麻杏纖暢酥對便秘小鼠的通便作用及調(diào)控短鏈脂肪酸的保護作用研究

黃 華，丁旭楓，衛(wèi) 軍，蔣 捷，季利江

便秘是一種好發(fā)老年人的常見病[1]，長期便秘會導(dǎo)致大便干燥，直接損傷腸粘膜，引起肛裂和血便，而且便秘能顯著增加有毒物質(zhì)的積累，使得患直腸癌、結(jié)腸癌等相關(guān)癌癥的風(fēng)險有所增加[2-3]。便秘可以根據(jù)日常飲食、作息習(xí)慣逐步調(diào)節(jié)，但起效慢，且嚴重便秘患者的效果并不顯著[4]。如今有一些藥物能改善便秘，如番瀉葉、蘆薈、大黃、開塞露等，這些藥劑主要刺激腸蠕動、潤滑腸壁，從而達到排便目的。最近研究表明，頻繁使用這些藥物可以降低腸壁神經(jīng)感覺細胞的靈敏度，減緩排便反射，進而導(dǎo)致難治性便秘[5]。尋找具有通便潤腸功效的天然提取物、藥食兩用中藥或者補充膳食纖維，可能會獲得一種更安全、有效、經(jīng)濟的改善便秘的保健食品。

麻杏纖暢酥是南京中醫(yī)藥大學(xué)常熟附屬醫(yī)院自主研發(fā)的具有通便作用的功能性食品，服用方便，口感香甜。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，每日服用麻杏纖暢酥（25g/次，食用后喝水300 mL，3次/天，連續(xù)服用1周）可顯著改善痔病術(shù)后患者排便不暢的情況、促進恢復(fù)正常的腸道運動[6-7]。在本研究中，首先研究麻杏纖暢酥對便秘小鼠通便潤腸功效，并進一步從短鏈脂肪酸調(diào)控角度評價其發(fā)揮通便潤腸的潛在機制，以期為麻杏纖暢酥的進一步推廣提供堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料復(fù)方地芬諾酯購自北京中新制藥廠（批號：981315）；墨汁購自北京一得閣墨業(yè)有限責(zé)任公司（批號：190508）；乙酸標準品、丙酸標準品、異丁酸標準品、丁酸標準品、異戊酸標準品、戊酸標準品（批號：20021101），均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；乳果糖口服溶液（杜密克）購自Abbott Biologi‐cals B.V.(荷蘭)。75只SPF級健康雌性KM小鼠體質(zhì)量20～22 g，購自揚州大學(xué)，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2018-0001，實 驗 動 物 合 格 證 號：NO.201911910；小鼠進行1周適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由飲水采食，飼養(yǎng)溫度22±2℃，相對濕度45%～55%。電子天平購自德國賽多利斯集團（型號：BSA124SCW）；柱溫箱(型號：1260-G13116A)、色譜泵(型號：1260-G1311C四元泵)、氣相色譜儀(型號：7890B)，均購自Aglieng公司（美國）。

1.2 方法

1.2.1 麻杏纖暢酥制備及小鼠分組麻杏纖暢酥由南京中醫(yī)藥大學(xué)常熟附屬醫(yī)院肛腸科制備[7]：取聚葡萄糖34 g，膨化小麥粉93 g，小麥纖維顆粒37 g，豬油150 g，糖125 g，低聚木糖13 g，杏仁50 g，陳皮30 g，雞蛋150 g、膨松劑4 g(小蘇打2 g+碳酸氫銨2 g)，烘烤溫度為面火150℃，烘烤30 min至餅坯塌成扁圓形，晾至常溫；進一步將麻杏纖暢酥粉碎機打粉、過篩，加水研磨制成0.2 g/mL的麻杏纖暢酥混懸液待用。75只小鼠隨機分為5組：正常組、便秘模型組、陽性對照組、低劑量實驗組與高劑量實驗組，以10 mg/kg劑量給予小鼠灌胃復(fù)方地芬諾酯，1/d，持續(xù)8 d，建立慢性功能性便秘大鼠模型，正常組給予等體積生理鹽水。造模4 d后，開始給予藥物干預(yù)，低劑量組給予麻杏纖暢酥混懸液2 g/kg（采用人與動物體表面積換算公式換算），高劑量組給予麻杏纖暢酥混懸液4 g/kg，1/d，持續(xù)4 d。正常組、模型組、陽性對照組灌胃同期給予等量生理鹽水，陽性對照組于小鼠排便實驗開始前30 min使用5.2 g/kg的乳果糖溶液灌喂（濃度0.15 g/mL）。

1.2.2 小鼠排便實驗第8天灌胃給藥結(jié)束2 h后，采用0.5 mL墨水灌喂各組小鼠，觀察、收集糞便，從灌胃墨汁開始計時，記錄小鼠首粒黑便時間、4 h內(nèi)黑便粒數(shù)及糞便的總重量（濕重、干重），并計算糞便含水量：糞便含水量(%)=(糞便濕重－糞便干重)/糞便濕重×100%。

1.2.3 腸道蠕動實驗及測量腸肌層厚度排便實驗結(jié)束后，所有小鼠禁食24 h。在第9天每只小鼠灌喂3 mL碳墨水溶液，30 min后脫頸椎處死小鼠，剖開小鼠腹腔，取幽門至回盲部的整個小腸，輕柔拉直后測量小腸的總長度和墨汁在小腸的推進距離，計算出墨汁推進率：墨汁推進率（%）=墨汁推進長度/小腸總長度×100%[8]。此外，取出小鼠結(jié)腸組織并用10%福爾馬林固定，進行組織病理學(xué)考察，測量小鼠結(jié)腸肌層厚度。

1.2.4 測定糞便短鏈脂肪酸含量稱取排便實驗中各組小鼠的糞便約100 mg，加入1 mL乙腈(70%)，振蕩至混勻，10℃進行10000 r/min離心15 min（離心半徑8 cm），取40 uL上清液，加入20 μL 200 mM的3-nitrophenylhydrazine溶液，20uL 120 mM N-(3-di‐methylaminopropyl)-N0-ethylcarbodiimide(EDC)·HCl-6%吡啶溶液。40℃下反應(yīng)30 min，離心取等量上清進樣。色譜、質(zhì)譜條件：色譜柱BDS Hypersil C18(100 mm×2.1 mm,2.4 μm)，流動相乙腈，柱溫40℃，進樣量2 μL。洗脫程序（流速0.35 mL/min）為：0.0～1.4 min，10%甲醇；1.4～8.2 min，10%～80%甲醇；8.2～9.0 min，80%～10%甲醇；9.0～10.0min，10%甲醇。離子源：ESI源；采用MRM模式進行檢測。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用（）表示，兩組間比較進行t檢驗，多組間比較進行方差分析，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 麻杏纖暢酥對小鼠排便時間、糞便數(shù)量、質(zhì)量和含水量的影響與正常組比較，便秘模型組的首粒黑便時間顯著變長（P<0.05），4 h內(nèi)的糞便數(shù)量（P<0.05）、濕質(zhì)量（P<0.05）和含水量（P<0.05）也明顯下降，與糞便干燥、排便困難的便秘特征相一致，表明復(fù)方地芬諾酯構(gòu)造便秘小鼠模型成功。采用麻杏纖暢酥灌喂小鼠后，與便秘模型組比較，麻杏纖暢酥高、低劑量組的首粒黑便時間明顯縮短（高劑量組：P<0.01；低劑量組：P<0.05），高劑量組排便時間減少了約40 min，顯示麻杏纖暢酥可以有效改善小鼠的便秘情況；此外，麻杏纖暢酥高、低劑量組中4 h內(nèi)糞便粒數(shù)、糞便濕質(zhì)量和糞便含水量明顯增加（高劑量組：P<0.01；低劑量組：P<0.05），高劑量組有明顯上升，表明麻杏纖暢酥可以顯著改善小鼠的排便情況。見表1。

表1 麻杏纖暢酥的促排便作用

2.2 麻杏纖暢酥對小鼠小腸推進的影響與正常組比較，便秘模型組小鼠的小腸推進率明顯減弱（P<0.05），也顯示復(fù)方地芬諾酯建模成功。與便秘模型組比較，麻杏纖暢酥高劑量、低劑量組小鼠的墨汁推進率顯著增加（均P<0.05）；高劑量組中墨汁推進率增高約10%，甚至略高于陽性對照組，顯示麻杏纖暢酥高劑量組明顯提高了便秘鼠的小腸蠕動功能。見表2。

表2 麻杏纖暢酥對小鼠小腸推進的影響

2.3 麻杏纖暢酥對小鼠結(jié)腸肌層厚度的影響連續(xù)使用復(fù)方地芬諾酯后，可見小鼠結(jié)腸肌層厚度降低（P<0.05），腸粘膜有一定程度的損傷；而給予麻杏纖暢酥后，與便秘模型組比較，高劑量組腸肌層厚度提高（P<0.05），低劑量組無明顯變化（P>0.05）。如圖1。

圖1 麻杏纖暢酥對便秘小鼠結(jié)腸肌層厚度的影響A，各藥物處理組小鼠結(jié)腸組織HE染色（200×）；B，各藥物處理組小鼠結(jié)腸肌層厚度（與正常組比較，P#<0.05；與便秘模型組比較，P*<0.05）

2.4 麻杏纖暢酥對小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量的影響鏈脂肪酸包含乙酸、異丁酸、丁酸、戊酸和異戊酸等，主要來源于腸道細菌對短鏈低聚果糖的有效轉(zhuǎn)化，可以起到緩解便秘、促進排便的功效。與正常組比較，各組乙酸、丙酸含量無明顯變化(P>0.05)；與便秘模型組比較，麻杏纖暢酥高劑量組中的異丁酸含量明顯增加(P<0.05)；丁酸含量方面，陽性對照組、麻杏纖暢酥高劑量組相比便秘模型組明顯增加(P<0.05)；異戊酸和戊酸含量方面，陽性對照組、低劑量、高劑量組均升高(P<0.05或P<0.01)。見圖2。給便秘小鼠灌胃適量麻杏纖暢酥，可以有效促進小鼠腸道代謝產(chǎn)生異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸，提示麻杏纖暢酥可能通過改善腸道菌群來促進短鏈脂肪的吸收，效果略優(yōu)于乳果糖。見圖2。

圖2 小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量與正常組比較，P#<0.05；與便秘模型組比較，P*<0.05；與便秘模型組比較，P**<0.01

3 討論

便秘的發(fā)病率呈上升趨勢，中醫(yī)層面認為津不潤腸、大腸傳導(dǎo)發(fā)生異常，使得大便排出異常[9]。近年研究表明，通過添加膳食纖維可以顯著增加腸道內(nèi)的益生菌數(shù)量，增加腸道中短鏈脂肪酸的含量、糞便中的含水量，從而改善便秘的癥狀[10-11]。

麻杏纖暢酥包含小麥纖維顆粒、膨化的小麥粉、陳皮、低聚木糖、杏仁等，其中陳皮和杏仁具有通便潤腸功效，低聚木糖這類膳食纖維可以調(diào)節(jié)腸道菌群[6-7]。前期臨床研究中，痔瘡術(shù)后的患者每日服用總量75 g麻杏纖暢酥，未見不良反應(yīng)，未發(fā)生腹痛、腹瀉及藥物依賴性等。且因麻杏纖暢酥的口感、甜度較好，患者依從性良好[6]。

復(fù)方地芬諾酯是一種長效止瀉藥，它可以直接阻斷腸壁阿片受體，降低乙酰膽堿、前列腺素的分泌，并有效抑制腸蠕動，進而延長腸內(nèi)容物的通過造成便秘[12]。我們利用復(fù)方地芬諾酯誘導(dǎo)慢傳輸型便秘模型，并評價了麻杏纖暢酥的潤腸功效。慢傳輸型便秘模型與結(jié)腸肌層厚度息息相關(guān)，肌層厚度薄提示結(jié)腸收縮無力造成傳輸緩慢、功能障礙，進而導(dǎo)致排便周期延長、排便困難[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)麻杏纖暢酥能顯著改善因復(fù)方地芬諾酯引起的肌層變薄，表明麻杏纖暢酥能起到增厚、改善結(jié)腸肌層的作用。此外，便秘小鼠的糞便含水量在給予麻杏纖暢酥灌胃后明顯增多，同時糞便中丁酸、異戊酸和戊酸的含量在麻杏纖暢酥給藥組中均顯著增加。研究表明，便秘患者糞便中短鏈脂肪酸的含量顯著減少，丁酸、異戊酸和戊酸能保護腸黏膜與增強胃腸機能[15-16]，上述結(jié)果表明提高此類短鏈脂肪酸含量是麻杏纖暢酥改善便秘癥狀的途徑之一。綜上所述，麻杏纖暢酥可以有效促進便秘小鼠的腸道蠕動、加速排便，促進便秘小鼠腸道代謝產(chǎn)生丁酸、戊酸等短鏈脂肪酸，進而改善小鼠腸道環(huán)境，達到通便潤腸的作用。