基于生物信息學及分子對接研究溫陽振衰顆粒治療慢性心力衰竭的潛在分子機制

姚昆鵬 劉起立 石靜 蔡子杰 蔡虎志 陳新宇

〔摘要〕 目的 利用生物信息學方法及分子對接技術預測溫陽振衰顆粒治療慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）的活性成分、作用靶點及相關生物學途徑。方法 利用TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫篩選溫陽振衰顆粒的活性成分及藥物潛在靶點，應用GeneCards、PharmGkb、TTD、DrugBank平臺檢索CHF的疾病靶點，采用Cytoscape 3.7.0軟件構建“成分-靶點”網(wǎng)絡圖，運行STRING平臺進行靶蛋白相互作用（protein-protein interaction， PPI）分析，運用R語言數(shù)據(jù)包進行基因本體功能富集（gene ontology， GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomics， KEGG）富集分析，預測其作用機制，最后運用AutoDockVina和PyMol軟件對溫陽振衰顆粒中的關鍵活性成分與PPI中的核心蛋白進行分子對接驗證。結果 共篩選溫陽振衰顆粒有效成分145種，涉及靶標238個?！八幬?成分-靶點”圖中篩選出關鍵活性化合物204個，其干預的PPI網(wǎng)絡主要涉及PTSG2、ESR1、CALM3等核心蛋白，GO及KEGG富集分析結果顯示溫陽振衰顆粒干預慢性心力衰竭主要涉及氧化應激反應、Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、細胞內(nèi)能量轉運等多種生物學途徑以及MAPK信號通路、p53信號通路、PI3K-Akt信號通路等相關通路。分子對接驗證提示槲皮素與核心靶蛋白JUN結合情況最佳，JUN是溫陽振衰顆粒中關鍵化學成分結合活性最優(yōu)的靶蛋白。結論 溫陽振衰顆粒中槲皮素、豆甾醇、山柰酚等多種關鍵有效成分可能作用于JUN、MAPK3、STAT3等多種核心靶蛋白，發(fā)揮干預CHF的藥理作用。

〔關鍵詞〕 溫陽振衰顆粒;慢性心力衰竭;生物信息學;分子對接;分子機制

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.09.010

Mechanism of Wenyang Zhenshuai Granule in Treatment of Chronic Heart Failure

Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

YAO Kunpeng1， LIU Qili1， SHI Jing1， CAI Zijie1， CAI Huzhi2， CHEN Xinyu1，2*

（1.Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective Bioinformatics method and molecular docking technology were used to predict the active components， targets and related biological pathways of Wenyang Zhenshuai Granule in the treatment of chronic heart failure （CHF）. Methods TCMSP and BATMAN-TCM database were used to screen the active components and potential drug targets of Wenyang Zhenshuai Granule. GeneCards， PharmGkb， TTD and DrugBank platforms were used to search the disease targets of CHF. Cytoscape 3.7.0 software was used to construct the "component-target" network diagram. STRING platform was used to analyze the protein-protein interaction （PPT）. R language data package was used to enrich gene ontology （GO） function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） to predict its mechanism. AutoDockVina and PyMol software were used to verify the molecular docking of key active components in Wenyang Zhenshuai Granule and core proteins in PPI. Results A total of 145 effective components of Wenyang Zhenshuai Granule were screened， involving 238 targets. A total of 204 key active compounds were screened out from the "drug-component-target" diagram. The PPI network intervened mainly involves core proteins such as PTSG2， ESR1 and CALM3. GO and KEGG enrichment analysis results showed that the intervention of Wenyang Zhenshuai Granule on CHF mainly involved multiple biological pathways such as oxidative stress response， Ca2+ homeostasis regulation， intracellular energy transfer， and MAPK signaling pathway， P53 signaling pathway， PI3K-Akt signaling pathway. Molecular docking verification showed that quercetin had the best binding with the core target protein JUN， and JUN was the target protein with the best binding activity for the key chemical components in Wenyang Zhenshuai Granule. Conclusion Quercetin， stigmasterol， kaempferol and other key active ingredients in Wenyang Zhenshuai Granule may act on JUN， MAPK3， STAT3 and other core target proteins， and play a pharmacological role in the intervention of CHF.

〔Keywords〕 Wenyang Zhenshuai Granule; chronic heart failure; bioinformatics; molecular docking; molecular mechanism

慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）是各種心臟結構或功能性疾病導致心室充盈和（或）射血功能受損而引起的一組綜合征[1]。據(jù)中國心血管健康與疾病報告編寫組推算，截至2021年，我國35～74歲成年人中約有890萬心衰患者，且心衰的患病率有逐年上升的趨勢[2]。由于慢性心力衰竭的患病率與死亡率較高，業(yè)已成為嚴重危害人民健康的一類心血管疾病。目前CHF的治療以藥物治療（如利尿劑、ACEI/ARB類藥物、β受體阻滯劑等）及手術治療（如主動脈內(nèi)球囊反搏術、心臟移植術、起搏器植入術等）為主要手段，藥物治療仍是CHF治療的重點和難點[3]。中醫(yī)藥具有療效高、副作用低的特點，在CHF的治療中具有廣闊前景[4]。

溫陽振衰顆粒是由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院陳新宇教授研制的院內(nèi)制劑。前期研究[5-6]表明，溫陽振衰顆?？擅黠@緩解患者癥狀，改善CHF患者的心功能。生物信息學是利用系統(tǒng)生物學與計算機技術進行研究的新方法。其具備從龐大、復雜的生物信息數(shù)據(jù)中挖掘出有價值的醫(yī)學信息的特點，對于新藥研發(fā)、揭示復雜的生物學過程和病理狀態(tài)具有一定的意義[7]。本文利用生物信息學方法及分子對接技術，探討溫陽振衰顆粒治療CHF的作用機制，為后續(xù)的藥理學及基礎研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1? 有效成分篩選及作用靶標預測

溫陽振衰顆粒為湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由7味中藥組成：制附子、干姜、茯苓、紅參、麥冬、五味子、甘草。利用中藥系統(tǒng)藥理學平臺TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索上述6味中藥的有效成分及相應靶點，以口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%和類藥性（drug-likeness， DL）≥0.18作為篩選條件;BATMAN-TCM在線分析平臺（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/），設定預測候選目標（包括已知目標）得分不小于每個成分得分分界的20%，Adjust P-value設為0.05，獲取麥冬的活性成分和相應潛在靶點。使用UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）獲取靶點官方基因名。

1.2? 疾病靶點的收集

使用“chronic heart failure”作為關鍵詞，檢索GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）、TTD （http：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/）疾病數(shù)據(jù)庫，獲取CHF的疾病靶點。將在GeneCards中獲得的疾病靶點按照相關性評分（relevance score）≥1進行過濾。

1.3? 藥物-疾病核心作用基因篩選

為明確溫陽振衰顆粒主要活性成分的預測靶點與CHF疾病靶點的相互作用，通過Perl軟件，將溫陽振衰顆粒的預測靶點與CHF的相關靶點取交集，獲取藥物-疾病關鍵作用基因，得到藥物靶點與疾病差異基因的交集。將藥物靶點-疾病交集匯總成文件導入Cytoscape 3.8.0 軟件，運用其Network Analyzer功能，構建藥物-成分-靶點圖。

1.4? 靶蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡構建與拓撲分析

將獲得的交集靶基因導入STRING平臺（https：//string-db.org/），物種設定為“Homo sapiens”，combined score（最低互動得分）設置為0.9，并去除游離節(jié)點，得到蛋白互作網(wǎng)絡圖。由此得到溫陽振衰顆粒對治療CHF中排名前列的核心作用基因。利用Cytoscape 3.8.0 軟件，下載CytoNCA，進一步根據(jù)其網(wǎng)絡中心度進行拓撲分析。

1.5? 基因本體功能富集（gene ontology， GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomics， KEGG）富集分析

利用R語言DOSE、clusterProfiler、enrichplot、pathview等相關程序包對交集基因進行基因本體功能富集與京都基因與基因組百科全書富集分析，GO功能富集分析描述了基因產(chǎn)物可能形式的分子功能，參與的生物過程和所處的細胞環(huán)境。KEGG通路富集分析是指通過將已知的基因組注釋信息進行分類，得出最顯著的生物學過程。由此可以預測溫陽振衰顆?；钚猿煞种委烠HF的潛在作用機制。選擇顯著富集的生物學過程（biological process， BP）、細胞成分（cell component， CC）、分子功能（molecular function， MF）前10項繪制柱狀圖;選擇顯著富集的前30條通路繪制氣泡圖。

1.6? 分子對接

選擇藥物-成分-靶點中排名前3的活性化合物作為小分子配體：槲皮素（quercetin）、豆甾醇（stigmasterol）、山柰酚（kaempferol）。與PPI網(wǎng)絡拓撲分析后所獲取的19個關鍵靶點的前3個靶點蛋白，即JUN、MAPK3、STAT3進行分子對接。在PubChem CID 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載有效成分的2D結構的SDF文件，利用PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www1.rcsb.org/）下載核心基因相關蛋白的 2D 結構，運用PyMOL軟件移除靶蛋白中的配體和非蛋白分子（如水分子），再保存為pdb格式文件。再使用AutoDock Tools1.5.6 軟件將晶體結構進行加氫處理，并且對蛋白質進行電荷計算，所有配體和受體文件均保存為pdb格式。使用Autodock Vina軟件進行分子對接，并計算最低結合能，使用PyMol 軟件生成分子對接模型圖。

2 結果

2.1? 有效成分篩選及作用靶標預測

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以OB≥30%，DL≥0.18為條件進行溫陽振衰顆粒的有效成分篩選，共檢索到化合物145種，其中附子21種、干姜5種、茯苓15種、紅參4種、五味子8種、甘草92種。使用BATMAN-TCM在線分析平臺進行補充，獲取麥冬化合物18種。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫對有效成分對應的靶點進行標準化轉換，選擇“Reviewed”“Human”，下載標準靶點名。通過匹配并刪除重復值，最終獲得靶點238個。

2.2? 疾病靶點的收集

檢索GeneCards、PharmGkb、TTD、DrugBank疾病數(shù)據(jù)庫，最終得到CHF靶點個數(shù)分別為10 151、290、16、13、13個，篩選并去除重復值后得到靶點10 186個。藥物靶點與疾病靶點交集為204個。見圖1。

2.3? 篩選藥物-疾病核心作用基因

將溫陽振衰顆粒的預測靶點與CHF的相關靶點取交集，再導入Cytoscape 3.8.0軟件，運用其內(nèi)置的Network Analyzer功能，構建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡圖。根據(jù)連接度（degree）調(diào)節(jié)網(wǎng)絡中節(jié)點（靶基因）的面積大小、顏色深淺和排序;最低互動得分的大小則通過連線的粗細表示，最終得到“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡圖（圖2）。圖中共計522個節(jié)點，2 005條邊。由圖2可知，甘草、麥冬的有效成分中對應最多的相關靶基因，有效成分槲皮素、豆甾醇、山柰酚分別與130、97、54個靶點相關。其中，PTSG2 （92個）是有效成分對應靶點數(shù)量最多的基因，其次是ESR1 （80個）和CALM3 （71個）。

2.4? PPI網(wǎng)絡構建與拓撲分析

將篩選的溫陽振衰顆粒與CHF的204個共同靶點提交至STRING平臺，物種先定位“Homo sapiens”，再將最低互動得分設置為0.9，去除游離節(jié)點后，最終得到溫陽振衰顆粒干預CHF的PPI網(wǎng)絡。將STRING數(shù)據(jù)庫生成的文件通過Cytoscape 3.8.0可視化（圖3）。該網(wǎng)絡中涉及174個節(jié)點，801條邊。通過Cytoscape 3.8.0的CytoNCA進行拓撲分析，選擇相關指標：介度中心性（betweenness centrality， BC）、接近中心性（closeness centrality， CC）、借助度中心性（degree centrality， DC）、特征向量中心性（eigenvector centrality， EC）、局部邊連通性（local average connectivity， LAC）和網(wǎng)絡中心性（network centrality， NC），對基因相關指標進行篩選，選擇大于所有指標中位數(shù)的基因進行后續(xù)分析，經(jīng)過2次篩選，最終獲得核心基因19個，按照DC進行排序，前10位的核心基因分別是JUN、MAPK3、STAT3、MAPK1、FOS、MAPK1、MYC、AKT1、ESR1。見圖4。

2.5? GO與KEGG富集分析

利用R語言Dose、ClusterProfiler、enrichplot、pathview、ggplot2等相關程序，將溫陽振衰顆粒204個潛在靶點進行基因富集分析，得到GO富集條目2 777個，其中包括2 445個生物過程、94種細胞成分和238種分子功能。KEGG通路共計183條。各選取BP、CC、MF排名前10的GO條目繪制柱狀圖，取KEGG前30的條目繪制氣泡圖（圖5）。通過查閱文獻，剔除與慢性心衰完全無關的條目，在GO富集中發(fā)現(xiàn)氧化應激反應、Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、細胞內(nèi)能量轉運、急慢性炎癥反應、線粒體膜通透性調(diào)節(jié)、兒茶酚胺釋放、心肌細胞表型改變等生物過程均在溫陽振衰顆粒治療CHF中發(fā)揮重要作用。KEGG富集分析顯示，與CHF相關的通路主要有MAPK信號通路、p53信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路、cAMP信號通路、mTOR信號通路等。見圖6。

2.6? 分子對接

選取“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡中與靶點互動關系最為密切的前3個主要活性化合物作為小分子配體：槲皮素、豆甾醇、山柰酚。與PPI網(wǎng)絡拓撲分析后所獲取的19個關鍵靶點的前3個靶點蛋白，即JUN、MAPK3、STAT3進行分子對接。使用Autodock Vina軟件進行分子對接，并計算各個蛋白與小分子配體的最低結合能。

使用PyMol軟件進行可視化分子對接模式圖，結果顯示，各化合物與蛋白對接的結合能均小于

-7.0 kcal·mol-1，說明各化合物與蛋白能結合較緊密。與JUN和MAPK3親和力最高的均為槲皮素，與STAT3親和力最高的為山柰酚和槲皮素。見表1和圖7。

3 討論

CHF并非中醫(yī)傳統(tǒng)病名，中醫(yī)根據(jù)CHF的發(fā)病癥狀，將其歸結為“心水”“水腫”“胸痹”“心悸”等病名[8]。中醫(yī)學認為，CHF的病性多屬本虛標實，本虛為陽氣虧虛為主，標實則以水飲、痰濁、血瘀為主[9]。對于CHF的治療，中醫(yī)學多以溫陽利水法、益氣健脾法、益氣活血法、益氣養(yǎng)陰法、清熱解毒法擬方遣藥[10]。溫陽振衰顆粒為湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院陳新宇教授研發(fā)的中藥成方制劑，藥物為制附子、干姜、茯苓、紅參、麥冬、五味子、甘草，秉承溫陽利水、益氣養(yǎng)陰之法，由仲景名方參附湯合生脈散化裁而來。經(jīng)臨床研究[5-6]表明，溫陽振衰顆粒可顯著減輕患者臨床癥狀，提高CHF患者生活質量，對于CHF之陽虛水泛證具有顯著作用。方中附子溫通陽，暖命門，溫坎水，破陰凝，為君藥?，F(xiàn)代藥理學研究表明，附子保護心肌的作用可能是通過調(diào)節(jié)心肌細胞能量代謝及鈣穩(wěn)態(tài)來實現(xiàn)的[11]。紅參性微溫、味甘，為人參蒸制后干燥者，具有大補元氣、復脈固脫之功，扶陽先益氣，取“無形之氣急當速固”之意。紅參中所含人參皂苷成分激活脂肪細胞系中STAT3/ PPARg/CEBPa信號通路，在體外發(fā)揮促進能量代謝的功效[12]。干姜與附子合用，回陽立效，具有顯著的抗心衰作用，其機制可能與升高心肌組織cAMP、PKA含量有關[13]。茯苓健脾滲濕，補后天脾土，其與干姜配伍，則土得火生，中焦陽氣得以上濟胸陽。研究[14]表明，茯苓具有對抗大鼠心肌損傷的作用，其機制與激活MAPK信號通路，調(diào)節(jié)下游ERK1/2、JNK、p38蛋白水平相關。麥冬養(yǎng)陰生津，配伍五味子，一滋一斂，斂陰而固陽，仿“生脈散”而立，恰合景岳之“陽得陰助則生化無窮”。藥理研究[15]表明，麥冬可下調(diào)IL-6、TNF-α、IL-1β等多種炎性蛋白，降低慢性心衰大鼠的炎癥刺激及氧化應激水平。五味子素具有促進心肌組織的恢復的功效，減輕脂多糖誘導的心肌細胞損傷，其機制是通過下調(diào)Smad3，從而調(diào)節(jié)下游的JNK及NF-κB蛋白，促進心肌細胞的修復[16]。結合課題組前期研究，秉承于“陽主陰從”理論化裁的溫陽振衰顆粒，其作用可能是通過介導MAPK、p53、PI3K-Akt、NF-κB、cAMP等多條信號通路，調(diào)節(jié)下游JUN、MAPK3、STAT3、MAPK1、FOS、MAPK1及IL-6等多種蛋白，從而減輕炎癥刺激，降低心肌氧耗，改善能量代謝，進一步抑制心肌細胞凋亡，延緩心室重塑。

溫陽振衰顆粒是湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，其療效與安全性已得到實踐證明，然而其具體作用機制并不完全明晰。本研究采用生物信息學分析及分子對接技術，對溫陽振衰顆粒干預CHF進行分子層面的探討。在CHF的病理生理學過程中，心肌細胞凋亡、心臟結構改變、心肌能量代謝障礙、心肌興奮-收縮耦聯(lián)障礙等被認為是主要的病理機制[17-18]，目前對于CHF的研究主要集中于細胞表型改變、能量代謝障礙等方面。結合相關文獻文獻，筆者發(fā)現(xiàn)，本研究所得出的關鍵靶點、通路與CHF的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。實驗表明，在CHF大鼠模型中，通過激活TGF-β信號通路，上調(diào)TGF-β1/Smad2/3信號轉導，c-JUN的表達隨之增加，進一步誘導了LOX的表達，從而加劇大鼠心肌纖維化[19]。炎癥刺激、氧化應激等作用，使得心肌細胞的自噬水平增高，并通過代償維持其細胞活力。然而，過度自噬引起心肌細胞數(shù)量的絕對不足，加重心肌細胞的病理性代償，最終加速CHF的病程[20]。在慢性心衰大鼠模型中對ERK1/2含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)ERK1/2水平與體內(nèi)炎癥水平及心肌細胞的自噬程度呈正相關，這提示ERK1/2可能與CHF的進程呈正相關[21]。進一步研究[22]表明，腎素-血管緊張素-醛固酮（renin angiotensin aldosterone system， RAAS）系統(tǒng)的激活與MAPK信號通路的激活呈正相關。接受手術干預后，MAPK通路受到抑制，NF-κB p65/IL-1β/TNF-α蛋白表達降低，提示MAPK/NF-κB/PI3K-Akt信號通路共同參與RAAS系統(tǒng)的激活，介導CHF的神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)[23]。此外，一項對大鼠心肌纖維化的研究[24]發(fā)現(xiàn)，當PI3K-Akt通路激活時，mTOR的磷酸化水平相應增高，心肌纖維化加劇，心臟進一步功能受損。而當PI3K-Akt抑制劑干預時，mTOR磷酸化水平隨之降低，心肌纖維化水平得到逆轉。

綜上所述，溫陽振衰顆粒主要成分及關鍵靶點可能通過激活/抑制MAPK、P53、PI3K-Akt、NF-κB、cAMP、mTOR等信號通路，調(diào)節(jié)下游JUN、MAPK3、STAT3、MAPK1、FOS、MAPK1、MYC、AKT1、ESR1、TNF-α、IL-1β、IL-6、Bax、Bcl-2、Caspase 3等蛋白表達，從而發(fā)揮抗RAAS激活、抗心肌細胞凋亡與自噬、抗心肌纖維化等作用，最終達到干預CHF的病理過程，以期為溫陽振衰顆粒的進一步實驗及臨床研究提供理論基礎。此外，本研究具有一定局限性，如本研究中涉及的成分與靶點可能局限于目前研究的熱點，數(shù)據(jù)庫收錄數(shù)量尚為不足，且涉及的相關機制本身還有待進一步進行研究驗證。

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