不同病毒載量乙型肝炎患者的肝功能與腸道微生態(tài)分布及數(shù)量變化的關(guān)系研究

徐文琦，唐曉琦

乙型肝炎（以下簡稱為“乙肝”）是由乙肝DNA病毒感染導(dǎo)致的肝臟炎性狀態(tài)。目前在我國仍有超過100萬人口感染乙型肝炎，若不給予有效治療，有高達40%患者可進展為肝硬化、肝癌，危及患者生命[1]。而乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）-DNA載量是預(yù)測HBV感染最具高靈敏度、特異度的指標(biāo)。而監(jiān)測乙肝患者肝功能指標(biāo)，可反映患者肝臟受損程度[2]。近年來，乙肝與腸道菌群相互作用受臨床廣泛關(guān)注。大量研究表明，乙肝患者腸道微生態(tài)失衡與疾病有關(guān)，隨著肝臟炎癥反應(yīng)機纖維化進展發(fā)揮推波助瀾的作用，從而影響肝功能[3]。因此，對乙肝患者腸道菌群結(jié)構(gòu)與肝功能全面深入的鑒定分析，將有助于乙肝患者的治療及預(yù)后。本研究將對乙肝患者的肝功能與腸道微生態(tài)進行探討，分析肝功能、腸道微生態(tài)與患者疾病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年1月-2021年1月經(jīng)宜興市人民醫(yī)院治療的乙型肝炎患者94例。其中男49例，女45例；年齡18～71歲，平均年齡（39.78±11.79）歲。根據(jù)乙型肝炎病毒（HBV）-DNA檢測結(jié)果將患者分為陰性組，陽性組。其中陰性組（HBVDNA載量<1.0×103copies/mL）29例，陽性組65例。參照楊莉等[4]文獻內(nèi)容將陽性組患者分為低、中拷貝組（1.0×103copies/mL≤血清HBV-DNA載量<1.0x 107copies/mL）共43例、高拷貝組（HBV-DNA載量≥1.0x 107copies/mL）共22例，同期選擇50例正常者為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》中相關(guān)乙肝診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②未使用影響腸道菌群、環(huán)境及肝功能的藥物、制劑。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并甲丙丁等肝炎病毒感染者；②合并重要臟器嚴(yán)重疾病。本研究通過醫(yī)學(xué)倫理學(xué)批準(zhǔn)（編號：倫審2021技015），所有受試者知曉研究意圖，簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 采集血液標(biāo)本抽取受試者空腹晨靜脈血5 mL，室內(nèi)放置2 h后，3000 r/min（離心半徑5.5cm）離心20 min，取上清液，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清HBV-DNA載量檢測采集患者500 μL血清于1.5 mL離心管中，再取100μL血清加入等量DNA濃縮液于1 mL離心管中，震蕩5 s混勻，6000 r/min（離心半徑7.5cm）離心20 s，除上清液，加30μL DNA提取液，靜置30 min后，震蕩8 s，置入100℃條件下的恒溫箱中10 min，再10000 r/min（離心半徑9.5cm）離心5 min，采用美國ABI的QuanStudio 3實時熒光定量PCR儀擴增，用乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司，最低檢出限濃度為30 copies/mL，最低定量濃度為100 copies/mL)、PCR-熒光探針法檢測血清HBV-DNA載量。根據(jù)結(jié)果顯示將94例患者分為陰性組29例、低、中拷貝組43例、高拷貝組22例。

1.2.3 肝功能指標(biāo)檢測取備用血液4 mL，用erb‐axl-1000全自動生化儀（廣州華埔生物科技有限公司）檢測肝功能水平，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ala‐nine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γglutamyl transpeptidase,γ-GT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)。

1.3 腸道微生態(tài)檢測

1.3.1 采集糞便樣本采集糞便樣本時，應(yīng)避免尿液污染。在1 h內(nèi)完成，采用一次性采樣勺取適宜量新鮮糞便樣本送至實驗室后，取其230 mg于EP管中，保存于-80℃冰箱中備用。

1.3.2 腸道菌群檢測取1 g糞便，4℃下復(fù)融，加入1 mL的PBS溶液震蕩5 min使其充分混勻，13000 r/min（離心半徑11.0cm）離心3 min，取沉淀；加入50 μL蒸餾水得到糞便懸浮液，加入50 μL的1%TritonX-100溶解糞便內(nèi)脂質(zhì)等物質(zhì)；置于100℃沸水中煮沸5 min，取出后立即置于冰水中冷卻；設(shè)計引物序列，并將其與16S核糖體核糖核酸（ribosomal Ribonucleic Acid,rRNA）全 序 列 在BLAST數(shù)據(jù)庫中進行驗證比較。引物序列見表1。

表1 不同菌種的引物序列

反應(yīng)體系：上游引物0.25 μL、下游引物0.25 μL、10×Buffer2.5 μL、4×dNTP（上海澤葉生物科技有限公司，貨號ZY51208A）2.0 μL、MgCl22.5 μL、Taq DNA聚合酶0.75 μL、DNA模板3 μL、SYBR GreenⅠ（10000×）2.5 μL、雙蒸水11.25 μL；利用美國ABI公司7500實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增和分析，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)，95℃，15s，60℃，1min，72℃，45s，87℃，5s，40個循環(huán)，72℃延伸10 min；在Blast基因庫中對比其特異性，然后用賽默飛ABI 7500型實時熒光定量PCR儀對腸道中常見幾種細(xì)菌進行定量測定，均以10～108copies/μL濃度的含有標(biāo)準(zhǔn)菌種16S rRNA基因片段的質(zhì)粒DNA構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)粒購自美國Invitrogen公司，取1 g糞便中細(xì)菌基因拷貝數(shù)的對數(shù)lg copies/g表示細(xì)菌數(shù)量，計算樣品中擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬、瘤胃球菌屬、梭菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、糞球菌屬、白色念珠菌、腸桿菌科細(xì)菌的含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0軟件。計數(shù)資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗比較，組間兩兩比較采用卡方分割法，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗比較，三組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），進一步組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；患者肝功能指標(biāo)與腸道微生態(tài)相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組研究對象一般資料比較各組研究對象一般資料比較，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組研究對象一般資料比較

2.2 各組受試者肝功能指標(biāo)水平比較三組受試者ALP水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；陽性組患者ALT、AST、γ-GT水平均高于陰性組、對照組（P＜0.05）；陰性組與對照組肝功能指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組受試者肝功能指標(biāo)水平比較

2.3 不同HBV-DNA載量患者腸道微生態(tài)數(shù)量比較低、中拷貝組和高拷貝組患者ALP、γ-GT水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而高拷貝組患者ALT、AST水平均高于低、中拷貝組（P＜0.05）。見表4。

表4 各組受試者肝功能指標(biāo)水平比較

2.4 各組受試者腸道微生態(tài)數(shù)量比較陽性組患者普雷沃氏菌屬、梭菌屬、腸桿菌科細(xì)菌、糞球菌屬、白色念珠菌數(shù)量均高于陰性組、對照組（P＜0.05），而擬桿菌屬、瘤胃球菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬低于陰性組、對照組（P＜0.05）；陰性組與對照組腸道微生態(tài)數(shù)量無顯著差異（P＞0.05）。見表5。

表5 各組受試者腸道微生態(tài)數(shù)量比較

2.5 各組受試者腸道微生態(tài)數(shù)量比較高拷貝組患者普雷沃氏菌屬、瘤胃球菌屬、梭菌屬、糞球菌屬、白色念珠菌數(shù)量均高于低、中拷貝組（P＜0.05），而擬桿菌屬低于低、中拷貝組（P＜0.05）。見表6。

表6 各組受試者腸道微生態(tài)數(shù)量比較

2.6 高病毒載量乙肝患者肝功能與腸道微生態(tài)變化的關(guān)系高病毒載量乙肝患者ALT、AST、γ-GT水平與擬桿菌屬、瘤胃球菌屬、乳酸桿菌屬呈負(fù)相關(guān)，與普雷沃氏菌屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬、糞球菌屬、白色念珠菌、腸桿菌科細(xì)菌呈正相關(guān)（P＜0.05）；ALP水平與肝功能指標(biāo)水平無關(guān)（P＞0.05）。見表7。

表7 高病毒載量乙肝患者肝功能與腸道微生態(tài)變化的關(guān)系

3 討論

3.1 受試者腸道微生態(tài)數(shù)量變化及高病毒載量乙肝患者腸道微生態(tài)分布乙型肝炎發(fā)生率高，患者病情若得不到有效控制易進展為肝癌或失代償期肝硬化，嚴(yán)重影響生活。有研究結(jié)果表明，乙肝患者機體內(nèi)存在不同程度的腸道微生態(tài)失調(diào)現(xiàn)象[6]。腸道菌群是人體重要定植菌群，具有免疫調(diào)節(jié)、防御病原體及代謝物質(zhì)等生理作用。當(dāng)菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時，機體腸道內(nèi)炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素釋放，腸道屏障遭受破壞，引發(fā)疾?。磺矣泻Υx產(chǎn)物可通過腸-肝軸運輸至肝臟，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)破壞及功能受損[7]。擬桿菌屬革蘭氏陰性菌，死亡溶解后會釋放出細(xì)胞壁中脂多糖，這可能與乙肝患者伴內(nèi)毒血癥有關(guān)。普雷沃氏菌屬表面的LPS可誘導(dǎo)炎癥因子基因表達，使炎癥反應(yīng)增強[8]。目前已被證明20種普氏菌屬下的細(xì)菌可會引起多部位感染[9]。糞球菌屬細(xì)菌可代謝短鏈脂肪酸，調(diào)節(jié)腸道免疫功能和物質(zhì)代謝，目前發(fā)現(xiàn)的瘤胃球菌屬細(xì)菌多數(shù)含有膽汁酸水解酶，與次級膽汁酸的產(chǎn)生密切相關(guān)，而膽汁酸可以刺激腸壁，破壞腸道微生態(tài)和機體免疫功能，影響機體對腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)[9]。白色念珠菌是寄生于人體口腔、腸道、陰道及皮膚表面的一種常見的念珠菌，一般情況下不引發(fā)疾病，但當(dāng)機體免疫功能下降時，易引起感染[10]。雙歧桿菌為有益菌，對機體健康有營養(yǎng)、生物屏障、免疫力增強等生理作用。乳酸桿菌屬是有益于人體健康的微生物，它可通過產(chǎn)生乳酸、過氧化氫和細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)，或通過競爭腸道黏附位點或小腸食糜內(nèi)的營養(yǎng)來抑制致病菌；通過誘導(dǎo)黏附素分泌細(xì)胞表面因子、蛋白質(zhì)及可溶性肽，或者通過阻止細(xì)胞凋亡等途經(jīng)來增強腸道的屏障功能，從而保護腸道[11]。作為腸道非優(yōu)勢菌群，腸桿菌科細(xì)菌在特定條件下會產(chǎn)生侵襲性并會對患者機體產(chǎn)生不良影響?，F(xiàn)有眾多研究表明，乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且隨著病情的發(fā)展而變化[12]。本研究結(jié)果顯示，陽性組患者普雷沃氏菌屬、梭菌屬、腸桿菌科細(xì)菌、糞球菌屬、白色念珠菌數(shù)量均高于陰性組、對照組，而擬桿菌屬、瘤胃球菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬低于陰性組、對照組。高拷貝組患者普雷沃氏菌屬、瘤胃球菌屬、梭菌屬、糞球菌屬、白色念珠菌數(shù)量均高于低、中拷貝組，而擬桿菌屬低于低、中拷貝組。故，不同程度病毒載量乙肝患者均存在不同程度腸道微生態(tài)數(shù)量失調(diào)情況，且腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)變化對肝臟組織產(chǎn)生一定程度損傷[13]。

3.2 乙肝患者肝功能分析血清HBV-DNA陽性表明HBV復(fù)制和有傳染性。血清HBV-DNA載量越高，病毒復(fù)制越多，傳染性較強。血清HBV-DNA載量、ALT、AST等指標(biāo)均是反映乙肝患者肝功能的重要指標(biāo)[14]。本研究結(jié)果顯示，陽性組患者ALT、AST、γ-GT水平均高于陰性組、對照組；而高拷貝組患者ALT、AST水平均高于低、中拷貝組；表明HBV復(fù)制可會影響肝功能指標(biāo)水平，與曹莉等[13]研究結(jié)果一致。分析其原因可能是HBV感染會引起肝細(xì)胞損傷，而肝細(xì)胞表面HBV抗原可引起人體的免疫應(yīng)答，造成肝細(xì)胞損傷。

3.3 高病毒載量乙肝患者肝功能與腸道微生態(tài)變化的關(guān)系目前有研究認(rèn)為，腸道菌群失調(diào)致肝炎機制主要與內(nèi)毒素生成增加、腸壁通透性增加及腸道屏障功能破壞密切相關(guān)[15]。當(dāng)腸道菌群發(fā)生失衡后，細(xì)菌及其產(chǎn)物容易移位到門靜脈，從而將肝細(xì)胞中的Toll樣受體信號激活，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，促進了肝炎發(fā)展[16]。故高病毒載量乙肝患者肝功能與腸道微生態(tài)變化呈相關(guān)性。其患者腸道微生態(tài)變化可致病毒載量呈高表達，導(dǎo)致肝功能受損，影響肝功能指標(biāo)水平變化。

3.4 不足之處本研究為樣本量小的單中心研究，需擴大樣本量進一步證實本研究結(jié)果。

綜上所述，高病毒載量乙肝患者肝功能與腸道微生態(tài)變化呈相關(guān)性。其患者病毒載越高，腸道微生態(tài)越紊亂，導(dǎo)致肝功能受損，影響肝功能指標(biāo)水平變化。