超高壓制備黑茶多糖鐵的化學組成與結構特性

賈時榮，何 洪，安風平，曾紹校，王藝偉，宋洪波

（1.福建農(nóng)林大學 食品科學學院，福建 福州 350002；2.福建省特種淀粉品質(zhì)科學與加工技術重點實驗室，福建 福州 350002）

鐵是一種重要的人體所需礦物質(zhì)，在代謝過程和免疫功能方面發(fā)揮重要作用[1]。缺鐵可導致缺鐵性貧血或功能障礙，在所有年齡人群中均較普遍[2]，通常由于缺鐵、難以吸收鐵或大量流失所致[3]。目前，無機鐵（如硫酸亞鐵等）是常用的鐵補充劑，但易產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化和胃腸道副作用[4-5]。因此，有機鐵補充劑的研究受到關注，如多糖鐵、多肽鐵、氨基酸鐵、血紅素鐵、富鐵酵母等，主要以分子形式吸收，避免了鐵離子導致的脂質(zhì)過氧化和胃腸道副作用[4，6]。多糖易與鐵離子作用形成復合物，不僅具有有機鐵的優(yōu)點，還保留了多糖的部分生物活性[7]。多糖鐵復合物的化學組成及其結構是消化吸收的基礎，此方面的研究鮮見報道。

有研究表明，超高壓處理可以改變蛋白質(zhì)、淀粉等生物大分子結構[8]，用于制備蓮子直鏈淀粉-脂肪酸復合物取得良好效果[9]，這為超高壓制備多糖鐵復合物提供了可能性。黑茶屬后發(fā)酵茶，通常選擇成熟度較高的鮮葉加工，具有老茶的特點[10]，其多糖含量普遍高于新葉[11]。因此，以黑茶多糖為基礎材料，研究超高壓制備黑茶多糖鐵復合物的化學組成與結構特性，為進一步研究其消化利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

原料：黑茶，中茶湖南安化第一茶廠有限公司提供。

試劑：FeCl3、NaOH、無水乙醇、K4[Fe(CN)6]、苯酚、硫酸、考馬斯亮藍G-250、鹽酸、醋酸、鄰菲羅啉、檸檬酸三鈉、鹽酸羥胺、三氟乙酸、PVP-P、Na2CO3，分析純，國藥集團化學試劑有限公司提供；沒食子酸、PMP、乙腈、氯仿、ACS，上海阿拉丁生物科技有限公司提供；福林酚、牛血清蛋白（BSA）、3 500 U透析袋、葡萄糖標品，北京索萊寶生化技術公司提供；鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、巖藻糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、核糖，上海源葉生物科技有限公司提供；木糖、葡萄糖，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

JHBE-20A型閃式提取儀，上海釩幟精密設備有限公司產(chǎn)品；5L-HPP600 MPa型靜態(tài)超高壓設備，包頭科發(fā)高壓科技有限責任公司產(chǎn)品；TGL-16型醫(yī)用冷凍離心機，四川蜀科儀器有限公司產(chǎn)品；Agilent-1200型高效液相色譜，美國安捷倫科技公司產(chǎn)品；FTIR-8400S型傅立葉變換紅外光譜儀、UV-1780型紫外分光光度計，日本島津公司產(chǎn)品；TENSOR 27型X射線粉末衍射儀，德國布魯克公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑茶多糖提取

將黑茶粉碎，過60目篩，料液比1∶55（W/V），閃式提取器電壓170 V，提取107 s；以轉速3 500 r/min離心10 min，乙醇沉淀10 h，凈水復溶濃縮后冷凍干燥得黑茶粗多糖。取15 g粗多糖溶于300 mL水中，加3 g PVP-P攪拌10 min，于20℃下以轉速3 500 r/min離心10 min，取上清液重復上述步驟3次，濃縮后3 500 U透析袋透析48 h，冷凍干燥得黑茶多糖（DTP）。

1.3.2 多糖鐵復合物的制備

加熱法制備黑茶多糖鐵復合物（DTPIC-HW）：取0.2 g DTP溶于10 mL水中，加入0.1 g檸檬酸三鈉，用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH值至8，按質(zhì)量比1.7∶1加入濃度為0.89 mmol/mL的FeCL3溶液，于60℃水浴中振蕩反應1 h，以轉速7 000 r/min離心10 min；4倍量乙醇沉淀1 h，以轉速3 500 r/min離心10 min，加水復溶后3 500 U透析袋透析48 h，冷凍干燥。

超高壓法制備黑茶多糖鐵復合物（DTPIC-HP）：有別于加熱法，反應過程是將待處理溶液裝入塑料袋密封，于超高壓設備中425 MPa處理22 min。其他步驟同上。

1.3.3 多糖鐵復合物成分測定

（1）定性分析。參考2015版《中華人民共和國藥典（四部）》，取適量茶多糖粉末，加水配制1 mg/mL溶液，將FeCl3（2 mol/L）溶液滴加至沸騰水中直至變?yōu)榧t棕色，得到Fe(OH)3溶膠；取1 mL待測樣品溶液，一式3份，分別用NaOH溶液、無水乙醇、K4[Fe(CN)6]溶液進行鑒定。

（2）化學成分測定。中性糖：采用苯酚-濃硫酸法[12]測定多糖得率，以中性糖含量為考查指標。鐵：采用Lu Q等人[13]的方法稍作修改。取0.01 g樣品溶于質(zhì)量分數(shù)為0.6%的HCl溶液50 mL中，取1 mL溶液置于25 mL具塞試管中，依次加入質(zhì)量分數(shù)為5%的HCl液1 mL和質(zhì)量分數(shù)為10%的鹽酸羥胺溶液1 mL，室溫反應1 h；再加入質(zhì)量分數(shù)為0.15%的鄰菲羅啉2 mL和質(zhì)量分數(shù)為10%的醋酸鈉溶液5 mL，加入適量去離子水使溶液總體積為25 mL，室溫反應15 min。于波長510 nm處測定溶液吸光度，根據(jù)標準曲線（Y=0.008 4X-0.004 8；R2=0.999 3）計算鐵離子含量。糖醛酸：采用間羥基聯(lián)苯法[14]，以半乳糖醛酸為標準品，于波長520 nm處測定溶液吸光度，根據(jù)標準曲線（Y=0.007 4X+0.019 7；R2=0.995 7）計算糖醛酸含量。蛋白質(zhì)的測定采用Bradford法[15]，以牛血清蛋白為標準品，于波長595 nm處測定吸光度，依據(jù)標準曲線（Y=0.005 4X+0.009 4；R2=0.991 5）計算蛋白質(zhì)含量。多酚的測定采用福林酚法[16]，以沒食子酸為標準品，于波長765 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線（Y=0.009 5X+0.027 3；R2=0.997 8）計多酚含量。

1.3.4 結構表征

（1）單糖組成的測定。采用高效液相色譜法測定。取15 mg樣品于水解管中，加入濃度為4 mol/L的TFA（三氟乙酸）溶液1 mL，于120℃下加熱水解2 h；用氮氣吹干，加入濃度為0.5 mol/L PMP-甲醇溶液1 mL及濃度為0.3 mol/L的NaOH溶液0.5 mL，70℃水浴加熱60 min，冷卻；再加入濃度為0.3 mol/L的HCl溶液0.5 mL和氯仿0.5 mL，振蕩后靜置20 min，棄去有機層，萃取3次，取水層過濾膜。色譜條件：SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相0.1 mol/L KH2PO4（pH值6.8）/乙腈=82/18，流速1.0 mL/min，柱溫25℃進樣量10 μL，于波長245 nm處測定吸光度。

（2）紅外光譜（FTIR）分析。稱取5 mg樣品與500 mg KBr混合，充分研磨后壓片，傅立葉紅外光譜儀進行定性檢測。以4 cm-1的分辨率，4 000～400 cm-1的波數(shù)掃描32次。

（3）X-射線衍射（XRD）分析。稱取50 mg樣品進行X-射線衍射掃描。Cuk-α為X射線源，0.02°步長，2θ=5~90°范圍內(nèi)進行掃描。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS（17.0）軟件，數(shù)據(jù)通過One-way ANOVA方差分析進行統(tǒng)計學比較，采用鄧肯法進行事后檢驗，p＜0.05具有顯著性差異，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 定性分析

黑茶多糖鐵的定性分析見表1。

表1 黑茶多糖鐵的定性分析

由表1可知，將DTPIC-HW和DTPIC-HP溶于水后呈淡黃色，而Fe(OH)3溶液則為紅棕色。加入NaOH后，DTPIC-HW和DTPIC-HP溶液無沉淀，而Fe(OH)3溶液產(chǎn)生沉淀，這反映了多糖和Fe(OH)3在堿性條件下的應有性質(zhì)；加入無水乙醇后，DTPIC-HW和DTPIC-HP均產(chǎn)生沉淀，而Fe(OH)3未發(fā)生沉淀現(xiàn)象，說明DTPIC-HW和DTPIC-HP仍具有多糖的性質(zhì)；加入K4Fe(CN)6后，DTPIC-HW和DTPIC-HP未發(fā)生明顯的顏色變化，而Fe(OH)3生成了藍色沉淀，說明2種黑茶多糖水溶液中均不存在游離Fe3+。

2.2 化學成分分析

黑茶多糖鐵化學成分分析見表2。

表2 黑茶多糖鐵化學成分分析

由表2可知，DTP中含有中性糖、糖醛酸，少量的蛋白質(zhì)和多酚。DTPIC-HW和DTPIC-HP中的主要成分是中性糖、糖醛酸和鐵，這是因為在制備過程中堿性條件使DTP中的多酚、蛋白與鐵離子形成沉淀，在后續(xù)醇沉和透析被去除。與DTP相比，2種多糖鐵中的中性糖和糖醛酸含量均顯著降低，主要原因一方面是由于多糖鐵中含有一定量的鐵，使樣品中的中性糖和糖醛酸相對含量降低；另一方面由于水分子參與復合物中“鐵核”的形成，產(chǎn)物中引入了一定量的結合水，也使得等質(zhì)量樣品中的中性糖含量降低[17]。DTP中的中性糖與糖醛酸的比例為2.53，而DTPIC-HW中的中性糖與糖醛酸的比例為8.4，表明其中的糖醛酸明顯減少，是由于熱堿性條件下糖醛酸與鐵離子相互作用造成的[18]；DTPIC-HP中的中性糖與糖醛酸比例為2.15，鐵含量顯著高于DTPIC-HW中的（p＜0.05），說明常溫超高處理使得更多的鐵與中性糖及糖醛酸結合。

2.3 單糖組成分析

黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的單糖組成分析見表3。

表3 黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的單糖組成分析

由表3可知，茶多糖及多糖鐵均含有巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、鼠李糖等中性多糖，半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等酸性多糖。與DTP相比，DTPIC-HW和DTPIC-HP中的單糖組成比例均發(fā)生不同程度變化，說明因加熱或超高壓制備方法的不同，茶多糖鐵中的單糖組成比例亦產(chǎn)生差異。

黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的典型單糖比值見表4。

表4 黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的典型單糖比值

由表4可知，DTP、DTPIC-HW和DTPIC-HP中典型單糖比值結果，用于判斷樣品是否含有RG-I結構并評估RG-I結構側鏈長短。RG-I結構是植物酸性多糖的一種亞結構，鼠李糖與半乳糖醛酸的比值（即Rha/GalA）為0.05～1.00時表明包含這一結構[19]；RG-I的側鏈含有半乳糖和阿拉伯糖，而半乳糖與阿拉伯糖之和與鼠李糖的比值（即（Gal+Ara）/Rha）可評估RG-I的側鏈長短[20]。結果表明，DTP中Rha/GalA為0.50，說明其含有RG-I結構，這與Chen G等人[21]對熱水浸提法提取的黑茶多糖的試驗結果（0.28～0.55）相符。DTPIC-HW中Rha/GalA為5.36，表明RG-I結構被破壞，可能是由糖鏈上的半乳糖醛酸與鐵離子螯合導致的；（Gal+Ara）/Rha為3.65，表明加熱法制備法使得多糖側鏈變短。DTPIC-HP中Rha/GalA為0.43，說明超高壓制備的茶多糖鐵更好地保留了RG-I的結構；（Gal+Ara）/Rha為8.93，高于DTP，說明DTPIC-HP的RG-I結構上可能連接了更長的側鏈。

2.4 紅外光譜分析

黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的FT-IR光譜圖譜見圖1。

圖1 黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的FT-IR光譜圖譜

由圖1可知，DTP、DTPIC-HW和DTPIC-HP均在3 397 cm-1處有吸收峰，為多糖羥基結構的伸縮振動[22]。2 930 cm-1和1 236 cm-1處產(chǎn)生的吸收峰為DTP中C-H結構的伸縮振動所致，而DTPIC-HW和DTPIC-HP圖譜中此吸收峰強度不同程度減弱，且波數(shù)移至2 941 cm-1和1 258 cm-1，說明鐵與多糖復合過程中影響了C-H的結合強度[23]。1 720 cm-1處吸收峰為DTP中COO-的特征吸收[24]，而DTPIC-HP圖譜中此吸收峰減弱，DTPIC-HW圖譜中此峰消失；1 622 cm-1和1 419 cm-1處的吸收峰是DTP中C=O和C-O的伸縮振動[25]，螯合鐵后DTPIC-HW和DTPIC-HP中此2個特征峰均向低波數(shù)（1 607 cm-1和1 393 cm-1）偏移，表明羧基和羥基不同程度參與了鐵離子與DTP的結合。1 088 cm-1和901 cm-1處的吸收峰是DTP中C-O-C伸縮振動和C-C伸縮振動[26]，而DTPIC-HW和DTPIC-HP中這2個特征峰均發(fā)生了偏移（1 074 cm-1和918 cm-1）。在指紋區(qū)（1 000～400 cm-1），DTPIC-HW和DTPIC-HP出現(xiàn)了2個新的吸收峰（853 cm-1和692 cm-1），這是β-FeOOH的特征峰[27]，表明鐵與DTP螯合成功，并且以β-FOOH的形式存在。

2.5 X-射線衍射分析

黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的XRD圖譜見圖2。

圖2 黑茶多糖及不同黑茶多糖鐵的XRD圖譜

由圖2可知，3個樣品在2θ=0～80°無明顯的強吸收峰，說明茶多糖和茶多糖鐵均無結晶區(qū)域，呈無定形態(tài)[28]。與DTP的圖譜相比，DTPIC-HW和DTPIC-HP出現(xiàn)了凸起的衍射峰，特別是DTPIC-HP凸起衍射峰（5°＜2θ＜15°）較DTPIC-HW的凸起衍射峰（5°＜2θ＜25°）更窄、強度更大，一方面說明鐵離子能夠與茶多糖配位形成新的螯合物；另一方面也說明超高壓較加熱制備茶多糖鐵中的鐵離子在糖鏈上的分布更為集中。

3 結論

常溫超高壓法和加熱法均可有效地將鐵離子與黑茶多糖螯合，且不形成結晶區(qū)。DTPIC-HP中鐵含量為16.73，顯著高于DTPIC-HW的12.77%；前者的中性糖與糖醛酸比例為2.15，顯著小于后者的8.40。黑茶多糖鐵及黑茶多糖的單糖組成相同，但DTPIC-HW和DTPIC-HP中的單糖組成比例發(fā)生不同變化；DTPIC-HP的側鏈長度有所增加，而DT PIC-HW的鏈長變短。由此表明，DTPIC-HP的化學組成和結構特性優(yōu)于DTPIC-HW。