木欖耐鹽內(nèi)生細(xì)菌分離及其16S rDNA鑒定

戴婧婷，林麗玲，范銘豐，張華峰，劉希華

（1.福建省資源環(huán)境監(jiān)測與可持續(xù)經(jīng)營利用重點實驗室，福建三明 365004；2.三明學(xué)院海峽理工學(xué)院，福建三明 365004；3.三明市土肥站，福建三明 365000；4.廈門市森林病蟲害防治技術(shù)站，福建廈門 361004；5.三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建三明 365004）

根據(jù)聯(lián)合國教科文組織和糧農(nóng)組織的不完全統(tǒng)計，我國的鹽堿地面積為9 913萬hm2，鹽堿地占中國總耕地面積的10%[1]。為了緩解鹽堿脅迫對植物生長和產(chǎn)量的負(fù)面影響，人們已經(jīng)采用多種方法來培育耐鹽的農(nóng)作物。傳統(tǒng)雜交育種周期長，見效慢，基因工程育種存在著不可預(yù)見的缺點[2]，而內(nèi)生細(xì)菌與植物的互作提高了作物的自身耐鹽能力，并克服了上述2種方法的缺點[3]，因而分離出能與植物互作且能提高作物自身耐鹽能力的內(nèi)生菌在耐鹽農(nóng)作物的培育中有著重要的作用。紅樹林區(qū)土壤及其植株體內(nèi)外含有大量微生物[4]，但研究多集中在植物病原菌抗菌方面[5-7]，而紅樹林內(nèi)生細(xì)菌在促生抗逆等方面的研究鮮有報道。木欖（Bruguiera gymnorhiza）是紅樹林的主要組成種類，該研究從木欖根莖葉中分離篩選鑒定耐鹽堿菌株，為培育耐鹽農(nóng)作物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料。木欖采自福建省廈門市南湖公園（24°26′N，118°04′E），采樣時整株植物連根拔起，低溫保存運輸，運回實驗室后，馬上分離內(nèi)生細(xì)菌。

1.1.2 試驗試劑?；九囵B(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，NaCl濃度設(shè)置為10（對照）、50、100、150、200 g/L。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離和純化。木欖內(nèi)生細(xì)菌的分離方法參照小飛蓬耐鉛內(nèi)生細(xì)菌的分離方法[8]。

1.2.2 生理生化分析。對分離純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶反應(yīng)、檸檬酸鹽反應(yīng)、吲哚試驗和甲基紅試驗檢驗[8]。

1.2.3 分子鑒定。菌株基因組DNA用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒（天根）進(jìn)行提取，以通用引物8f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492r（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）（上海華大基因）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。退火溫度為52℃。選用HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ和TaqⅠ4種限制性內(nèi)切酶消化16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析酶切結(jié)果。選取酶切不同類型的代表菌株送往杭州有康生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測序[8]。

測序后的序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行BLAST比對分析，用Clustal X 1.83對同源性超過95%序列進(jìn)行分析，用軟件MEGA（7.0）利用Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌分離

從表1可以看出，只有在木欖的葉部分離到耐鹽的內(nèi)生細(xì)菌，而且隨著鹽濃度的增加，所分離到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量也隨之減少。

表1 木欖分離菌株情況

2.2 生理生化分析

對所分離的24株（50 g/L和100 g/L濃度中分離的）內(nèi)生細(xì)菌生理生化分析結(jié)果表明，所有的菌革蘭氏染色后是紫色的，為陽性菌；過氧化氫試驗均產(chǎn)生氣泡，為陽性菌；吲哚試驗全部為玫紅色，為陽性菌；甲基紅（M-R）試驗均為紅色，為陽性菌；淀粉水解試驗除了1個50 g/L的為深藍(lán)色，為陰性菌，其余菌株為紫色、紫紅色或無色，為陽性。

2.3 分子鑒定

49株供試菌株通用引物8 f和1492 r擴(kuò)增出1 600 bp左右的單一條帶，經(jīng)過4種限制性內(nèi)切酶消化分別產(chǎn)生1～4種圖譜類型（圖1），酶切圖譜比對、組合分析后共獲得5種遺傳型（表2）。選取不同組合類型的代表菌株進(jìn)行16S rDNA序列測定，測序結(jié)果上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫，收集同源性高的序列。

圖1 供試菌株16S rDNA PCR產(chǎn)物酶切圖譜類型

表2 供試菌株16S rDNA PCR-RFLP圖譜類型

利用MEGA（7.0）將秋茄和木欖內(nèi)生細(xì)菌菌株與其同源性較高的菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹（圖2）。結(jié)合各菌株的遺傳距離（圖2）和菌株16S rDNA序列的Blast同源性（表3）進(jìn)行比較分析，初步推斷出L1為越南芽孢桿菌（Bacillus vietnamensis），L2為芽孢桿菌（Bacillus cereus），L4為白翎芽孢桿菌（Bacillus baekryun-gensis），L5為巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri）。

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 菌株16S rDNA序列的Blast同源性分析

3 結(jié)論與討論

該文通過不同鹽濃度的LB培養(yǎng)基對木欖根莖葉耐鹽內(nèi)生細(xì)菌的分離篩選，共分離到24株耐鹽內(nèi)生細(xì)菌，結(jié)合生理生化分析、16S rDNA分子鑒定等技術(shù)，推斷出所分離到內(nèi)生細(xì)菌分別為越南芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、白翎芽孢桿菌和巴氏葡萄球菌。

一些研究人員觀察到，用內(nèi)生細(xì)菌接種植物可以在鹽堿地環(huán)境下促進(jìn)植物生長和發(fā)育[10]。內(nèi)生細(xì)菌或通過合成大量甘氨酸甜菜堿等化合物，或通過誘導(dǎo)滲透保護(hù)劑和抗氧化蛋白的合成[11]，或通過合成低乙烯產(chǎn)生和抗氧化防御機制的快速激活來增強植物在鹽堿地的生長[12]。有研究通過分離龍葵等耐鉛植物的內(nèi)生細(xì)菌并轉(zhuǎn)接馬尾松上，促進(jìn)了鉛脅迫下馬尾松的生長[13]。因此研究從紅樹林分離耐鹽的內(nèi)生細(xì)菌，轉(zhuǎn)接到其他植物上以增強其在鹽堿地生長，是可行的，也具有實際應(yīng)用價值。