• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    稻螟赤眼蜂實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選

    2022-11-18 08:26:18王珊珊田俊策魯艷輝徐紅星王香萍呂仲賢
    關(guān)鍵詞:赤眼蜂內(nèi)參歷期

    王珊珊,田俊策*,魯艷輝,徐紅星,王香萍*,呂仲賢*

    (1.農(nóng)林病蟲(chóng)害預(yù)警與調(diào)控湖北省工程中心,長(zhǎng)江大學(xué),荊州 434025;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所/農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310021)

    稻螟赤眼蜂Trichogramma japonicum隸屬于膜翅目Hymenoptera,赤眼蜂科Trichogrammatidae[1]。稻螟赤眼蜂是稻田赤眼蜂的優(yōu)勢(shì)種群,其對(duì)稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis、二化螟Chilo suppressalis等水稻鱗翅目害蟲(chóng)具有良好的防治效果[2,3]。近年來(lái),由于二化螟等水稻鱗翅目害蟲(chóng)的抗藥性問(wèn)題日益突出以及綠色防控技術(shù)的持續(xù)推廣,淹沒(méi)式釋放稻螟赤眼蜂防治水稻鱗翅目害蟲(chóng)的應(yīng)用面積在日益增長(zhǎng)中。隨著稻螟赤眼蜂生物防治應(yīng)用的擴(kuò)大,對(duì)其繁育、滯育、農(nóng)藥抗性等分子機(jī)制方面的研究也逐漸增多。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)基因表達(dá)定量方面的研究。qRT-PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上引入熒光基團(tuán),通過(guò)相應(yīng)的熒光信號(hào)積聚實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)反應(yīng)的進(jìn)程,為未知序列進(jìn)行定量分析的方法,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[4,5]。在實(shí)際應(yīng)用中,眾多因素的不穩(wěn)定會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成直接影響,如RNA提取、cDNA合成及PCR擴(kuò)增效率等。為了降低各因素對(duì)其結(jié)果的影響,需要對(duì)靶基因的結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,而內(nèi)參基因是校正樣本間的差異、對(duì)靶基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理的關(guān)鍵因素。同時(shí),為減少樣品之間和樣品內(nèi)部的誤差,常用表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化,因此選擇合適的內(nèi)參基因?qū)ζ浣Y(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要[6-8]。常用于定量試驗(yàn)的內(nèi)參基因有肌動(dòng)蛋白基因(Actin)、多聚泛素酶基因(Ubiquitin,UBQ)、微管蛋白基因(Tubulin,TUB)、轉(zhuǎn)錄延伸因子(EF1a)和泛素結(jié)合酶基因(Ubiquitin-conjugating enzyme,UBC)等管家基因[9]。研究表明,內(nèi)參基因不存在絕對(duì)通用性,未經(jīng)篩選的內(nèi)參基因進(jìn)行校正處理可能使結(jié)果不準(zhǔn)確,甚至是錯(cuò)誤的[10]。因此,基于不同的物種、樣本材料、發(fā)育階段和試驗(yàn)條件來(lái)篩選出穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因至關(guān)重要。

    本研究共挑選了10個(gè)潛在的內(nèi)參基因,包括6種常用作為內(nèi)參基因的基因ACTR2、ARPC2、EF1a、EEF1D、HSP70和GAPDH以及從熱刺激處理稻螟赤眼蜂轉(zhuǎn)錄組中挑選的4種穩(wěn)定表達(dá)基因TMEM209、PABPC1L、SFRS7和CSNK1a1,探討其在溫度處理、食物處理、農(nóng)藥處理和不同發(fā)育歷期下供試基因的表達(dá)穩(wěn)定性,為不同試驗(yàn)條件下選擇合適的稻螟赤眼蜂內(nèi)參基因提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試?yán)ハx(chóng)

    試驗(yàn)所用米蛾Corcyra cephalonica卵飼養(yǎng)在相對(duì)濕度為75%±5%,溫度為(26±1)℃的人工氣候室。多代繁育的米蛾在60目的鐵紗網(wǎng)上產(chǎn)卵后用軟毛刷收集獲得。將當(dāng)天收集的新鮮米蛾卵粘附于有雙面膠的紙片(長(zhǎng)2 cm,寬1 cm)上制成米蛾卵卡,然后30 W紫外燈正下方30 cm處照射殺胚45 min,供繁蜂用。

    稻螟赤眼蜂為杭州蕭山稻田中采集被寄生的二化螟卵,室內(nèi)鑒定純化后,利用中間寄主米蛾卵培養(yǎng)獲得,稻螟赤眼蜂種群用已滅活的米蛾卵在人工氣候室內(nèi)(溫度25 ℃±1 ℃、相對(duì)濕度75%±5%、光周期14L∶10D)繁殖多代后用于試驗(yàn)。

    1.2 試驗(yàn)分組及處理

    1.2.1 溫度處理 將羽化4 h的成蜂分別在高溫40 ℃和低溫0 ℃下刺激1 h后,放回25 ℃培養(yǎng)箱恢復(fù)1 h后收集樣品,以一直在25 ℃培養(yǎng)箱(未受高溫低溫刺激)的稻螟赤眼蜂成蜂為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次,以300頭稻螟赤眼蜂為1個(gè)重復(fù)。取樣后,液氮冷凍處理,-80 ℃保存直至RNA提取。

    1.2.2 取食處理 將羽化4 h的成蜂分為3個(gè)處理,處理1不喂食任何食物作為對(duì)照,處理2提供清水,處理3提供10%的蔗糖水。任其取食4 h后,收集樣品。每個(gè)處理重復(fù)3次,以300頭稻螟赤眼蜂為1個(gè)重復(fù)。取樣后,液氮冷凍處理,-80 ℃保存直至RNA提取。

    1.2.3 不同農(nóng)藥處理 選擇 2種稻田常用的防治褐飛虱的農(nóng)藥吡蟲(chóng)啉和吡蚜酮,將原藥溶于丙酮,以1 mg/mL的濃度制備藥膜管。將羽化4 h的成蜂引入藥膜管中刺激1 h,放回培養(yǎng)箱恢復(fù)1 h后收集樣品,以丙酮藥膜管為陰性對(duì)照,以未引入藥膜管的為空白對(duì)照組。每個(gè)處理重復(fù)3次,以300頭稻螟赤眼蜂為1個(gè)重復(fù)。取樣后,液氮冷凍處理,-80 ℃保存直至RNA提取。

    1.2.4 不同發(fā)育歷期樣本 分別收集寄生5 d后的蛹期寄生蜂和羽化4 h的赤眼蜂成蜂,每個(gè)蟲(chóng)態(tài)重復(fù)取樣3次,每個(gè)重復(fù)收集300頭稻螟赤眼蜂。樣品收集后,液氮冷凍處理,-80 ℃保存直至RNA提取。

    1.3 總RNA的提取與cDNA的合成

    利用TRIzol Reagent劑(北京寶盈同匯生物技術(shù)有限公司)對(duì)稻螟赤眼蜂樣品分別提取RNA,具體步驟參照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)。并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各樣品的RNA質(zhì)量,RNA電泳條帶清晰完整,說(shuō)明提取的RNA質(zhì)量較好。進(jìn)一步測(cè)得RNA OD260/OD280值,確定RNA的濃度及純度。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒,合成cDNA,操作步驟參照Thermo Fisher反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū),合成的cDNA保存在-20 ℃冰箱備用。

    1.4 qRT-PCR檢測(cè)候選內(nèi)參基因引物特異性和擴(kuò)增效率

    利用 Prime 3.0軟件設(shè)計(jì)稻螟赤眼蜂的候選基因特異性引物(表 1)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)使用Bio-Rad CFX96 real-time system,按照iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix(Bio-Rad,USA)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)體系 20 μL,包含 cDNA 1 μL、上下游引物各 1 μL、iTaq Universal SYBR Green Supermix(2×)10 μL、ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 2 min,95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s循環(huán)40次。熔解曲線:60 ℃~95 ℃,每升高0.5 ℃收集一次熒光信號(hào)。每個(gè)cDNA樣品設(shè)置2個(gè)技術(shù)重復(fù)。cDNA按5倍等比稀釋成5個(gè)不同濃度,獲得引物擴(kuò)增效率。

    1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    qRT-PCR反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)儀器自帶的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,得到各個(gè)反應(yīng)的Ct值。通過(guò)Delta-Ct、NormFinder、geNorm和BestKeeper四種方法對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。Delta-Ct是某內(nèi)參基因相對(duì)于其他各內(nèi)參基因ΔCt的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)的平均值對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行排序,顯示兩種內(nèi)參基因之間的表達(dá)差異[11]?;诨虻南鄬?duì)表達(dá)量(2-ΔCt),NormFinder是根據(jù)組內(nèi)和組間的差異對(duì)參考基因進(jìn)行排名[12]。GeNorm是對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值M值進(jìn)行分析并排序,M值越小,基因表達(dá)穩(wěn)定性越好[13]。內(nèi)參基因的最佳數(shù)量通過(guò)geNorm計(jì)算的配對(duì)變異值Vn/(n+1)確定。當(dāng)變異值<0.15時(shí),內(nèi)參基因的最佳數(shù)量為n,當(dāng)其>0.15時(shí),應(yīng)當(dāng)選n+1個(gè)內(nèi)參基因做進(jìn)一步校正。BestKeeper是通過(guò)計(jì)算各內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行排序,SD和CV越小,內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好[14]。最后通過(guò)RefFinder(http://blooge.cn/RefFinder/?type=reference)軟件對(duì)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 候選內(nèi)參基因引物特異性分析及擴(kuò)增效率檢測(cè)

    以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR分析各樣品的熔解曲線,顯示10個(gè)內(nèi)參基因均呈現(xiàn)單一的信號(hào)峰(圖1),同時(shí)將切膠回收的條帶經(jīng)測(cè)序比對(duì)后確定為靶標(biāo)基因的特異性條帶。對(duì)擴(kuò)增效率進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果顯示10個(gè)候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率在96.70%~115.10%,相關(guān)系數(shù)R2在0.991~1.000(表1)。

    表1 侯選基因引物信息Table 1 Primers for the candidate genes

    圖1 候選基因的熔解曲線Fig.1 Melting curves of the candidate genes

    2.2 候選內(nèi)參基因表達(dá)水平

    CT值是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),它能反應(yīng)內(nèi)參基因的表達(dá)水平。CT值越大,表明基因的表達(dá)量越低。10個(gè)候選內(nèi)參基因的CT值在14.65~24.02。其中PAPBC1L和EF1a的CT值顯著低于其他基因(F=306.4,P<0.001),表明該基因的表達(dá)豐富度較高;而ACTR2的CT值要顯著高于其他基因,表明該基因的表達(dá)豐富度為候選內(nèi)參基因中最低(圖2)。

    圖2 候選內(nèi)參基因的CT值Fig.2 CT value of candidate reference genes

    2.3 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

    2.3.1 溫度對(duì)稻螟赤眼蜂候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響 在不同溫度刺激下 Delta CT、NormFinder和GeNorm軟件分析均表明,基因EF1a是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因,而B(niǎo)estKeeper分析表明基因CSNK1a1是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因,ACTR2和GAPDH兩個(gè)內(nèi)參基因在各分析軟件中表達(dá)較不穩(wěn)定(圖3)。根據(jù) RefFinder綜合分析,在不同溫度刺激下,10個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性從高到低依次是EF1a>EEF1D>PABPC1L>TMEM209>SFRS7>ARPC2>CSNK1a1>HSP70>GAPDH>ACTR2(表 2)。

    表2 溫度對(duì)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的影響Table 2 Effect of temperature on the stability of candidate reference genes

    2.3.2 取食對(duì)稻螟赤眼蜂內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響 不同的取食處理下,Delta CT、BestKeeper、NormFinder和GeNorm軟件分析均表明GAPDH基因的穩(wěn)定性是最低的,其次是ACTR2基因。ARPC2基因在BestKeeper和GeNorm軟件分析中,表達(dá)最穩(wěn)定;EF1a基因在NormFinder軟件分析中,表達(dá)最穩(wěn)定。與其他分析軟件不同的是,GeNorm分析結(jié)果表明TMEM209基因的表達(dá)穩(wěn)定性最好(表3)。利用RefFinder軟件綜合分析,結(jié)果表明10個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性從高到低依次是SFRS7>ARPC2>EF1a>TMEM209>CSNK1a1>PABPC1L>EEF1D>HSP70>ACTR2>GAPDH。

    表3 取食對(duì)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of feeding on the stability of gene expression of candidate reference genes

    2.3.3 農(nóng)藥處理對(duì)稻螟赤眼蜂內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響 不同農(nóng)藥處理中,Delta CT、NormFinder軟件分析均表明PABPC1L基因表達(dá)最穩(wěn)定,ACTR2基因表達(dá)最不穩(wěn)定。BestKeeper、GeNorm軟件分析表明CSNK1a1基因表達(dá)最穩(wěn)定,GAPDH基因表達(dá)不穩(wěn)定。不同的農(nóng)藥處理下,利用RefFinder分析軟件綜合分析,發(fā)現(xiàn) 10個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性從高到低依次是PABPC1L>TMEM209>CSNK1a1>ARPC2>EEF1D>EF1a、SFRS7>HSP70>GAPDH>ACTR2。綜合分析,不同的農(nóng)藥刺激下,稻螟赤眼蜂10個(gè)候選內(nèi)參基因中表達(dá)較為穩(wěn)定的3個(gè)內(nèi)參基因分別為PABPC1L、TMEM209和CSNK1a1(表4)。

    表4 不同農(nóng)藥處理對(duì)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響Table 4 Effects of different pesticide treatments on the stability of gene expression of candidate reference genes

    2.3.4 發(fā)育歷期對(duì)稻螟赤眼蜂內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響 在蛹期和成蟲(chóng)期收集的樣品中,Delta CT和NormFinder分析軟件結(jié)果表明PABPC1L基因表達(dá)最穩(wěn)定;BestKeeper分析結(jié)果表明SFRS7基因表達(dá)最穩(wěn)定;GeNorm分析ARPC2、EEF1D基因表達(dá)最穩(wěn)定。TMEM209基因在各分析軟件結(jié)果中,基因表達(dá)穩(wěn)定性均較差。利用 RefFinder分析軟件綜合分析,10個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性從高到低依次是PABPC1L>ARPC2>ACTR2>EEF1D>HSP70>GAPDH>SFRS7>EF1a>CSNK1a1>TMEM209。綜合分析,在不同的發(fā)育歷期下,3個(gè)較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別是PABPC1L、ARPC2和ACTR2(表5)。

    表5 不同發(fā)育歷期對(duì)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響Table 5 Effects of different developmental stages on the stability of gene expression of candidate reference genes

    2.4 內(nèi)參基因配對(duì)變異值

    MIQE指南指出,至少使用兩個(gè)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的內(nèi)參基因?qū)?qRT-PCR的結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[16]。本研究利用GeNorm分析計(jì)算配對(duì)變異值Vn/(n+1)確定合適的內(nèi)參基因數(shù)量,當(dāng)變異值小于0.15時(shí),則不需要增加額外的內(nèi)參基因來(lái)提高準(zhǔn)確性[17]。在本研究四種條件下,變異值均小于0.15(圖3),這表明2個(gè)內(nèi)參基因已經(jīng)足夠保證準(zhǔn)確性。

    圖3 稻螟赤眼蜂內(nèi)參基因最優(yōu)數(shù)量分析Fig.3 Determination of the optimal number of reference genes in Trichogramma japonicum

    3 討論

    qRT-PCR技術(shù)具有高效、準(zhǔn)確、靈敏和易重復(fù)等特點(diǎn),現(xiàn)該技術(shù)已成為基因表達(dá)分析的主要技術(shù)手段之一,但是其結(jié)果的準(zhǔn)確性是基于所選的表達(dá)穩(wěn)定性較高的內(nèi)參基因,未經(jīng)驗(yàn)證而使用先前發(fā)表的內(nèi)參基因可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差[17,18]。目前隨著稻螟赤眼蜂生物防治的再次被重視,對(duì)其生物分子的研究也越來(lái)越多。本研究通過(guò)Delta-Ct、NormFinder、geNorm和BestKeeper四種方法分別對(duì)溫度處理、飼養(yǎng)條件處理、藥劑處理以及不同的發(fā)育歷期的稻螟赤眼蜂進(jìn)行候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)估。四種方法計(jì)算得出10種候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排名存在差異,最后通過(guò)RefFinder分析軟件對(duì)該結(jié)果進(jìn)行綜合排序。

    在本試驗(yàn)中,我們利用上述5種方法分別分析評(píng)估了PABPC1L、ACTR2、ARPC2、EF1a、EEF1D、SFRS7、HSP70、CSNK1a1、GAPDH和TMEM209這10種候選內(nèi)參基因在4種不同試驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性。其中ACTR2、ARPC2、EF1a、EEF1D、HSP70和GAPDH這6種基因是已經(jīng)報(bào)道在某些物種的研究中做為內(nèi)參基因使用的基因。ARPC2和ACTR2是肌動(dòng)蛋白相關(guān)復(fù)合體七個(gè)亞基其中之一[19],肌動(dòng)蛋白對(duì)于細(xì)胞的移動(dòng)和收縮有著重要作用,在肌肉運(yùn)動(dòng)中也起重要作用。ARPC2最先是在棘阿米吧中發(fā)現(xiàn),主要在組織的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞中表達(dá)[20],參與細(xì)胞內(nèi)肌肉蛋白聚合的控制,在微絲的核化中起關(guān)鍵作用[21,22]。該基因在沙漠蝗Schistocerca gregaria研究腦內(nèi)基因表達(dá)時(shí)可作為內(nèi)參基因[23],而在本研究中在不同發(fā)育歷期中表達(dá)較為穩(wěn)定。延伸因子即EF1a和EEF1D,通過(guò)催化氨?;D(zhuǎn)運(yùn)RNA的依賴型GTP結(jié)合到核糖體的受體位點(diǎn),在翻譯過(guò)程中起著重要作用[24]。EF1在很多研究中,被認(rèn)為是合適的內(nèi)參基因,如斜紋夜蛾Spodoptera litura的溫度處理樣品[25]、東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis的不同發(fā)育歷期[26]、西花薊馬Frankliniella occidentalis的不同歷期和溫度處理[27]、大螟Sesamia inferens的不同組織和不同發(fā)育歷期[28]及瓢蟲(chóng)的不同發(fā)育時(shí)期和溫度處理[29]等。如在鮭魚(yú)[30]和直翅目[31,32]研究顯示EF1表達(dá)也較穩(wěn)定。與前人報(bào)道相似,本研究顯示EF1a和EEF1D可在溫度處理時(shí)做為內(nèi)參基因。HSP基因家族是與熱激相關(guān)的蛋白,在巴氏新小綏螨Neoseiulus barkeri的研究顯示Hsp60和Hsp90在殺螨劑的刺激下是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因[33],但Hsp70并不適合做為內(nèi)參基因,該結(jié)果與本研究一致,Hsp70在供試條件下均不適合做為內(nèi)參基因。GAPDH在多個(gè)研究報(bào)道中顯示可以做為內(nèi)參基因使用,如在甜菜葉蛾Spodoptera exigua的不同發(fā)育歷期[34]、溫度脅迫下的黃翅娟野螟Diaphania caesalis[35]和不同光處理?xiàng)l件下的粘蟲(chóng)Mythimna separate[36]等。但也有不少物種與本研究的研究結(jié)果相似,GAPDH并不適合做為內(nèi)參基因,如在二化螟不同發(fā)育歷期、不同組織、溫度處理、殺蟲(chóng)劑處理、取食不同飼料、取食不同水稻和 dsRNA處理均不適合做為內(nèi)參基因[37],在蜜蜂Frieseomelitta varia和Melipona quadrifasciata不同發(fā)育歷期、性別、組織以及細(xì)菌注射和農(nóng)藥處理的條件下都不適合做為內(nèi)參基因[38]。

    雖然大部分的內(nèi)參篩選研究一般都會(huì)選擇已報(bào)道的內(nèi)參基因做為候選基因,但也有研究通過(guò)篩選未報(bào)道的候選基因篩選到了更合適的內(nèi)參基因。Xie等[39]在通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)了ZFP268可以做為螟黃赤眼蜂Trichogramma chilonis在不同食物和不同溫度處理下的內(nèi)參基因,而在此前并未有ZFP268可以做為內(nèi)參基因的報(bào)道。在本試驗(yàn)中,除了選擇了常用的看家基因作為候選內(nèi)參基因外,我們還根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)選擇了幾種在熱激條件下穩(wěn)定表達(dá)但未報(bào)道做為內(nèi)參基因的4種候選基因,包括TMEM209、PABPC1L、SFRS7和CSNK1a1,希望能從中篩選出合適的內(nèi)參基因。結(jié)果顯示,盡管CSNK1a1并不是合適的內(nèi)參基因,但PABPC1L和TMEM209是農(nóng)藥處理下表達(dá)最穩(wěn)定的基因,PABPC1L同時(shí)還是不同發(fā)育歷期中表達(dá)最穩(wěn)定的基因,而SFRS7則是取食不同食物后表達(dá)最為穩(wěn)定的基因。因此,在本次研究中我們共篩選到了3種未曾報(bào)道過(guò)的內(nèi)參基因,這也提示了我們?cè)诮窈髢?nèi)參基因的篩選中可以適當(dāng)?shù)財(cái)U(kuò)大篩選范圍,從而發(fā)現(xiàn)一些更為合適的內(nèi)參基因。

    本研究中,我們利用了5種方法評(píng)估了10個(gè)候選內(nèi)參基因在不同條件下的表達(dá)穩(wěn)定性。其中溫度處理下,EF1a基因表達(dá)最穩(wěn)定;取食條件不同時(shí),SFRS7基因表達(dá)最穩(wěn)定;而在農(nóng)藥處理和不同發(fā)育歷期時(shí),PABPC1L基因表達(dá)最為穩(wěn)定。因此,我們的試驗(yàn)表明沒(méi)有通用的穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因,不同的試驗(yàn)條件下應(yīng)該選擇適合該條件下的內(nèi)參基因。本研究結(jié)果為在不同條件下選擇稻螟赤眼蜂內(nèi)參基因提供了參考,也有利于在稻螟赤眼蜂的基因表達(dá)研究中取得更為可靠、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

    猜你喜歡
    赤眼蜂內(nèi)參歷期
    5種赤眼蜂品系對(duì)米蛾卵和梨小食心蟲(chóng)卵的選擇偏好研究
    四種赤眼蜂對(duì)槐尺蠖卵的寄生能力及適應(yīng)性
    13個(gè)新選水稻不育系播始?xì)v期配合力分析
    內(nèi)參報(bào)道如何在全媒體時(shí)代“出圈”
    應(yīng)用3種赤眼蜂防治油松毛蟲(chóng)試驗(yàn)
    辦好黨報(bào)內(nèi)參的思考與探索
    湖南省2016年審定通過(guò)的水稻新品種(下)
    湖南省2015年審定通過(guò)的水稻新品種(4)
    茶尺蠖的飼養(yǎng)溫度和發(fā)育歷期
    內(nèi)參影響力與媒體公信力
    新聞傳播(2015年10期)2015-07-18 11:05:39
    老司机靠b影院| 精品福利观看| 久久草成人影院| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 一级毛片女人18水好多| 欧美中文日本在线观看视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 嫩草影视91久久| 欧美在线黄色| 五月玫瑰六月丁香| 男女视频在线观看网站免费 | 亚洲最大成人中文| 国产爱豆传媒在线观看 | 欧美日韩福利视频一区二区| 国产精品亚洲美女久久久| 怎么达到女性高潮| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久亚洲精品不卡| 久99久视频精品免费| 久久这里只有精品19| 免费看十八禁软件| 国产精品爽爽va在线观看网站| 99久久精品热视频| 在线a可以看的网站| netflix在线观看网站| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 午夜免费激情av| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产欧美日韩精品亚洲av| 男女下面进入的视频免费午夜| 黄色成人免费大全| 搞女人的毛片| 超碰成人久久| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 岛国视频午夜一区免费看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美成人午夜精品| 免费电影在线观看免费观看| a在线观看视频网站| 国产成人啪精品午夜网站| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产精品影院久久| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 窝窝影院91人妻| 又黄又粗又硬又大视频| 一区二区三区高清视频在线| 一进一出好大好爽视频| 日本a在线网址| 亚洲人成电影免费在线| 国内精品久久久久精免费| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 欧美又色又爽又黄视频| 国产午夜精品久久久久久| 日韩av在线大香蕉| www国产在线视频色| 可以在线观看毛片的网站| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲精品一区av在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 99久久无色码亚洲精品果冻| 午夜激情福利司机影院| 一区二区三区国产精品乱码| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久久久久午夜电影| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美最黄视频在线播放免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产在线观看jvid| 久久久精品欧美日韩精品| 99riav亚洲国产免费| 狂野欧美激情性xxxx| 一区二区三区国产精品乱码| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲精品色激情综合| 啪啪无遮挡十八禁网站| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产亚洲精品av在线| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产三级中文精品| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 日本 欧美在线| 欧美中文日本在线观看视频| 国产午夜精品论理片| 日韩免费av在线播放| 99热只有精品国产| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 九色成人免费人妻av| 欧美在线黄色| 免费电影在线观看免费观看| av国产免费在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 一本精品99久久精品77| 国产日本99.免费观看| 久久这里只有精品19| 最新在线观看一区二区三区| 成人精品一区二区免费| 亚洲全国av大片| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲人成77777在线视频| 黄频高清免费视频| 国产精品 欧美亚洲| 久久久久国内视频| 美女黄网站色视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 村上凉子中文字幕在线| 欧美在线黄色| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产成人影院久久av| 午夜视频精品福利| 色综合欧美亚洲国产小说| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 看免费av毛片| 成人精品一区二区免费| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品免费视频内射| 少妇粗大呻吟视频| 搡老岳熟女国产| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲无线在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 免费在线观看完整版高清| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 曰老女人黄片| 人人妻人人看人人澡| 欧美三级亚洲精品| 日本精品一区二区三区蜜桃| 一本一本综合久久| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲av美国av| 一级作爱视频免费观看| 国产亚洲精品一区二区www| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产69精品久久久久777片 | 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 91老司机精品| 亚洲国产高清在线一区二区三| 精华霜和精华液先用哪个| 最近视频中文字幕2019在线8| 后天国语完整版免费观看| 91大片在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 99久久综合精品五月天人人| 岛国在线观看网站| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产精品 国内视频| 成人三级做爰电影| 国产精品98久久久久久宅男小说| 婷婷六月久久综合丁香| 午夜福利在线观看吧| 欧美中文综合在线视频| 欧美日韩黄片免| 悠悠久久av| 长腿黑丝高跟| 亚洲人与动物交配视频| 免费在线观看黄色视频的| 国产日本99.免费观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 午夜福利高清视频| 国产主播在线观看一区二区| 国产一区二区在线观看日韩 | 真人做人爱边吃奶动态| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产精品日韩av在线免费观看| av福利片在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| 观看免费一级毛片| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲av电影在线进入| 国产精品,欧美在线| 美女午夜性视频免费| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产野战对白在线观看| 嫩草影视91久久| 在线a可以看的网站| 麻豆一二三区av精品| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产97色在线日韩免费| 99久久精品国产亚洲精品| 1024手机看黄色片| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产真实乱freesex| 久久久久九九精品影院| 99在线人妻在线中文字幕| 日韩欧美三级三区| 久久中文看片网| 日韩精品免费视频一区二区三区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 999精品在线视频| 三级国产精品欧美在线观看 | 搞女人的毛片| 国产99白浆流出| 欧美在线黄色| 少妇被粗大的猛进出69影院| 1024香蕉在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 日韩av在线大香蕉| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 无人区码免费观看不卡| 亚洲avbb在线观看| 91老司机精品| 国产熟女xx| 国语自产精品视频在线第100页| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜免费观看网址| 99国产综合亚洲精品| 国产精品 国内视频| 黄色片一级片一级黄色片| 欧美大码av| 成人永久免费在线观看视频| 三级国产精品欧美在线观看 | 小说图片视频综合网站| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲美女视频黄频| 亚洲av成人av| 国产伦人伦偷精品视频| 桃红色精品国产亚洲av| 国产97色在线日韩免费| 两个人看的免费小视频| 中文字幕高清在线视频| 色老头精品视频在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 日韩精品青青久久久久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 长腿黑丝高跟| 色播亚洲综合网| 国产真实乱freesex| 亚洲第一电影网av| 亚洲成av人片在线播放无| 久久婷婷成人综合色麻豆| 一区福利在线观看| 亚洲av电影在线进入| 男插女下体视频免费在线播放| 国产69精品久久久久777片 | 最近最新中文字幕大全电影3| 国产午夜精品论理片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 色噜噜av男人的天堂激情| 色综合站精品国产| 成人手机av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 成人精品一区二区免费| 小说图片视频综合网站| 村上凉子中文字幕在线| 丰满人妻一区二区三区视频av | 午夜激情福利司机影院| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲在线自拍视频| 欧美精品亚洲一区二区| 波多野结衣高清无吗| 国产精品一及| 日本免费a在线| 黄色片一级片一级黄色片| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲国产欧美网| 久久婷婷成人综合色麻豆| 搡老岳熟女国产| 天堂√8在线中文| 男插女下体视频免费在线播放| 日韩欧美国产在线观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 成人av一区二区三区在线看| 黄色女人牲交| 嫩草影院精品99| 一本一本综合久久| 午夜福利成人在线免费观看| 在线国产一区二区在线| 我的老师免费观看完整版| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久草成人影院| 亚洲最大成人中文| 成人三级黄色视频| 香蕉丝袜av| 亚洲人成伊人成综合网2020| 可以在线观看毛片的网站| 国产视频一区二区在线看| av在线播放免费不卡| 岛国在线免费视频观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 少妇粗大呻吟视频| 欧美在线黄色| 日韩欧美免费精品| e午夜精品久久久久久久| 精品国内亚洲2022精品成人| 午夜两性在线视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产精品精品国产色婷婷| 精品欧美国产一区二区三| 日本一本二区三区精品| 老司机在亚洲福利影院| av国产免费在线观看| 亚洲黑人精品在线| 国产高清videossex| 亚洲电影在线观看av| av欧美777| 69av精品久久久久久| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜两性在线视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产精品精品国产色婷婷| 午夜精品久久久久久毛片777| 色尼玛亚洲综合影院| 少妇熟女aⅴ在线视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 高清在线国产一区| 欧美日韩精品网址| 国产在线观看jvid| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 男女视频在线观看网站免费 | 亚洲精品在线美女| 九九热线精品视视频播放| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 久久国产精品人妻蜜桃| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 18禁观看日本| 午夜福利免费观看在线| 国产麻豆成人av免费视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 老汉色∧v一级毛片| 国产黄a三级三级三级人| 日韩有码中文字幕| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 色哟哟哟哟哟哟| 黄色视频不卡| 热99re8久久精品国产| 人人妻人人看人人澡| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产精品爽爽va在线观看网站| 午夜福利成人在线免费观看| 不卡一级毛片| 香蕉丝袜av| 国产亚洲欧美98| 中文字幕久久专区| 中文亚洲av片在线观看爽| avwww免费| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 十八禁网站免费在线| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美性长视频在线观看| 国产野战对白在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 无人区码免费观看不卡| 中文字幕av在线有码专区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 五月玫瑰六月丁香| 午夜精品在线福利| xxx96com| 国产一区二区三区视频了| 十八禁网站免费在线| 99在线视频只有这里精品首页| 久久人妻av系列| 国产视频一区二区在线看| 久久中文看片网| 好男人在线观看高清免费视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美不卡视频在线免费观看 | 欧美日韩一级在线毛片| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲 国产 在线| 90打野战视频偷拍视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 一本综合久久免费| 成人三级黄色视频| 久久亚洲真实| 国产av一区在线观看免费| 午夜激情av网站| 国产欧美日韩一区二区三| 十八禁人妻一区二区| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产1区2区3区精品| 成人av一区二区三区在线看| 国产一区二区激情短视频| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲中文日韩欧美视频| 午夜福利在线在线| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美3d第一页| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 91老司机精品| 国产高清视频在线播放一区| 国产精品日韩av在线免费观看| 女警被强在线播放| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲国产精品999在线| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美中文综合在线视频| av福利片在线观看| 亚洲av美国av| 久99久视频精品免费| 一本综合久久免费| 国内揄拍国产精品人妻在线| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲在线自拍视频| 欧美大码av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产亚洲欧美在线一区二区| x7x7x7水蜜桃| 天天一区二区日本电影三级| 婷婷六月久久综合丁香| 午夜免费激情av| 黄色毛片三级朝国网站| 午夜影院日韩av| 色精品久久人妻99蜜桃| 日本一本二区三区精品| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 天天添夜夜摸| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| bbb黄色大片| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲,欧美精品.| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久久精品国产综合久久久| av在线播放免费不卡| 久久性视频一级片| 欧美高清成人免费视频www| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲五月婷婷丁香| 看黄色毛片网站| 在线观看一区二区三区| 一本一本综合久久| 香蕉久久夜色| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一本大道久久a久久精品| 亚洲激情在线av| bbb黄色大片| 亚洲av五月六月丁香网| 日本精品一区二区三区蜜桃| 两人在一起打扑克的视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美日韩黄片免| 国产精品av久久久久免费| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久久久久九九精品二区国产 | 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美在线黄色| 久久香蕉激情| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| bbb黄色大片| 国语自产精品视频在线第100页| 床上黄色一级片| 国产成人啪精品午夜网站| 大型黄色视频在线免费观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产久久久一区二区三区| 日本熟妇午夜| www.999成人在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲国产精品sss在线观看| 香蕉国产在线看| 亚洲国产精品合色在线| 久久久水蜜桃国产精品网| www.精华液| 久久欧美精品欧美久久欧美| 1024视频免费在线观看| 麻豆一二三区av精品| 免费av毛片视频| 首页视频小说图片口味搜索| 999久久久精品免费观看国产| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品久久久av美女十八| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲一区中文字幕在线| 露出奶头的视频| 久久人妻av系列| www日本黄色视频网| 一进一出抽搐动态| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 成在线人永久免费视频| 日本一本二区三区精品| 在线视频色国产色| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| videosex国产| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲国产看品久久| 国产日本99.免费观看| 悠悠久久av| 亚洲精品久久国产高清桃花| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| av有码第一页| 欧美久久黑人一区二区| 日本 av在线| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 大型黄色视频在线免费观看| 日本一二三区视频观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 最近视频中文字幕2019在线8| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国产97色在线日韩免费| 欧美一区二区精品小视频在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产熟女xx| 国产三级黄色录像| 久久久精品大字幕| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 99久久精品国产亚洲精品| 久久久久久人人人人人| 成人手机av| 在线观看66精品国产| 69av精品久久久久久| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产私拍福利视频在线观看| 中出人妻视频一区二区| 一区二区三区高清视频在线| 高清毛片免费观看视频网站| 日韩精品中文字幕看吧| 丝袜美腿诱惑在线| 看片在线看免费视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产高清videossex| 男人舔女人下体高潮全视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 男人舔女人的私密视频| 麻豆国产av国片精品| 亚洲电影在线观看av| 在线观看午夜福利视频| 欧美精品亚洲一区二区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产成+人综合+亚洲专区| a级毛片a级免费在线| 亚洲精品av麻豆狂野| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美午夜高清在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美在线黄色| 婷婷丁香在线五月| 少妇人妻一区二区三区视频| 精品无人区乱码1区二区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 在线a可以看的网站| www.www免费av| 老汉色∧v一级毛片| 麻豆成人午夜福利视频| 老汉色∧v一级毛片| 午夜精品在线福利| 老司机靠b影院| 日本一区二区免费在线视频| 12—13女人毛片做爰片一| 好男人在线观看高清免费视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 毛片女人毛片| 我的老师免费观看完整版| 热99re8久久精品国产| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产三级中文精品| 欧美日韩福利视频一区二区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 成人av在线播放网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| av天堂在线播放| 亚洲欧美精品综合久久99| 美女午夜性视频免费| 国产人伦9x9x在线观看| 国产av不卡久久| 丁香六月欧美| 露出奶头的视频| 中文资源天堂在线| 香蕉丝袜av| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产精品 国内视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 日本一二三区视频观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲欧美日韩高清专用| 老熟妇仑乱视频hdxx| e午夜精品久久久久久久| 欧美黑人精品巨大| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 男插女下体视频免费在线播放| 日本黄大片高清| 亚洲成人久久爱视频|