受阻，雌蟲產(chǎn)卵量顯著降低。由此可見，包括NlCSP4在內(nèi)的褐飛虱CSP基因可作為應(yīng)用RNAi技術(shù)防控褐飛虱的潛在靶標(biāo)。利用昆蟲病原真菌防治褐飛虱亦是褐飛虱生物防控的一種優(yōu)選策略，其中綠僵菌已被證實(shí)在防治褐飛虱中具有極大的應(yīng)用潛能[41,42]。生物測(cè)定試驗(yàn)顯示，金龜子綠僵菌侵染與dsNlCSP4注射聯(lián)合處理能顯著提高金龜子綠僵菌對(duì)褐飛虱的致死速度，表明病原真菌侵染和靶標(biāo)基因RNAi對(duì)褐飛虱的致死作用具有協(xié)同效應(yīng)。本研究結(jié)果可為褐飛虱的防治提供新的思路，如后續(xù)可研究綠僵菌作為 dsRNA遞送載體的可行性，將RNAi和病原真菌介導(dǎo)的害蟲防治技術(shù)優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，從而顯著提高褐飛虱防控效果。