高效液相色譜法測(cè)定復(fù)合果汁飲品中 茶氨酸的含量

程 倩，馮雪萍，陳 昭，李春陽(yáng)，張 雪，張海波*

（1.安琪紐特股份有限公司，湖北宜昌 443003；2.酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443003）

茶氨酸又名N-乙基-γ-L-谷氨酰胺[1]，是茶葉中特有的非蛋白氨基酸，也是茶葉中含量最高的游離氨基酸，占茶葉中游離氨基酸總量的50%左右[2]。自然界中存在的茶氨酸均為L(zhǎng)型，純品為白色針狀結(jié)晶，極易溶于水，不溶于乙醇和乙醚[3-4]。茶氨酸化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，將其溶液煮5 min或?qū)⑵淙苡趐H 3.0的溶液中，并于25 ℃下儲(chǔ)放12個(gè)月，茶氨酸含量能保持不變[5]。工業(yè)上生產(chǎn)茶氨酸的方法主要有茶愈傷組織培養(yǎng)法、茶葉提取法、化學(xué)合成法以及微生物酶法等[6-9]。茶氨酸具有甜味和鮮爽味，是茶葉鮮爽味的主要成分，味覺(jué)閾值為0.06%，即使在含量較低的情況茶氨酸也可以被感覺(jué)到[10]。

茶氨酸是一種安全、無(wú)毒、具有多種生理功能的食品添加劑，可抑制苦味物質(zhì)，改善食品的風(fēng)味，被廣泛用于飲料、點(diǎn)心、糖果、果凍等各類食品和膳食補(bǔ)充劑中[11-13]。此外，茶氨酸具有多種生理功能，如增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、降血壓、減肥、抗疲勞以及緩解焦慮、改善睡眠、提高認(rèn)知等作用[14-16]。2014年7月，茶氨酸被國(guó)家衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)為新食品原料。近年來(lái)，隨著茶氨酸生理活性研究的逐漸深入，其在國(guó)內(nèi)外功能性食品中的應(yīng)用也日益增長(zhǎng)[17-20]。

茶氨酸的定量分析方法主要有堿式碳酸銅沉淀法、非水滴定法、紙色譜法、薄層色譜法、分光光度法、氨基酸自動(dòng)分析儀法、毛細(xì)管電泳法、傅立葉變換近紅外光譜法、離子對(duì)色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法以及液質(zhì)聯(lián)用法等[21-23]，但實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)這些方法對(duì)某些成分復(fù)雜的樣品進(jìn)行測(cè)定時(shí)受干擾較大。本實(shí)驗(yàn)建立高效液相色譜法測(cè)定復(fù)合果汁飲品中的茶氨酸，以期能夠達(dá)到快速、準(zhǔn)確的分析要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

復(fù)合果汁飲品，安琪紐特股份有限公司提供。

茶氨酸對(duì)照品，純度99%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙腈為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 II 配備1260 Infinity Ⅱ蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；XS205DU分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；SB25-12DT超聲儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-Aq（4.6 mm×250 mm， 5 μm）或等效柱；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1； 進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流動(dòng)相A：100%純水；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫條件見(jiàn) 表1。

表1 梯度洗脫條件表

1.3.2 溶液配制

稀釋劑/空白溶液：純水溶液。

對(duì)照品儲(chǔ)備溶液：精密稱取茶氨酸對(duì)照品 10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加稀釋劑溶解，定容，渦勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

對(duì)照品工作液：分別精密量取一定體積的對(duì)照品儲(chǔ)備液，以稀釋劑稀釋定容，配制成濃度為 0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、 0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1和0.20 mg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

對(duì)照品溶液：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 0.1 mL，加稀釋劑稀釋定容至1 mL，配制成對(duì)照品濃度為0.1 mg·mL-1溶液。

空白輔料溶液：精密量取空白輔料原溶液1 mL（提前搖勻），置于10 mL容量瓶中，加入適量稀釋劑，超聲，定容，渦勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

輔料加標(biāo)溶液：精密量取空白輔料原溶液 0.1 mL，對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.1 mL，加稀釋劑定容至 1 mL，配制成對(duì)照品濃度為0.1 mg·mL-1溶液。

供試品溶液：取供試品1 mL（提前搖勻），置于10 mL量瓶中，加入適量稀釋劑，超聲，定容，渦勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別量取相應(yīng)體積的對(duì)照品儲(chǔ)備液，加入稀釋劑，配制成含茶氨酸0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、 0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1和 0.20 mg·mL-1的線性系列溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對(duì)照品實(shí)際濃度為橫坐標(biāo)（x），以峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 流速的選擇

取供試品溶液，在不同流速0.6 mL·min-1、 0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1和1.2 mL·min-1條件下，對(duì)茶氨酸分離情況進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，流速為 1.0 mL·min-1時(shí)，檢測(cè)運(yùn)行時(shí)間短，茶氨酸色譜峰與其他共存組分能很好分離，且峰形較好，因此色譜流速選擇1.0 mL·min-1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，茶氨酸線性方程為y=4 661.579x-3.113，R2為1.000，茶氨酸在0.01～0.20 mg·mL-1線性關(guān)系良好。

圖1 茶氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

取空白溶液、空白輔料溶液、對(duì)照品溶液、輔料加標(biāo)溶液和供試品溶液，按照1.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茶氨酸的保留時(shí)間為3.75 min，空白溶液和空白輔料溶液在目標(biāo)峰保留時(shí)間處均無(wú)干擾；對(duì)照品溶液、輔料加標(biāo)溶液、供試品溶液中相對(duì)應(yīng)的目標(biāo)峰的保留時(shí)間相差0.002，未超過(guò)±0.2 min范圍。供試品溶液中目標(biāo)峰與相鄰峰之間分離度大于1.5，專屬性良好。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 茶氨酸色譜圖

2.3.2 加標(biāo)回收率

精密稱取同一批次的復(fù)合果汁飲品9份，于棕色容量瓶中，分別加入不同體積的對(duì)照品儲(chǔ)備液，稀釋劑定容，渦勻，配制成80%、100%、120% 3個(gè)濃度的樣品加標(biāo)溶液，茶氨酸理論濃度分別為 0.104 mg·mL-1、0.131 mg·mL-1、0.157 mg·mL-1，每個(gè)濃度平行配制3份，過(guò)濾，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由表2可知，9份樣品加標(biāo)溶液中目標(biāo)物的回收率在98.2%～99.4%，滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）[24]要求。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.3.3 精密度

稱取6份供試品，按照1.3.2項(xiàng)，配制成6份供試品溶液，過(guò)濾，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由表3可知，6份供試品溶液茶氨酸含量的RSD為1.5%，滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）要求。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.3.4 定量限和檢測(cè)限

本實(shí)驗(yàn)采用信噪比法，取0.10%對(duì)照品溶液和0.05%對(duì)照品溶液，按照1.3.1項(xiàng)下色譜條件，記錄色譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.10%對(duì)照品溶液中茶氨酸主峰的S/N分別為10.4、11.7、13.5；0.05%對(duì)照品溶液中茶氨酸主峰的S/N分別為5.6、6.0、6.3，符合定量限和檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)信噪比法的要求，因此定量限為0.001 mg·mL-1，檢測(cè)限為0.000 5 mg·mL-1。

2.3.5 溶液穩(wěn)定性

取對(duì)照品和供試品溶液分別于室溫放置0 h、6 h、12 h、18 h、26 h和36 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。由表4可知，對(duì)照品溶液在36 h內(nèi)，茶氨酸的峰面積為0 h峰面積的99.5%～100.5%，溶液穩(wěn)定性良好；供試品溶液在36 h內(nèi)，茶氨酸的峰面積為0 h峰面積的95.6%～103.7%，溶液穩(wěn)定性良好，均滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》要求（GB/T 27404—2008）。

表4 溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.3.6 耐用性

取對(duì)照品溶液、供試品溶液，在1.3.1項(xiàng)色譜條件基礎(chǔ)上，分別調(diào)整柱溫和柱流速，柱溫調(diào)整范圍為±5 ℃，柱流速調(diào)整范圍為±10%。各色譜條件下，對(duì)照品溶液第一針色譜圖中，目標(biāo)峰的拖尾因子均為1.2；連續(xù)進(jìn)樣3針，柱溫30 ℃時(shí)茶氨酸峰面積的RSD為0.01%，柱溫40 ℃時(shí)茶氨酸峰面積的RSD為0.18%，流速0.9 mL·min-1時(shí)茶氨酸峰面積的RSD為0.13%，流速1.1 mL·min-1時(shí)茶氨酸峰面積的RSD為0.17%，滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）[13]要求，耐用性良好。

2.3.7 樣品測(cè)定結(jié)果

稱取6份復(fù)合果汁飲品，對(duì)其茶氨酸含量進(jìn)行了測(cè)定，樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。檢測(cè)值與該產(chǎn)品的標(biāo)示值的相對(duì)偏差在0.77%～3.85%，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）要求。

表5 樣品檢驗(yàn)結(jié)果表

3 結(jié)論

本研究建立了一種高效液相色譜法測(cè)定復(fù)合果汁飲品中茶氨酸的含量的方法。流動(dòng)相為100%純水和乙腈，梯度洗脫，最佳檢測(cè)條件為柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min-1。本方法樣品只需稀釋便可直接進(jìn)樣分析，茶氨酸的保留時(shí)間3.75 min，與其他色譜峰分離良好，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，易于推廣。