氨基糖苷類抗生素檢測技術(shù)的發(fā)展

孟 飛，周小華，袁耀佐*

1 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 210019;2 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023；3 國家藥品監(jiān)督管理局化學(xué)藥物雜質(zhì)譜研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210019

20 世紀(jì)40 年代氨基糖苷類抗生素被發(fā)現(xiàn)，隨后幾十年逐漸發(fā)展并應(yīng)用于臨床，用于治療各種各樣的感染。隨著臨床應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)各種氨基糖苷類抗生素存在不同程度的耳、腎毒性，導(dǎo)致該類抗生素的臨床應(yīng)用開始減少。隨著耐多藥病原體的出現(xiàn)，此類抗生素又重新煥發(fā)了生機(jī)[1]。為保證其臨床應(yīng)用安全、合理、有效，將藥物分析與其結(jié)合可以有效實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制。早期對于氨基糖苷類抗生素的分析采用微生物鑒定、TLC 法，隨著高效液相色譜法的發(fā)展，新型檢測器開始用于氨基糖苷類抗生素的檢測，例如蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）、脈沖安培檢測器（PAD）、電噴霧檢測器（CAD）等，由于篇幅原因，本研究不對質(zhì)譜進(jìn)行介紹，僅介紹新型水凝聚核粒子計數(shù)蒸發(fā)光檢測器（NQAD）在氨基糖苷類抗生素領(lǐng)域的應(yīng)用，為其質(zhì)量檢測提供新的思路。

1 氨基糖苷類抗生素概述

氨基糖苷類抗生素（aminoglycoside antibiotics，AGs）是由氨基糖分子與氨基環(huán)醇通過醚鍵連接而成的苷類抗生素，分為天然和半合成兩大類。天然來源的包括由鏈霉菌屬培養(yǎng)液中提取獲得的鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素、大觀霉素等，由小單孢菌屬培養(yǎng)液中提取獲得的慶大霉素、西索米星、小諾米星等，英文名稱后綴一般分別為-mycin和-micin。半合成的氨基糖苷類抗生素是由發(fā)酵來源的氨基糖苷類抗生素為前體，通過結(jié)構(gòu)改造而得到，主要有阿米卡星、奈替米星、依替米星、地貝卡星、阿貝卡星等[2，3]。

AGs 是一類臨床上治療細(xì)菌感染的重要抗生素，其具有抗菌譜廣、殺菌效果強(qiáng)等特點(diǎn)。AGs 的抗菌機(jī)制主要通過干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)合成而發(fā)揮效果，包括抑制70S 始動復(fù)合物形成、與30S 亞基蛋白結(jié)合，導(dǎo)致氨基酸錯配和錯誤蛋白產(chǎn)生、阻止終止密碼子與核蛋白蛋白體結(jié)合等多種方式[4，5]。臨床上，AGs 對包括需氧革蘭陰性桿菌、金黃葡萄球菌、沙門桿菌等多種致病菌導(dǎo)致的感染具有較好的效果，同時抗生素后效應(yīng)以及與β-內(nèi)酰胺類抗生素協(xié)同作用使得AGs 更具臨床價值。盡管氨基糖苷類抗生素有著耳、腎毒性，但對于治療革蘭陰性菌引起的感染有著顯著效果，在臨床上有很重要的作用[6]。

2 氨基糖苷類抗生素檢測技術(shù)的發(fā)展

AGs 不含共軛結(jié)構(gòu)，多無紫外吸收，且具有極性強(qiáng)、揮發(fā)性差等特點(diǎn)，檢測相對困難。根據(jù)時間及其檢測能力、方法的變化可大致分為以下四個階段[3]：

第一階段：1970 年以前，微生物檢定法，主要用于評價產(chǎn)品的效價，既無組分控制也無有關(guān)物質(zhì)檢查。

第二階段：1970～1990 年，以“半定量法控制雜質(zhì)限度”為主，例如TLC 法，在柱層析等技術(shù)應(yīng)用前被廣泛用于抗生素相關(guān)物質(zhì)的限度控制。

第三階段：1990～2003 年，衍生化色譜聯(lián)用檢測技術(shù)“間接檢測”主成分純度。氨基糖苷類抗生素絕大部分沒有紫外吸收或者有很弱的末端紫外吸收，因此衍生化成為此類抗生素早期質(zhì)量控制常用技術(shù)，通過衍生化試劑與待測物發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生有紫外吸收的基團(tuán)。

第四階段：2003 年后，HPLC-非衍生化法“直接檢測”主成分和/或有關(guān)物質(zhì)。檢測技術(shù)的發(fā)展使得包括HPLC-ELSD 和HPLC-PAD 等非衍生化檢測技術(shù)被用于AGs 組分和有關(guān)物質(zhì)的控制與評價，并逐漸成為主流選擇。隨著HPLC 法應(yīng)用范圍的擴(kuò)大以及檢測技術(shù)的進(jìn)步，檢測器的種類也越來越多，其靈敏度和重現(xiàn)性越來越好。新型氣溶膠檢測器如CAD、水凝聚核粒子計數(shù)蒸發(fā)光檢測器（NQAD）的出現(xiàn)，可以彌補(bǔ)ELSD 和PAD 的不足，為氨基糖苷類抗生素的檢測提供更多選擇性。

目前國內(nèi)外藥典中AGs 質(zhì)量控制的主要檢測手段包括微生物檢定、TLC、衍生化HPLC-UV、HPLC-ELSD、HPLC-PAD 等，見表1。

表1 氨基糖苷類抗生素在現(xiàn)行藥典中收載情況以及組分及/或有關(guān)物質(zhì)測定一覽[3]

2.1 微生物檢定法

微生物檢定法是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，采用量反應(yīng)平行線原理，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價，該方法被各國藥典廣泛采用于AGs 的含量測定。

微生物檢定法具有設(shè)備簡單、價格低廉、適于推廣使用等優(yōu)點(diǎn)，而且直觀地反映了樣品的抗菌能力，符合臨床治療要求。但一方面整個檢測存在周期長且程序復(fù)雜、干擾因素多等缺點(diǎn)，另一方面微生物檢定法選擇性差，該方法反映的是藥物的總效價，不僅包括抗生素，其雜質(zhì)和副產(chǎn)物等有可能存在抗菌活性。因此該方法反映不出產(chǎn)品間的質(zhì)量差別，不能達(dá)到監(jiān)控藥品質(zhì)量的目的。

2.2 薄層色譜法（TLC）

薄層色譜法系將供試品溶液點(diǎn)于薄層板上，在展開容器內(nèi)用展開劑展開，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的對照物按同法所得的色譜圖對比，并可用薄層掃描儀進(jìn)行掃描，用于鑒別、檢查或含量測定[7]。

該方法設(shè)備簡單、操作簡便快捷、結(jié)果直觀、兼具分離鑒定雙重功能等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于藥物分析[8]。但存在影響因素多，靈敏度差，定量困難等問題，且薄層板的質(zhì)量、顯色劑用量、外界環(huán)境因素對層析行為的影響、操作技巧等均會影響色譜質(zhì)量，產(chǎn)生結(jié)果誤差。

2.3 衍生化HPLC-UV/FLD 法

由于氨基糖苷類抗生素結(jié)構(gòu)中缺少生色團(tuán)/助色團(tuán)和熒光團(tuán)，直接采用紫外檢測器和熒光檢測器通常難以檢測，因此需要采用衍生化的方法為氨基糖苷類抗生素引入生色團(tuán)/助色團(tuán)和熒光團(tuán)，以利于檢測。衍生化HPLC-UV/FLD 法是利用氨基糖苷類抗生素結(jié)構(gòu)中的活潑基團(tuán)(如氨基、羰基)與衍生化試劑形成紫外區(qū)、使之有吸收或有熒光的官能團(tuán)，以便于紫外檢測或熒光檢測[9]。衍生化方法可分為柱前衍生和柱后衍生兩種。柱前衍生是將待測物與衍生化試劑進(jìn)行反應(yīng)，使待測物具有生色團(tuán)或熒光團(tuán)，其優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)條件、反應(yīng)時間以及衍生化試劑不受色譜條件的影響，同時柱前衍生也不需要多余的儀器設(shè)備；缺點(diǎn)是操作繁瑣，定量不準(zhǔn)確。柱后衍生是通過柱后衍生儀器將衍生化試劑與待測分析物在儀器中進(jìn)行反應(yīng)然后進(jìn)行檢測，優(yōu)點(diǎn)是減少人為誤差、操作簡便，可以實(shí)現(xiàn)自動化控制；缺點(diǎn)是需要額外的儀器設(shè)備，同時對于衍生化試劑也有限制[9-11]。在早期美國藥典、英國藥典、歐洲藥典、中國藥典中，衍生化方法一直有著重要作用。例如早期各國藥典通過衍生化方法對硫酸慶大霉素質(zhì)量進(jìn)行控制。2020 版《中國藥典》[7]采用衍生化方法對阿米卡星進(jìn)行質(zhì)量控制。由于硫酸依替米星沒有紫外吸收，張玫等[9]采用柱前衍生測定其含量，趙敬丹等[12]采用HPLC-FLD 法建立了硫酸卡那霉素注射液有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制方法。但是由于衍生化法操作復(fù)雜耗時；各種實(shí)驗(yàn)因素須進(jìn)行優(yōu)化研究;衍生條件難以控制，重復(fù)性低；衍生化反應(yīng)復(fù)雜，一種樣品可能產(chǎn)生多種衍生產(chǎn)物，且衍生試劑也會干擾檢測，從而無法明確判斷檢測到的雜質(zhì)的來源[13]。

2.4 HPLC-ELSD 法

ELSD 通常由3 部分組成，即霧化器、漂移管和光散色池。此類檢測器屬于質(zhì)量通用性檢測器，待測物質(zhì)不需要具備生色團(tuán)或螢光團(tuán)，它是根據(jù)待測物通過光散色池，激光照射待測物，則待測物對光進(jìn)行散射，通過檢測器將光信號轉(zhuǎn)化為電信號。其檢測過程分為3 個步驟：霧化、蒸發(fā)、檢測。霧化階段：將色譜柱洗脫出來的液體通過氮?dú)膺M(jìn)行噴霧形成小液滴；蒸發(fā)階段：流動相包裹待測物形成的小液滴通過漂移管，揮發(fā)性的流動先被蒸發(fā)形成待測物小顆粒；檢測階段：待測物小顆粒通過激光對光進(jìn)行散射，檢測器將光信號轉(zhuǎn)化為電信號，從而記錄色譜圖。蒸發(fā)光散射檢測器的優(yōu)點(diǎn)是待測物不需要具有生色團(tuán)或熒光團(tuán)，缺點(diǎn)是其根據(jù)光的散射對待測物進(jìn)行檢測，不同的物質(zhì)具有不同的光散射強(qiáng)度，同時由于顆粒大小程度的不同，對光的散射程度也不一樣，這就導(dǎo)致不同物質(zhì)響應(yīng)不一樣。另外，對待測物和流動相也有特殊要求，比如待測物需要具有不揮發(fā)性或半揮發(fā)性的性質(zhì)，流動相要具有揮發(fā)性，這大大限制了流動相的選擇，如果一些雜質(zhì)分離度達(dá)不到要求，可能需要添加一些離子對試劑，離子對試劑的選擇也要具有揮發(fā)性，導(dǎo)致選擇范圍變窄，又比如調(diào)節(jié)流動相的pH，也要求酸或堿具有揮發(fā)性，同時酸堿的加入也會引起基線噪音變大；另外待測物峰面積與濃度不成線性關(guān)系，而是對數(shù)關(guān)系，使計算繁瑣[14-16]。2020 版《中國藥典》中大部分氨基糖苷類抗生素的質(zhì)量控制采用HPLCELSD 法。姚永青等[17]采用HPLC-ELSD 法對硫酸慶大霉素顆粒中的C 組分進(jìn)行研究；趙衛(wèi)等[18]采用HPLC-ELSD 法建立了硫酸依替米星氯化鈉注射液有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制方法；鞏麗萍等[19]采用HPLCELSD 法建立了注射用鹽酸大觀霉素含量和有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制方法；趙敬丹等[12]采用HPLC-ELSD法建立了硫酸卡那霉素注射液有關(guān)物質(zhì)質(zhì)量控制方法；Wang J 等[20]采用HPLC-ELSD 法建立了硫酸蛭菌素有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制方法，將蛭菌素與相關(guān)雜質(zhì)分離度良好，同時通過HPLC-MS 對相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行了表征；王金鳳等[21]采用HPLC-ELSD 法建立了硫酸卡那霉素注射液含量測定方法。此方法在《中國藥典》中發(fā)揮了巨大作用，隨著應(yīng)用的深入，一些問題逐漸暴露出來，例如重復(fù)性及重現(xiàn)性不佳，其原因有儀器自身原因，如漂移管長時間使用易產(chǎn)生污染，光源長時間使用不穩(wěn)定，氣體流速不穩(wěn)定等；其次還有操作人員所致的人為誤差[3]。

2.5 HPLC-PAD 法

高效液相色譜-電化學(xué)法是根據(jù)電化學(xué)原理和物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行的，用于檢測在液相色譜中具有電活性的物質(zhì)，電化學(xué)檢測器有安培、極譜、庫侖和電導(dǎo)檢測器4 種，PAD 應(yīng)用較為廣泛，它是利用外加電壓，使待測物在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而產(chǎn)生電流[22]。PAD 檢測器靈敏度高，專一性強(qiáng)，可用于沒有紫外吸收或不能發(fā)出熒光、但具有電活性的物質(zhì)的檢測，例如糖醛、氨基糖和氨基酸等。同時操作簡單，對流動相的揮發(fā)性沒有要求，成為繼HPLC-UV 及HPLC-ELSD 后應(yīng)用前景廣泛的檢測器之一，許多國家也越來越關(guān)注電化學(xué)檢測器法。2020 版《中國藥典》采用HPLC-PAD 法對依替米星進(jìn)行質(zhì)量控制，BP 2021 版有5 類氨基糖苷類抗生素采用HPLC-PAD 法進(jìn)行質(zhì)量控制，USP43-NF38 有3 類氨基糖苷類抗生素采用HPLC-PAD 進(jìn)行質(zhì)量控制。王琰等[24]使用四電位HPLC-PAD 法測定鹽酸大觀霉素及有關(guān)物質(zhì)；熊雯等[25]采用HPLCPAD 法測定硫酸慶大霉素氯化鈉注射液中慶大霉素C 組分及有關(guān)物質(zhì)；朱曉玥等[26]采用HPLC-PAD法測定硫酸依替米星氯化鈉注射液中有關(guān)物質(zhì)。電化學(xué)檢測器的優(yōu)點(diǎn)是只要流動相不具有電化學(xué)活性即可，比ELSD 的流動相選擇范圍更加大，PAD對于流動相要求低，可根據(jù)需要添加酸堿鹽、離子對試劑、調(diào)節(jié)pH 值[23]；在檢測方面，相對于ELSD 有更高的靈敏度，更寬的線性范圍。電化學(xué)檢測器的缺點(diǎn)是重現(xiàn)性差，電極易污染氧化，例如早期各國藥典標(biāo)準(zhǔn)采用三電位波形，這就導(dǎo)致電極易老化，當(dāng)沉積的分析物的反應(yīng)產(chǎn)物留在電極表面，采用相對較高電位來清理電極，這就導(dǎo)致金氧化物的形成，抑制進(jìn)一步的反應(yīng)，導(dǎo)致檢測器的靈敏度和精度隨著時間的推移變得較差[27]。為了克服這些缺點(diǎn)，Ding Y 等[28]采用脈沖安培檢測新霉素，并對四電位波形進(jìn)行優(yōu)化。目前大多數(shù)脈沖安培采用四電位波形，這將減少金的損失，從而防止金電極的緩慢衰退，并提高了長期穩(wěn)定性和靈敏度。我國研究人員近年來嘗試?yán)盟碾娢坏腍PLC-PAD 對各類抗生素進(jìn)行檢測，建立符合我國藥典的檢測方法，并取得了長足的進(jìn)步。

2.6 HPLC-CAD 法

CAD 屬于氣溶膠檢測器的一類，檢測過程主要分為4 個部分：噴霧、蒸發(fā)、荷電、檢測。它的原理不同于其他類型的氣溶膠檢測器，主要是利用氮?dú)怆x子碰撞待測物質(zhì)，使其帶電并被監(jiān)測到。具體檢測原理如下：待檢測組分經(jīng)過色譜柱洗脫后進(jìn)入電噴霧檢測器，在霧化室通過氮?dú)鈬婌F形成小液滴，一些較大的液滴由于重力原因沉降經(jīng)廢液管流出，剩余的小液滴由流動相包裹，通過干燥管時揮發(fā)性的流動相會被蒸發(fā)掉，這時待測組分形成干燥的小顆粒并進(jìn)入采集器，采集器中的靜電檢測裝置采集所有的電荷，將其轉(zhuǎn)化為電信號，從而可以看出所帶電荷越多，電信號越強(qiáng)，同時帶點(diǎn)顆粒表面積越大，其所帶電荷越多，響應(yīng)值就越高[29，30]。目前國內(nèi)外藥典還沒有收載HPLC-CAD 用于氨基糖苷類抗生素的質(zhì)量控制方法（見表1）。Long Z 等[31]采用HILIC和電噴霧檢測器建立了阿普霉素及其雜質(zhì)的分析方法；Joseph A 等[32]建立了HPLC-CAD 法測定藥膏中硫酸慶大霉素及其有關(guān)物質(zhì)的方法；Stypulkowska K 等[33]采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用電噴霧檢測器測定了新霉素及其相關(guān)物質(zhì)；Stypulkowska K 等[34]利用HPLC-CAD 法同時測定了林可霉素、大觀霉素及其雜質(zhì)；Holzgrabe U 等[35]利用HPLC-CAD 并結(jié)合TOF-MS 對硫酸鏈霉素中的雜質(zhì)進(jìn)行鑒別。CAD 具有靈敏度高，重現(xiàn)性良好的優(yōu)點(diǎn)，待測組分具有不揮發(fā)或者半揮發(fā)性質(zhì)即可，流動相以及離子對試劑需要具有揮發(fā)性。但是CAD 也有其局限性，不能用于揮發(fā)性待測組分的檢測，同時待測組分的峰面積與濃度不成線性關(guān)系、信號與濃度動態(tài)范圍較窄。

2.7 HPLC-NQAD 法

NQAD 全稱為水凝聚核粒子計數(shù)蒸發(fā)光檢測器，其屬于氣溶膠檢測器的一類。其核心元件為水凝聚核粒子計數(shù)器，檢測過程分為噴霧、汽化、凝結(jié)、檢測4 個過程，前兩個過程與ELSD 和CAD 有相似之處。第三個階段是NQAD 的核心階段，待測組分經(jīng)色譜柱洗脫流出霧化形成小液滴，通過汽化變成干燥的小顆粒，這個階段通過水蒸氣將干燥小顆粒包裹長大到微米級別，通過激光脈沖計數(shù)器對待測物進(jìn)行定量。QAD 是一款質(zhì)量性檢測器，它的響性與待測組分的濃度呈正相關(guān)，與待測組分化學(xué)性質(zhì)無關(guān)，有較好的靈敏度，待測組分的峰面積與濃度成線性關(guān)系，這使得NQAD 計數(shù)更加簡便，同時NQAD 操作簡單，保養(yǎng)維護(hù)方便，靈敏度降低只需要更換“wick”即可。NQAD 屬于氣溶膠檢測器，待測組分需要具有不揮發(fā)或者半揮發(fā)性，流動相要具有揮發(fā)性。目前NQAD 也已應(yīng)用在氨基糖苷類抗生素的檢測中。許明哲[11]利用NQAD 進(jìn)行了硫酸慶大霉素C 組分的測定，其分離效果良好；王金鳳等[21]比較了HPLC-ELSD 法和HPLC-NQAD 法測定注射用硫酸卡那霉素含量，通過比較兩款檢測器，發(fā)現(xiàn)ELSD 的線性范圍比NQAD 更寬，NQAD 在較低濃度范圍形成良好的線性關(guān)系，靈敏度比ELSD 更高。

3 小結(jié)

AGs 為臨床上最為常用的抗感染藥物之一，此類藥物大多數(shù)無紫外吸收,抗生素微生物檢定法、高效液相色譜衍生化法及ELSD、PAD 是當(dāng)前各國藥典和文獻(xiàn)報道中測定該類藥物含量和/或有關(guān)物質(zhì)的主要方法。檢測器作為HPLC 法的重要部分，其中最常用的檢測器有紫外檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器、電噴霧檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器、安培檢測器、水凝聚核粒子計數(shù)檢測器等，檢測器的發(fā)展程度直接影響著HPLC 的技術(shù)進(jìn)步與發(fā)展速度。一般來說，選擇性和靈敏度是檢測器最重要的兩個要素。紫外檢測器只能檢測在紫外區(qū)有吸收的物質(zhì)，而且實(shí)驗(yàn)所用流動相在相應(yīng)區(qū)域無紫外吸收[36，37]。熒光檢測器只適用于能夠產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，對溶劑的純度、pH 值、樣品濃度、檢測溫度等有很高的選擇性[38]。流動相中溶解的氧氣及溫度對電化學(xué)檢測器檢測干擾較大。蒸發(fā)光散射檢測器不能用非揮發(fā)的緩沖鹽及表面活性劑，流動相中有機(jī)成分高時信號則可能被假性放大十幾倍，影響定量分析[15，16]。示差折光檢測器一般不能用于梯度洗脫[39]。電噴霧檢測器的響應(yīng)會受流動相組成的影響，特別在梯度洗脫時，流動相中有機(jī)相比例上升、響應(yīng)增大會影響分析[40，41]。但水凝聚核粒子計數(shù)檢測器彌補(bǔ)這一不足，最大限度兼顧檢測器的適用性和選擇性，它是通用型、高靈敏度檢測器，適用于幾乎所有物質(zhì)（揮發(fā)性物質(zhì)除外）的檢測，線性范圍寬且信號響應(yīng)具有質(zhì)量一致性，這種獨(dú)特的性質(zhì)可開拓液相色譜的新領(lǐng)域。