Cry1Ah蛋白對多異瓢蟲和日本通草蛉的安全性評價

潘洪生，王冬梅，姜 巖，阿克旦·吾外士，李號賓

（新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/國家植物保護(hù)庫爾勒觀測實驗站，烏魯木齊 830091）

1996年，美國開始商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花，其種植面積在印度、澳大利亞、阿根廷、南非、墨西哥和哥倫比亞等國家迅速增加。2018年全球共有26個國家和地區(qū)種植轉(zhuǎn)基因作物，其中棉花種植面積為2490萬公頃[1]。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花可有效控制棉鈴蟲Helicoverpa armigera和紅鈴蟲Pectinophora gossypiella等靶標(biāo)害蟲的為害，在棉花害蟲綜合防控中發(fā)揮了重要作用[2,3]。轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的利用雖然能夠有效控制害蟲，但同時也存在潛在的風(fēng)險。因此，轉(zhuǎn)基因抗蟲作物商業(yè)化種植前的環(huán)境安全性評價就顯得尤為重要[4]。非靶標(biāo)生物在農(nóng)田系統(tǒng)中具有重要的生態(tài)功能，環(huán)境安全性評價研究的昆蟲主要集中在捕食性天敵、寄生性天敵、經(jīng)濟(jì)昆蟲、非靶標(biāo)害蟲和傳粉昆蟲等[5]。

瓢蟲和草蛉是棉田重要的捕食性天敵，不僅可取食棉蚜Aphis gossypii等多種蚜蟲、棉鈴蟲的卵和低齡幼蟲，而且其成蟲還可取食棉花等作物的花粉和花蜜[6,7]。目前，不同轉(zhuǎn)基因抗蟲作物和不同Cry殺蟲蛋白對瓢蟲和草蛉的環(huán)境安全性評價已有大量研究。例如，轉(zhuǎn)Cry1Ac和Cry1Ac/Cry2Ab基因抗蟲棉花對龜紋瓢蟲Propylea japonica和大斑長足瓢蟲Coleomegilla maculate無明顯的不利影響[8,9]。雒珺瑜等[10]發(fā)現(xiàn)飼喂取食轉(zhuǎn)雙價抗蟲棉（表達(dá)Cry1Ac和Cry2Ab蛋白）和單價抗蟲棉（表達(dá)Cry1Ac蛋白）的棉鈴蟲初孵幼蟲后，中華草蛉Chrysopa sinica幼蟲的發(fā)育歷期與常規(guī)棉花相比略有延長，但差異未達(dá)顯著水平。張小潔[11]研究表明轉(zhuǎn)Cry2A和Cry1C基因水稻的種植不會對龜紋瓢蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。取食轉(zhuǎn)Cry1Ab或Cry3Bb1或CrylAb/2Aj和CrylAc基因玉米的花粉后，普通草蛉Chrysoperla carnea、日本通草蛉Chrysoperla nipponensis、深點食螨瓢蟲Stethorus punctillum和龜紋瓢蟲的存活率、產(chǎn)卵前期和日均產(chǎn)卵量等生命表參數(shù)均沒有顯著不利影響[12-14]。利用Cry2Ab、Cry1Ac＋Cry2Ab和Cry1Ah蛋白處理的棉鈴蟲幼蟲來飼喂龜紋瓢蟲、七星瓢蟲Coccinalla septempunctata和大草蛉Chrysopa pallens后，各項生物學(xué)參數(shù)與對照相比均沒有顯著性差異[6,7,15]。此外，Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1Ab/2Aj、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry2A、Cry1B、Cry3Bb1、Cry1C、Cry1Fa、Cry1F、Cry1Ie和Cry2Ah蛋白對龜紋瓢蟲、異色瓢蟲Harmonia axyridis、二星瓢蟲Adalia bipunctata、大草蛉、中華草蛉、日本通草蛉和普通草蛉無毒性，對體內(nèi)主要消化酶、解毒酶和保護(hù)酶活性無顯著影響[7,16-22]。

Cry1Ah基因是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離克隆的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的殺蟲基因，其蛋白與棉鈴蟲上的氨肽酶（Aminopeptidase，簡稱 APN）能夠特異的結(jié)合，對棉鈴蟲幼蟲具有殺蟲特異性[23,24]。然而，Cry1Ah蛋白對多異瓢蟲Hippodamia variegata和日本通草蛉的潛在影響尚未見報道。本研究評價大于田間轉(zhuǎn)基因棉花中Bt 蛋白表達(dá)量 20 倍劑量的高濃度Cry1Ah蛋白對多異瓢蟲幼蟲發(fā)育歷期、存活率、體質(zhì)量以及多異瓢蟲和日本通草蛉雌雄成蟲壽命、雌蟲產(chǎn)卵量等生物學(xué)指標(biāo)的影響，為轉(zhuǎn)Cry1Ah基因抗蟲棉花商業(yè)化釋放前系統(tǒng)安全性評價提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與蛋白

多異瓢蟲成蟲采自國家植物保護(hù)庫爾勒觀測實驗站（新疆巴州庫爾勒市和什力克鄉(xiāng)庫勒村，41.75° N，85.81° E）周邊棉田田埂的甘草Glycyrrhiza uralensisFisch和駱駝刺Alhagi sparsifoliaShap上。在實驗室內(nèi)用甘草、駱駝刺上的棉黑蚜Aphis atrata在1.2 L養(yǎng)蟲盒中進(jìn)行飼養(yǎng)。實驗室環(huán)境條件控制在溫度（25±1）℃、相對濕度（65±5）%、光周期14L∶10D。成蟲產(chǎn)卵孵化出的整齊一致的初孵幼蟲用于試驗。

日本通草蛉成蟲采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院西部農(nóng)業(yè)研究中心（44.26° N，87.34° E）常規(guī)棉田，在實驗室內(nèi)，放于大玻璃罐中（直徑20 cm，高25 cm），罐口覆蓋棉紗布，罐中放置2 cm厚海綿，成蟲用5 mL注射器注射20%蜂蜜水進(jìn)行飼養(yǎng)，幼蟲用麥蛾Sitotroga cerealella(Olivier)卵和人工飼料[25]進(jìn)行擴(kuò)繁，至少4個世代后用于試驗。養(yǎng)蟲室環(huán)境條件為（25±1）℃，相對濕度（65±5）%，光周期14L∶10D。

Cry1Ah殺蟲蛋白購自北京綻諾思特生物科技有限公司。

1.2 Cry 1Ah蛋白對多異瓢蟲幼蟲生長發(fā)育的影響

首先配制500 μg/mL的Cry1Ah蛋白稀釋液，然后向其中加入有機(jī)硅表面活性劑（南京沃博生物科技有限公司），使其在稀釋液中的濃度為0.1%。接著用噴壺將10 mL的Cry1Ah蛋白稀釋液噴在實驗室連續(xù)飼養(yǎng)多代的育苗盤中有桃蚜的豌豆苗上，盡量讓桃蚜體表布滿Cry1Ah蛋白稀釋液。室溫放置2 h后，用上述處理過的桃蚜飼養(yǎng)多異瓢蟲。以飼喂僅噴濃度為0.1%有機(jī)硅表面活性劑的桃蚜為對照。

將初孵的多異瓢蟲幼蟲單頭接入玻璃燒杯（外徑4.5 cm，內(nèi)徑3.8 cm，高6.0 cm）中，燒杯上覆蓋120目尼龍紗布，并以橡膠皮筋固定。分別飼喂處理和對照的桃蚜（約250頭），置于25 ℃，RH 65%，光周期14:10（L:D）的培養(yǎng)箱（RXZ-500型，寧波江南儀器廠）中飼養(yǎng)。每天更換食物并檢查幼蟲存活情況（用零號毛筆輕掃蟲體，若蟲體長時間不動或蟲體變形、變色判斷為死亡）與齡期變化情況。待幼蟲化蛹后，分別記錄化蛹日期和羽化日期。同時，蛹羽化為成蟲后，確定其性別（雄蟲第5腹板后緣線微凹入，第6腹板后緣平截；雌蟲第5腹板舌形向后凸出，第6腹板基部有三角形下凹，后緣尖形凸出），并用萬分之一電子天平單頭稱量新羽化成蟲的質(zhì)量。處理和重復(fù)均重復(fù)3次，每個重復(fù)觀察30頭。

1.3 Cry 1Ah蛋白對多異瓢蟲成蟲壽命與繁殖能力的影響

取新羽化的多異瓢蟲雌、雄成蟲各一頭置于玻璃燒杯中進(jìn)行單對飼養(yǎng)，分別飼喂處理和對照的桃蚜（約250頭），置于（25±1）℃，相對濕度（65±5）%，光周期14L∶10D的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。每天更換食物，連續(xù)觀察20 d雌、雄成蟲的壽命以及雌蟲產(chǎn)卵量。處理和對照均重復(fù)3次，每個重復(fù)觀察20對。

1.4 Cry 1Ah蛋白對日本通草蛉成蟲壽命與繁殖能力的影響

首先以50 mmol的Na2CO3溶液為溶劑配制20%的蜂蜜水，然后將Cry1Ah蛋白用20%的蜂蜜水配成濃度為500 μg/mL的稀釋液。

將新羽化的日本通草蛉雌、雄成蟲配對，放在大玻璃罐中，罐口覆蓋棉紗布，用清水飼養(yǎng)48 h后，繼續(xù)用500 μg/mL的Cry1Ah蛋白稀釋液飼養(yǎng)。以繼續(xù)用20%的蜂蜜水溶液飼養(yǎng)為對照。飼養(yǎng)方法同“1.1”。放在（25±1）℃，相對濕度（65±5）%，光周期14L∶10D的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。每日更換干凈海綿和棉紗布，并記錄雌、雄成蟲的壽命及雌蟲產(chǎn)卵量，一直持續(xù)到全部成蟲死亡。處理和重復(fù)均重復(fù)3次，每個重復(fù)觀察20對。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 20對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。多異瓢蟲和日本通草蛉的發(fā)育歷期、存活率和體質(zhì)量以及雌、雄成蟲壽命，產(chǎn)卵量等生物學(xué)參數(shù)采用獨立樣本t檢驗法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cry1Ah蛋白對多異瓢蟲幼蟲生長發(fā)育的影響

Cry1Ah蛋白對多異瓢蟲幼蟲生長發(fā)育的影響如表1所示。取食體表布滿Cry1Ah蛋白的桃蚜后，多異瓢蟲幼蟲的存活率（P＝0.386）、幼蟲歷期（P＝0.805）、蛹?xì)v期（P＝0.229）及體質(zhì)量（P＝0.450）與對照間差異均不顯著。這說明Cry1Ah蛋白對多異瓢蟲幼蟲的各項生命指標(biāo)均無顯著的不利影響。

表1 Cry1Ah蛋白對多異瓢蟲幼蟲生命指標(biāo)的影響Table 1 Effect of Cry1Ah protein on the life indicators of H.variegata larvae

2.2 Cry 1Ah蛋白對多異瓢蟲成蟲壽命與繁殖能力的影響

Cry1Ah蛋白對多異瓢蟲成蟲壽命與繁殖能力的影響如圖1所示。取食體表布滿Cry1Ah蛋白的桃蚜后，多異瓢蟲雌、雄成蟲壽命（雌：P＝0.821，雄：P＝0.576），雌蟲產(chǎn)卵量（P＝0.802）均與對照無顯著性差異。這說明Cry1Ah蛋白對多異瓢蟲成蟲壽命及繁殖能力均無顯著的不利影響。

圖1 Cry 1Ah蛋白對多異瓢蟲成蟲壽命（A）與繁殖能力（B）的影響Fig.1 Effects of Cry1Ah protein on the longevity (A) and fecundity (B) of H.variegata adults

2.3 Cry1Ah蛋白對日本通草蛉成蟲壽命與繁殖能力的影響

Cry1Ah蛋白對日本通草蛉成蟲壽命與繁殖能力的影響如圖2所示。取食含Cry1Ah蛋白的蜂蜜水后，日本通草蛉雌、雄成蟲壽命（雌：P＝0.890，雄：P＝0.556），雌蟲產(chǎn)卵量（P＝0.959）與對照間均無顯著性差異。這說明Cry1Ah蛋白對日本通草蛉成蟲壽命及繁殖能力均無顯著的不利影響。

圖2 Cry 1Ah蛋白對日本通草蛉成蟲壽命（A）與繁殖能力（B）的影響Fig.2 Effect of Cry1Ah protein on the longevity (A) and fecundity (B) of C.nipponensis adults

3 討論

轉(zhuǎn)基因抗蟲作物對非靶標(biāo)生物影響的評價，以非靶標(biāo)生物接觸到殺蟲蛋白的途徑和濃度來評估轉(zhuǎn)基因作物組織內(nèi)表達(dá)的殺蟲蛋白對該生物的毒性作用和生態(tài)安全性為依據(jù)，評價某一殺蟲蛋白對非靶標(biāo)生物的毒性作用，需選擇合適的非靶標(biāo)指示性生物[4]。其中，作為農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中重要的自然天敵需要優(yōu)先考慮[26]。多異瓢蟲和日本通草蛉是新疆農(nóng)田中主要的捕食性天敵，分布范圍廣，在室內(nèi)易于飼養(yǎng)，生物學(xué)指標(biāo)易于觀察，是室內(nèi)測試時合適的指示物種。蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種昆蟲病原細(xì)菌，依賴于殺蟲晶體蛋白來殺死昆蟲幼體宿主，幾乎完全專一針對不同目的昆蟲幼蟲階段，破壞中腸組織以達(dá)到殺死昆蟲的目的。從Bt中克隆的Cry1Ah基因編碼一種對幾種鱗翅目害蟲具有高殺蟲毒性的蛋白，如亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis，LC50= 0.05μg/g）、棉鈴蟲（LC50＝1.48 μg/g）和水稻二化螟（Chilo suppressalis，LC50＝0.98 μg/g）[27]。目前，Cry1Ah1基因已經(jīng)轉(zhuǎn)化到玉米中，對一些鱗翅目害蟲表現(xiàn)出很強(qiáng)的控制作用[28,29]。對Cry1Ah蛋白和Cry1Ah1轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行風(fēng)險評估時，尚未發(fā)現(xiàn)對蜜蜂存活、發(fā)育、行為的不利影響[30,31]。本文研究Cry1Ah蛋白對多異瓢蟲幼蟲、成蟲和日本通草蛉成蟲的各項生命指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)Cry1Ah蛋白對這兩種捕食性天敵無明顯的不利影響。

雖然轉(zhuǎn) Bt基因抗蟲作物對農(nóng)田幾種鱗翅目害蟲起到了很好的控制作用，但長期的高壓選擇，也致使這些害蟲對轉(zhuǎn) Bt基因抗蟲作物產(chǎn)生了一定的抗性。小菜蛾在四種 Bt殺蟲晶體蛋白（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah和Cry1Ca）的選擇壓力下，存在不同程度的抗藥性[32,33]。因此，挖掘新的Bt基因，培育和Cry1Ac不同作用機(jī)制的新型抗蟲棉花品種，對棉鈴蟲等鱗翅目靶標(biāo)害蟲的抗性治理具有重要意義。目前，孟山都開發(fā)的第二代Bt棉花，如Cry2Ab2和Cry1Ac雙價抗蟲棉已在美國、澳大利亞和印度商業(yè)化種植[34]。而國內(nèi)將 Cry1C*基因、Cry2A*基因和 CryNGc基因轉(zhuǎn)入水稻，獲得抗鱗翅目害蟲，如稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis、二化螟和三化螟Tryporyza incertulas的轉(zhuǎn)基因水稻[35,36]，將Cry1Ie基因和CryNGc基因轉(zhuǎn)入玉米，獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米[37,38]，將 Cry1C*基因轉(zhuǎn)入棉花，獲得抗蟲性好的棉花植株[39]。這些研發(fā)出的新一代 Bt轉(zhuǎn)基因作物，將為轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的持續(xù)利用提供堅實的科技支撐。然而，這些新型轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境生態(tài)安全性，尤其是對天敵等非靶標(biāo)生物的影響有待進(jìn)一步系統(tǒng)評估。