一測多評法同時測定促育生精合劑中6 種成分的含量*

馬大龍，姜國萍，王路平，于曉陽，孫向紅，劉洪玲

青島大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，青島 266003

“促育生精方”是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，是青島大學(xué)附屬醫(yī)院近年來針對弱精癥發(fā)病機(jī)理、中藥藥理及中藥治療少精、弱精癥而研發(fā)的方劑，臨床使用十幾年來有效率達(dá)85%以上[1]。全方由淫羊藿、菟絲子、巴戟天、知母、何首烏、沙苑子、仙茅、蛇床子、杜仲、山萸肉、黃精、土茯苓、知母、牛膝等16 味中藥配伍組成，主要用于治療少精男性不育癥。方中淫羊藿為君藥，補(bǔ)腎壯陽，祛風(fēng)除濕，主治腎虛陽痿、精冷不育；臣藥菟絲子，滋補(bǔ)肝腎、固精縮尿；佐以仙茅、巴戟天、蛇床子等藥材，溫陽益腎；輔以山萸肉、枸杞子、黃精、沙苑子等生精血；另從腎精虧虛、精道阻滯角度，新增土茯苓、黃柏、知母滋陰降火，牛膝、赤芍活血化瘀。全方諸藥配伍相得益彰，共奏補(bǔ)腎陽、益腎精，養(yǎng)血清熱，除濕祛瘀之功效[2，3]。

為了建立促育生精合劑的質(zhì)量評價體系，本實驗采用高效液相色譜一測多評法（HPLC-QAMS），以方中淫羊藿的有效成分淫羊藿苷作為內(nèi)參物，對合劑中金絲桃苷、沙苑子苷、落新婦苷、芒果苷、寶藿苷等多種黃酮類成分同時進(jìn)行含量測定，為該合劑的質(zhì)量穩(wěn)定性和臨床有效性提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與藥品、試劑

高效液相色譜儀（Primaide 6000 型，日本日立公司）；Zirbus 實驗室型冷凍干燥機(jī)（VaCo 2，德國IKA 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV8，德國IKA 公司）；SQP型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

對照品：淫羊藿苷（批號T05D9B76755，純度≥98%）、落新婦苷（批號Y20J9H66031，純度≥98%）、金絲桃苷（批號Y08N9X74602，純度≥98%）、沙苑子苷（批號KS0916CA14，純度≥98%）、芒果苷（批號P04M9F60454，純度≥98%）、寶藿苷（批號T19D9Z77828，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技公司；促育生精合劑（批號：20201208、20210113、20210209，規(guī)格250 mL/瓶），由本院提供。乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（WondaSil C18Superb 5 μm（4.6 mm×250 mm））；流動相：乙腈（A）-0.04%磷酸水溶液（C）（梯度洗脫：0～25 min，10%～15% A；25～55 min，15%～20% A；55～70 min，20% A；70～100min，20%～30% A；100～120min，30%～50% A；120～130 min，50%～60% A)；柱溫：30℃；檢測波長：359 nm；流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。液相色譜圖見圖1。理論塔板數(shù)不低于3000，分離度均大于1.5。表明淫羊藿苷、金絲桃苷、沙苑子苷、落新婦苷、芒果苷、寶藿苷6 種成分與相鄰色譜峰可較好分離，且陰性對照沒有干擾。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 對照品儲備液和混合對照品溶液的制備

精密稱取淫羊藿苷、金絲桃苷、沙苑子苷、落新婦苷、芒果苷、寶藿苷對照品各適量，分別制成0.310、0.472、0.673、0.315、0.242、0.431mg·mL-1的6 種對照品儲備液。精密量取6 種對照品儲備液各4mL，置于同一10 mL 的量瓶內(nèi)，甲醇定容；0.45 μm 微孔濾膜濾過，分別制成含上述化合物124.0、188.8、269.2、126.0、96.8、172.4 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液和陰性樣品溶液的制備

按照促育生精方處方組成作前期優(yōu)化工藝，進(jìn)行提取、濃縮，制得生藥量為1 g·mL-1的合劑；精密量取合劑5.0 mL，加甲醇20 mL，超聲提取30 min，補(bǔ)足失重，濾過，濾液通過0.45 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。

按照合劑制備方法，分別制備不含淫羊藿、菟絲子、沙苑子、知母、土茯苓的陰性樣品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液2、4、6、8、10、20 μL，注入液相色譜儀，以質(zhì)量（μg）為橫軸，峰面積為縱軸，計算線性回歸方程。結(jié)果各成分的濃度范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，見表1。

表1 6 種成分的線性回歸方程

2.4.2 進(jìn)樣精密度試驗 精取混合對照品溶液10μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測得淫羊藿苷、金絲桃苷、沙苑子苷、落新婦苷、芒果苷、寶藿苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.02%、2.00%、1.35%、0.33%、1.00%、0.05%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取20201208 批供試品適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12、24 h 后進(jìn)樣檢測，測得淫羊藿苷、金絲桃苷、沙苑子苷、落新婦苷、芒果苷、寶藿苷的峰面積RSD（n=6）分別為1.38%、1.82%、1.26%、1.91%、1.57%、1.54%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取20201208 批供試品適量，共6 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，測定6 種成分的色譜峰面積，計算淫羊藿苷、金絲桃苷、沙苑子苷、落新婦苷、芒果苷、寶藿苷成分含量的RSD（n=6）分別為0.93%、0.79%、1.14%、3.27%、3.63%、0.93%，表明該實驗重復(fù)性較好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密量取已知成分含量的同一批次供試品5.0 mL，共6 份，按已知含量100%的比例，加入混合對照品溶液2.0 mL（淫羊藿苷124.0 μg·moL-1、金絲桃苷188.8 μg·moL-1、沙苑子苷269.2 μg·moL-1、落新婦苷126.0 μg·moL-1、芒果苷96.8 μg·moL-1、寶藿苷172.4 μg·moL-1），按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算回收率：回收率=（加標(biāo)試樣測定值-試樣測定值）/加標(biāo)量×100%。

結(jié)果所測淫羊藿苷、金絲桃苷、沙苑子苷、落新婦苷、芒果苷、寶藿苷的平均加樣回收率及RSD 分別 為100.01%（2.57% ）、100.3%（2.32% ）、99.58%（2.22%）、99.11%（1.08%）、96.92%（1.88%）、98.97%（0.62%）。

2.5 相對校正因子（fs/i）的建立與考察

藥物在進(jìn)行多成分含量測定時，通常以所含某一穩(wěn)定、易得的成分對照品作為內(nèi)參物，從而建立該內(nèi)參與其它待測成分間的相對校正因子，其公式為：

注：fs/i為內(nèi)參物s 對待測成分i 的校正因子，其中As為內(nèi)參物對照品s 的峰面積或峰高，Cs為內(nèi)參物對照品s 的濃度，Ai為某種待測成分對照品i 的峰面積或峰高，Ci為某種待測成分對照品i 的濃度。

取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，進(jìn)樣體積設(shè)置為2、4、6、8、10、20 μL，記錄各對照品中各組分色譜峰的峰面積（A），根據(jù)公式fs/i=（Cs×As）/（Ci×Ai），以淫羊藿苷為內(nèi)參物，分別計算落新婦苷、金絲桃苷、沙苑子苷、芒果苷、寶藿苷的相對校正因子，結(jié)果見表2。

表2 樣品中待測成分的相對校正因子

2.6 不同儀器、色譜柱對fs/i 的影響

精密吸取“2.2”項下制備的混合對照品溶液適量，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，測定6 種成分的峰面積，對比考察Primaide 6000 型和Waters 2695 型2 種高效液相色譜儀的WondaSil C18Superb 5 μm（4.6 mm×250 mm）和Sepax Sapphire-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）2 種不同型號色譜柱對fs/i的影響，金絲桃苷、落新婦苷、沙苑子苷、芒果苷、寶藿苷的fs/i平均值分別為0.986 2、0.993 7、0.994 9、0.942 0、0.994 0；RSD 分別為1.63%、0.72%、0.62%、1.14%、0.69%，即不同儀器、不同色譜柱對所測成分的fs/i無顯著影響，即fs/i不依賴于儀器及色譜柱。

2.7 待測成分色譜峰定位選擇

HPLC-QAMS 法是對所含多個組分的中藥及其制劑中有效成分同時測定的一種方法，該法是建立在對待測目標(biāo)成分色譜峰準(zhǔn)確定位的基礎(chǔ)上，以內(nèi)參物淫羊藿苷色譜峰為基準(zhǔn)峰，采用相對保留時間值法對待測目標(biāo)成分色譜峰進(jìn)行定位，對比考察前述2 種不同儀器型號及色譜柱對金絲桃苷、落新婦苷、沙苑子苷、芒果苷、寶藿苷的相對保留時間值（RRT）的影響，平均值分別為0.4602、0.4769、0.6412、0.2237、1.2019min；RSD 分別為0.51%、1.32%、1.40%、2.75%、0.76%。

2.8 HPLC-QAMS 法與ESM 法含量測定比較

精密吸取3 個批次的供試品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。采用HPLC-QAMS 法與ESM 法分別計算供試品中各待測成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 兩種方法測定樣品中6 種成分的含量的比較（μg·mL-1）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

一測多評法通過中藥復(fù)方或中藥材中有效成分間內(nèi)在線性關(guān)系，以其中一種常見、易得的對照品做為內(nèi)參物，通過建立的fs/i，對其他待測成分的含量進(jìn)行同步測定。促育生精合劑由16 中藥組方，成分復(fù)雜。結(jié)合中藥質(zhì)量標(biāo)志物并遵循處方君臣佐使的配伍原則，分別選取合劑中君藥淫羊藿所含主要成分淫羊藿苷和寶藿苷，臣藥菟絲子、沙苑子所含主要成分金絲桃苷和沙苑子苷，佐藥土茯苓、知母所含主要成分落新婦苷和芒果苷，作為定量指標(biāo)成分，為有效評價合劑的整體質(zhì)量提供參考依據(jù)。

3.2 待測成分色譜峰定位方式選擇

在一測多評實驗中，待測成分色譜峰的定位主要有兩種方式：其一為相對保留值即利用待測成分與內(nèi)參物的保留時間的比值并結(jié)合相關(guān)圖譜進(jìn)行色譜峰的定位；其二在相同的分析條件下，當(dāng)色譜柱不同時，可利用待測成分的保留時間存在簡單的線性關(guān)系進(jìn)行測定[4]。第一種方法準(zhǔn)確性高，第二種方法則可提高保留時間的重現(xiàn)性，目前QAMS 法多采用第一種方法進(jìn)行色譜峰定位。本實驗以淫羊藿苷的保留時間相對值作為待測成分的定位標(biāo)準(zhǔn)，以此計算不同的儀器和色譜柱的相對保留時間Ti/s（Ti/s=tR待測成分/tR淫羊藿苷）。結(jié)果在不同的色譜儀和色譜柱下，測得各待測成分的相對保留時間Ti/s無顯著差異。

3.3 內(nèi)參物的選擇

促育生精合劑含有多種化學(xué)成分。根據(jù)補(bǔ)腎經(jīng)、益精氣的中醫(yī)理論，淫羊藿補(bǔ)腎壯陽、祛風(fēng)除濕，主治腎虛陽痿，精冷不育。淫羊藿常用于治療腎病[5]、陽痿[6]等癥。研究表明，淫羊藿總黃酮是淫羊藿最主要的活性成分，主要包括淫羊藿苷、淫羊藿次苷、淫羊藿新苷A～E、去甲淫羊藿苷、淫羊藿脂素等，其中以淫羊藿苷為主要成分[7]。淫羊藿苷能增加機(jī)體心腦血管血流量、促進(jìn)造血功能，并能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的激素，使其保持平衡狀態(tài)，同時促進(jìn)性腺的發(fā)育，對男性的生殖功能有重要作用[8，9]。研究表明，淫羊藿苷能改善血管性勃起功能障礙大鼠的勃起功能[10]。本實驗考慮到淫羊藿苷作為補(bǔ)腎助陽要藥，能夠促進(jìn)生殖系統(tǒng)的功能；同時淫羊藿苷在淫羊藿中含量相對較高，其對照品價廉易得，故選定淫羊藿苷作為內(nèi)參物來計算其他5 個待測成分的含量。

綜上，本研究首次建立了促育生精合劑中6 種成分的多指標(biāo)質(zhì)量評價模式，采用QAMS 法不僅達(dá)到了控制中藥整體質(zhì)量的目的，而且有效提高了中藥質(zhì)量控制的水平，降低了質(zhì)量控制的成本。QAMS法操作方便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性良好，可為促育生精合劑的質(zhì)量控制提供參考。