向日葵抗鹽堿生理生化機(jī)制與生長發(fā)育特性分析

賈秀蘋 卯旭輝 梁根生 劉潤萍 劉 風(fēng) 王興珍

（1甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，730070，甘肅蘭州；2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，730070，甘肅蘭州）

土壤鹽堿化已成為影響全球農(nóng)業(yè)的嚴(yán)重問題，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失僅次于干旱，使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展受到威脅。據(jù)統(tǒng)計[1]，世界鹽堿地面積超過9億hm2，其中我國超過3600萬hm2，主要分布在西北、東北和華北濱海地區(qū)在內(nèi)的17個省（區(qū)）。土壤鹽堿化嚴(yán)重影響我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境，是制約現(xiàn)代農(nóng)業(yè)增產(chǎn)、增效和實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)良性發(fā)展的兩大土壤因素之一[2]。因此，研究植物的耐鹽堿機(jī)制、開發(fā)利用耐鹽堿植物資源、培育耐鹽堿作物且有效利用鹽堿地對于全球農(nóng)業(yè)發(fā)展及生態(tài)環(huán)境改善具有重要意義。

油用向日葵（簡稱油葵）屬菊科向日葵屬，是世界四大油料作物之一，也是我國第二大油料作物，其種植面積僅次于油菜。據(jù)統(tǒng)計[3]，我國有20多個省（區(qū)）種植向日葵，2016年我國向日葵種植面積為127.9萬hm2，2017年為117.07萬hm2，2018-2019年整體種植面積下滑較快，為91.8萬hm2。其中油葵種植面積約占40.0%，油葵由于其自身基因型及自然條件選擇等綜合因素的影響，具有抗旱、耐鹽堿、耐貧瘠和適應(yīng)性強(qiáng)等特性，是生物治理鹽堿地首選作物之一，所以素有抗鹽堿先鋒作物之美稱。

目前，油葵抗鹽堿研究主要集中在苗期生長特點(diǎn)[4]、植株體內(nèi)離子動態(tài)平衡[5]、生理指標(biāo)變化[6]以及成熟期含油率和脂肪酸變化[7]等。如陳炳東等[8]研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的升高，根系和地上部分的生長量顯著降低，根系活力呈先增后降的趨勢。劉杰[9]通過鹽堿脅迫對向日葵適應(yīng)機(jī)制影響比較發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫下植株體內(nèi)Na+含量急劇上升，破壞了植物細(xì)胞內(nèi)離子平衡。裴懷弟等[10]研究了混合鹽脅迫對油葵保護(hù)性酶活性、細(xì)胞膜透性及其主要農(nóng)藝性狀的影響，并發(fā)現(xiàn)在鹽堿脅迫下油葵各生理指標(biāo)間變化差異性顯著。也有研究者對向日葵進(jìn)行基因克隆及染色體定位[11]、遺傳圖譜構(gòu)建[12]、不同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控[13-15]、滲透劑水平的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[16]、脂膜結(jié)構(gòu)變化[17]以及抗性[18]等方面的研究?？傊?，鹽堿對作物的脅迫主要表現(xiàn)為影響作物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、光合作用減弱以及細(xì)胞膜透性增大等；植物對鹽堿逆境的響應(yīng)，主要表現(xiàn)為合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、提高抗氧化酶活性以及誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)等[19]。但有關(guān)油用向日葵F2群體抗鹽堿生理生化變異及抗鹽堿相關(guān)性分析研究鮮有報道。生物的耐鹽堿性往往是由多基因控制的數(shù)量性狀遺傳，其生理生化過程是基因間相互作用、共同調(diào)節(jié)的結(jié)果[20]。本研究針對基因間的互作對135株F2油葵抗鹽堿性相關(guān)的6個主要生理生化指標(biāo)及4個形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行測定與統(tǒng)計，分析了各指標(biāo)在鹽堿脅迫下生理生化的遺傳變異、分布以及形態(tài)指標(biāo)間的相關(guān)性等情況，為油用向日葵抗鹽堿遺傳研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)地概況

以油用向日葵雜交種隴葵雜2號母本Y05-222A（鹽堿敏感材料）和父本Y06-163R（高抗鹽堿材料）配制F1雜交種，以F1自交得到的135株F2為研究材料。于2018-2019年在甘肅省白銀市靖遠(yuǎn)縣五合鎮(zhèn)白塔村（104°58′～105°11′E，36°44′～37°1′N）開展試驗(yàn)，當(dāng)?shù)睾０?030m，年均無霜期150d，降雨量200～300mm。試驗(yàn)共設(shè)鹽堿脅迫及對照處理。鹽堿脅迫處理：2018年將親本、F1及F2分別種植于全鹽含量為2.381%、pH 8.27的鹽堿圃，2019年重復(fù)該試驗(yàn)；對照處理：2019年將親本、F1及F2分別種植于土壤全鹽含量為0.025%、pH 6.96的中性土壤。覆膜播種，地膜覆蓋寬度為0.60m，膜間距0.40m，行長6.00m、寬4.00m，小區(qū)面積24.00m2，每個小區(qū)種植8行，行距0.40m，株距0.33m。試驗(yàn)地前茬為玉米，施農(nóng)家肥50 000kg/hm2，復(fù)合肥250kg/hm2，田間管理同當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

2018年6月28日及2019年7月10日對處理的親本及F2種植小區(qū)的各材料隨機(jī)取樣20株，對F2進(jìn)行單株定株、掛牌和取樣，均設(shè)3次重復(fù)，然后對各取樣材料進(jìn)行農(nóng)藝性狀及生理生化指標(biāo)測定分析。

采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性[21]，采用愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶（POD）活性[22]，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定可溶性蛋白含量[23]，采用紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性[24]，采用硫代巴比妥酸顯色法測葉片丙二醛（MDA）含量[22]，采用磺基水楊酸法測定葉片脯氨酸（Pro）含量[24]。

1.3 綜合抗鹽堿系數(shù)統(tǒng)計

成熟期統(tǒng)計各處理株高、莖粗、葉片數(shù)、盤徑和產(chǎn)量等表型數(shù)據(jù)，計算綜合抗鹽堿系數(shù)。綜合抗鹽堿系數(shù)為各指標(biāo)抗鹽堿系數(shù)的均值，各指標(biāo)抗鹽堿系數(shù)=鹽堿脅迫條件下某性狀測量值/非脅迫條件下某性狀測量值×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Office 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并作圖，用SPSS軟件進(jìn)行方差分析、相關(guān)性分析、回歸分析以及通徑分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及F2群體主要生理生化特性分析

通過對親本Y06-136R（P1）和Y05-222A（P2）各生理指標(biāo)特性分析（表1）可知，2個親本間各指標(biāo)均達(dá)極顯著差異。除親本P1的MDA含量小于P2外，其余各指標(biāo)P1均大于P2，說明親本P1抗鹽堿能力大于P2。P1和P2的SOD活性分別為660.47和346.58U/mg，F(xiàn)2群體SOD活性變異范圍較大，為100.86～897.25U/mg，均值為552.61U/mg，介于雙親之間。親本P1和P2的POD活性達(dá)極顯著水平，F(xiàn)2群體POD活性變化為4.67～91.67U/g，均值為45.60U/g，高于雙親值。F2群體CAT活性均值為32.86U/g，其親本P1和P2的CAT活性分別為12.22和2.58U/g，F(xiàn)2群體均值明顯高于雙親值，且變異范圍較大，為2.39～66.00U/g。F2群體可溶性蛋白含量變化為9.79～41.67mg/g，均值為24.10mg/g，低于雙親值。親本P1和P2的Pro含量分別為146.15和95.67μg/g，親本間差異達(dá)極顯著，F(xiàn)2群體Pro含量均值為219.49μg/g，高于親本值。F2群體MDA含量均值為57.97μmol/g，高于雙親值。F2群體抗鹽堿系數(shù)均值為0.70，介于雙親之間，其變異范圍為 0.22～0.90。

2.2 F2群體主要生理生化特性變化分布

如圖1所示，F(xiàn)2群體中各指標(biāo)間存在較大的遺傳差異，并在一定范圍內(nèi)呈連續(xù)分布。同時對F2群體進(jìn)行偏度及峰度分析，結(jié)果顯示P＞0.05，說明各指標(biāo)值均符合正態(tài)分布。同時由表1可知，SOD活性及抗鹽堿系數(shù)在F2群體中的均值介于雙親之間。POD、CAT、Pro和MDA等指標(biāo)均高于雙親，可溶性蛋白含量低于雙親，其原因主要由超親分離所致。

圖1 F2群體相關(guān)指標(biāo)的次數(shù)分布Fig.1 Frequency distribution of related indicators for F2population

表1 親本及F2群體主要生理生化指標(biāo)變異及特異性分析Table 1 Performance and analysis of specificity of physiological indicators in the F2population and its parents

2.3 F2群體主要生理生化變化與抗鹽堿相關(guān)性分析

通過對F2群體抗鹽堿相關(guān)指標(biāo)及抗鹽堿系數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，各指標(biāo)間存在一定的相關(guān)關(guān)系。由表2可知，F(xiàn)2群體抗鹽堿系數(shù)與SOD、POD、CAT活性和Pro含量均呈極顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.3904、0.5256、0.2987和0.3298；與可溶性蛋白和MDA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為-0.2675和-0.3725。說明在一定范圍內(nèi)高活性的SOD、POD、CAT以及Pro含量與低含量的可溶性蛋白及MDA可作為油用向日葵抗鹽堿性能鑒定的指標(biāo)。

表2 F2群體各指標(biāo)與抗鹽堿相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis salt-alkali resistance coefficient and related indicators in the F2population

2.4 F2群體主要生理生化變化與抗鹽堿性回歸分析

對F2群體的SOD、POD、CAT活性及可溶性蛋白、Pro、MDA含量等6個指標(biāo)采用全因子組合最優(yōu)回歸，通過共線性判斷挑選出最優(yōu)回歸方程。Y=0.5356+0.0001X1+0.0039X2+0.0019X3-0.0015X4-0.0009X6。式中Y為抗鹽堿系數(shù)，X1為SOD活性，X2為POD活性，X3為CAT活性，X4為可溶性蛋白含量，X6為MDA含量。從方程可知，可溶性蛋白和MDA含量與抗鹽堿系數(shù)呈負(fù)相關(guān)，其方程回歸系數(shù)分別為-0.0015和-0.0009。

2.5 F2群體主要生理生化變化與抗鹽堿性通徑分析

由表3可知，F(xiàn)2群體POD、SOD、CAT活性及MDA、可溶性蛋白和Pro含量與抗鹽堿系數(shù)間的直接通徑系數(shù)分別為0.5003、0.1676、-0.1317、-0.1040、0.0657和-0.0384（正向表示促進(jìn)作用，負(fù)向表示抑制作用）。其中POD活性對抗鹽堿性能的影響最大，可溶性蛋白對抗鹽堿性能的貢獻(xiàn)較小。SOD、POD、CAT、可溶性蛋白、Pro和MDA與抗鹽堿系數(shù)總間接通徑系數(shù)分別為0.2228、0.0253、0.4303、-0.3333、0.3682、-0.2684。通過通徑分析與相關(guān)分析比較發(fā)現(xiàn)，SOD活性與抗鹽堿性的相關(guān)系數(shù)為0.3904，直接通徑系數(shù)為0.1676，間接通徑系數(shù)為0.3291，可見，SOD活性對抗鹽堿性能的影響主要是通過影響POD的活性而起間接作用。

表3 F2群體各指標(biāo)與抗鹽堿性通徑分析Table 3 Path analysis of salt-alkali resistance coefficient and its indexes of F2population

POD活性與抗鹽堿性的相關(guān)系數(shù)為0.5256，通徑系數(shù)為0.5003，可見，POD活性對抗鹽堿性的直接影響較大。CAT活性主要是通過POD活性對抗鹽堿性的間接影響較大，間接通徑系數(shù)為0.3343?？扇苄缘鞍着cPro含量均是通過POD和SOD活性對抗鹽堿性的間接影響，其總間接通徑系數(shù)分別為-0.3333和0.3682。MDA含量通過POD活性對抗鹽堿性的間接影響較大，間接通徑系數(shù)為-0.2985。

2.6 親本及F2群體主要外部形態(tài)特征的變異分析

對親本（P1、P2）株高、莖粗、葉片數(shù)和盤徑形態(tài)特征的分析（表4）可知，各指標(biāo)間均達(dá)顯著或極顯著差異，4個指標(biāo)均值均為P1大于P2。P1和P2的株高分別為148.30和96.53cm，F(xiàn)2群體株高變異幅度較大，為36.42～166.18cm，均值為110.98cm，介于雙親之間。F2群體莖粗變異范圍為0.54～2.25cm，均值為1.42cm，與親本P2莖粗值接近。葉片數(shù)與盤徑變異范圍分別為5.00～12.00和3.20～12.40cm，均值均介于雙親之間。

表4 親本F2群體主要形態(tài)特征變異分析Table 4 Analysis of morphological characteristics in parents and F2population

2.7 F2單株主要形態(tài)特征與抗鹽堿相關(guān)性分析

研究表明，F(xiàn)2單株各主要形態(tài)指標(biāo)間均達(dá)極顯著正相關(guān)。由表5可知，株高與葉片數(shù)、盤徑以及葉片數(shù)與盤徑相關(guān)系數(shù)分別為0.9150、0.9378和0.9238?？果}堿系數(shù)與各形態(tài)指標(biāo)間均成極顯著正相關(guān)關(guān)系，其與株高、莖粗、葉片數(shù)和盤徑間的相關(guān)系數(shù)分別為0.8501、0.8440、0.8786和0.8759，說明株高、莖粗、葉片數(shù)以及盤徑均可作為抗鹽堿性強(qiáng)弱的主要衡量指標(biāo)。

表5 抗鹽堿系數(shù)與F2群體形態(tài)特征相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of salt-alkali resistance coefficient and morphological characteristics in F2population

3 討論

本研究通過對親本Y06-136R和Y05-222A各生理指標(biāo)特異性分析得出2個親本間各指標(biāo)值均達(dá)極顯著差異。同時對135份油葵F2群體的SOD、POD和CAT活性等6個生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定分析，各指標(biāo)在一定范圍內(nèi)呈連續(xù)分布。同時對F2群體進(jìn)行偏度及峰度分析，結(jié)果顯示P＞0.05，說明各指標(biāo)值均符合正態(tài)分布，表明了數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn)。

通過對油用向日葵F2群體生理生化指標(biāo)間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，各個指標(biāo)并非獨(dú)立的對某個性狀起作用，而是指標(biāo)間以相互關(guān)聯(lián)的方式作用于某些性狀。本研究表明，油用向日葵F2群體的抗鹽堿系數(shù)與可溶性蛋白及MDA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與POD、SOD和CAT活性以及Pro含量呈極顯著正相關(guān)。相關(guān)研究[25]報道，植物在逆境條件下，膜脂的過氧化作用產(chǎn)生MDA，通過MDA含量可分析膜質(zhì)過氧化程度，因此，MDA含量可作為研究植物對逆境條件反應(yīng)強(qiáng)弱的指標(biāo)?？梢娫邴}堿逆境條件下降低MDA含量，使質(zhì)膜過氧化程度變小，有利于提高油葵的抗鹽堿性。相反，在逆境條件下增加MDA含量，質(zhì)膜過氧化程度加大，質(zhì)膜通透性增加，抗鹽堿性減弱。同時提高POD、SOD、CAT活性以及Pro積累量，有利于提高油葵的抗鹽堿性能。

通徑分析是表示變量間因果關(guān)系程度的一個指標(biāo)，通徑系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)化的偏回歸系數(shù)。通過對F2群體各生理生化指標(biāo)的通徑分析，發(fā)現(xiàn)各指標(biāo)抗鹽堿相關(guān)系數(shù)與總間接通徑系數(shù)一致，說明各指標(biāo)對抗鹽堿性的作用主要是通過對其他指標(biāo)的影響而起間接作用，這與相關(guān)性分析結(jié)果一致。直接通徑系數(shù)中，CAT、Pro與抗鹽堿系數(shù)成負(fù)相關(guān)，這與相關(guān)性分析有差異，主要是由于CAT和Pro對F2群體抗鹽堿性自身的貢獻(xiàn)率較小或成負(fù)貢獻(xiàn)，但通過對其他各指標(biāo)的正向影響而提高群體的抗鹽堿性。可溶性蛋白含量本身對F2群體的抗鹽堿性有提高作用，但對其他指標(biāo)有抑制作用，所以總體對F2群體的抗鹽堿性表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。其他各指標(biāo)對油葵抗鹽堿性是通過直接和間接影響共同起作用。通徑分析更直觀、具體、明了地體現(xiàn)各指標(biāo)間的相互關(guān)系。

通過對F2單株形態(tài)特征分析研究發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫直接影響植物的形態(tài)建成和生長發(fā)育。逆境使細(xì)胞的正常分裂受到影響，從而抑制植物的生長發(fā)育以及生物量的積累，使株高降低、莖粗變細(xì)、葉片數(shù)減少和盤徑變小。本試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，油用向日葵的抗鹽堿性與株高、莖粗、葉片數(shù)及盤徑各形態(tài)指標(biāo)間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，這表明株高、莖粗、葉片數(shù)以及盤徑可作為油用向日葵抗鹽堿衡量的主要形態(tài)指標(biāo)。同時觀察發(fā)現(xiàn)抗鹽堿性強(qiáng)的植株葉片的表皮毛較發(fā)達(dá)且多具角質(zhì)層，葉片厚度較大。

因此，植物的生長、發(fā)育與其所處環(huán)境密不可分，在逆境環(huán)境中通過調(diào)節(jié)自身生理生化指標(biāo)，以及形態(tài)特征的變異增加對逆境的忍耐度和適應(yīng)性。宏觀的表現(xiàn)特征蘊(yùn)涵著微觀的基因調(diào)控機(jī)制，主要表現(xiàn)為影響植物的形態(tài)特征，以及光合作用減弱和細(xì)胞膜透性增大等[26]。

Zhu等[27]研究發(fā)現(xiàn)，性狀間的顯著相關(guān)與相應(yīng)的部分QTL間存在一定的連鎖或一因多效，所以對上述生理生化及形態(tài)特征各指標(biāo)間的相關(guān)性分析可進(jìn)一步了解指標(biāo)間的相互關(guān)系，為以后油用向日葵抗鹽堿分析提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

通過鹽堿脅迫對油葵親本Y06-136R和Y05-222A以及135份F2群體的SOD、POD和CAT活性等6個生理指標(biāo)特異性、抗鹽堿系數(shù)和單株形態(tài)特征等進(jìn)行系統(tǒng)分析。發(fā)現(xiàn)無論是親本還是后代群體各生理指標(biāo)并非獨(dú)立對某個性狀起作用，而是各指標(biāo)間以相互滲透，相互關(guān)聯(lián)的方式共同作用于某些性狀。其中抗鹽堿系數(shù)與POD、SOD、CAT活性以及Pro含量呈極顯著正相關(guān)，與MDA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步說明，逆境條件下油葵可通過自身調(diào)節(jié)以提高POD、SOD、CAT活性及Pro含量，降低MDA含量，可有效提高抗鹽堿性。

另外，通過表型與抗鹽堿系數(shù)相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，提高油葵的株高、莖粗、葉片數(shù)及盤徑可提高其抗鹽堿性，同時發(fā)現(xiàn)抗鹽堿性強(qiáng)的植株葉片表皮毛發(fā)達(dá)且蠟質(zhì)層增加，葉片肥厚。