PDE5抑制劑介導(dǎo)ASK1/JNK蛋白低表達(dá)對(duì)輸尿管梗阻大鼠腎組織損傷保護(hù)機(jī)制研究

馬曉倩，紀(jì)金宏，唐 菲，何昆侖

輸尿管梗阻是臨床上最常見(jiàn)的尿路梗阻類型，屬于慢性腎病的一種，會(huì)導(dǎo)致輸尿管功能障礙及腎損傷，若不及時(shí)治療很可能會(huì)導(dǎo)致尿路感染、腎積水，甚至是腎衰竭，因此探尋一種有效的治療手段對(duì)其的預(yù)防及早期治療具有深遠(yuǎn)意義[1-2]。腎臟纖維化是慢性腎病進(jìn)展到終末期腎病的最終轉(zhuǎn)歸，故如何延緩和抑制腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展己成為腎病專業(yè)醫(yī)生與患者共同面對(duì)的共識(shí)與挑戰(zhàn)[3]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致腎纖維化的重要因素，其中凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（apoptotic signal regulated kinase 1,ASK1）及氨基末端激酶（jun N-terminal kinase,JNK）在細(xì)胞因子及應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[4]。磷酸二酯酶5（phosphodiesterase 5,PDE5）是機(jī)體內(nèi)一種重要的水解酶，廣泛分布于前列腺、膀胱及尿道等部位，其可特異性的水解一種細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵第二信使環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷，而環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷是維持機(jī)體生物學(xué)穩(wěn)態(tài)的重要因子，所以近年來(lái)醫(yī)學(xué)專家對(duì)PDE5抑制劑的研究和開(kāi)發(fā)表現(xiàn)出了極大熱情[5]。但其在輸尿管梗阻方面研究較少，因此本文就PDE5抑制劑介導(dǎo)ASK1/JNK蛋白表達(dá)對(duì)輸尿管梗阻大鼠腎組織損傷保護(hù)機(jī)制進(jìn)行研究探討，為臨床治療輸尿管梗阻提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料動(dòng)物材料：本實(shí)驗(yàn)選取斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供的40只SPF級(jí)SD雄性大鼠（合格證書(shū)為：SCXK（京）2019-0087），體質(zhì)量150～200 g，大鼠單籠喂養(yǎng)，室溫生長(zhǎng)，模仿晝夜交替，晝夜各12 h，在常溫下進(jìn)行無(wú)菌自由進(jìn)食、飲水2周，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑本研究所用到的儀器及試劑如表1所示。

表1 儀器及試劑一覽表

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 分組與模型制備選取40只SPF級(jí)SD雄性大鼠，隨機(jī)分為正常組（N組），模型組（M組），刺芒柄花素組（F組），PDE5抑制劑組（P組），每組10只。取M、F、P組大鼠用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，無(wú)菌條件下游離右側(cè)出輸尿管，用縫合線在腎盂處和輸尿管上處分別結(jié)扎，并從兩結(jié)扎點(diǎn)中間剪斷輸尿管，將其置于原位后，局部給與適量青霉素藥粉，隨后逐層縫合傷口，術(shù)后切口處碘伏消毒，清理血跡并注意觀察滲血情況，當(dāng)大鼠出現(xiàn)精神萎糜、形體瘦弱、糞便時(shí)軟或不成形等現(xiàn)象時(shí)，則視為建模成功，N組不建立該模型，同期給與同體積生理鹽水。建模成功后，對(duì)F組灌胃50 mg/kg的刺芒柄花素，對(duì)P組灌胃12 mg/kg的PDE5抑制劑，兩組均1/d，持續(xù)14 d，N組、M組同期給與灌胃同體積生理鹽水[1]。

1.3.2 檢測(cè)步驟①標(biāo)本采集：各組大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后使其安樂(lè)死并稱重，然后取雙腎，PBS沖洗后稱重，4%多聚甲醛固定48 h，進(jìn)行常規(guī)梯度脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋切片處理后放入冰箱中密封保存，同時(shí)于腹主動(dòng)脈取血，在3000 r/min的條件下離心10 min（離心半徑為8 cm），取上清液置于離心管中，放入冰箱中密封保存。②大鼠腎功能檢測(cè)：取各組大鼠血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中血肌酐（serum creatinine,Scr）及尿素氮（blood urea nitrogen,BUN），實(shí)驗(yàn)應(yīng)嚴(yán)格按照儀器及試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。③大鼠腎組織HE染色：取部分腎組織，進(jìn)行脫蠟、復(fù)水處理，然后用蘇木素-伊紅染液進(jìn)行HE染色，除去多余染液后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片處理，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。④大鼠腎組織Masson染色：取部分腎組織，進(jìn)行脫蠟、復(fù)水處理，然后用蘇木素染色10 min，流水沖洗后，加入1%的鹽酸乙醇分化5 s，水洗，再用麗春紅酸性品紅溶液染色10 min，0.2%的醋酸水洗5 min，1%的磷酸鋁分化5 min，甲苯胺藍(lán)溶液染色5 min，水洗后60℃烘干，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片處理，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，并用病理影像分析系統(tǒng)分析計(jì)算出腎間質(zhì)纖維化面積，即測(cè)定間質(zhì)纖維化面積占同視野小管間質(zhì)總面積的百分比。⑤大鼠腎組織中PDE5檢測(cè)：采用免疫組化法檢測(cè)，取部分腎組織，二甲苯脫蠟，乙醇進(jìn)行梯度水化后，3%過(guò)氧化氫封閉15 min以進(jìn)行組織抗原修復(fù)，完成后PBS洗滌3次，然后用10%的山羊血封閉30 min，加入稀釋后的PDE5一抗（1:100），4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，室溫平衡30 min，加入生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min，PBS洗滌3次，用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色10 min，水洗后乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片后用電子顯微鏡進(jìn)行觀察。⑥大鼠腎組織中ASK1/JNK蛋白表達(dá)檢測(cè)：免疫印跡法檢測(cè)，取部分腎組織，剪碎后加入1 mL RIPA裂解液，充分?jǐn)嚢韬蟊狭呀?0 min，在4℃、12000 r/min條件下離心20 min（離心半徑為8 cm），取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白表達(dá)，首先制作濃度梯度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品及BCA工作液，然后將各組蛋白調(diào)整至等濃度后加入BCA工作液，用電泳儀進(jìn)行電泳，電泳完成后將凝膠上蛋白用半干法轉(zhuǎn)移至甲醇活化的PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入稀釋的ASK1、JNK的一抗（1∶1000），4℃搖床振蕩孵育過(guò)夜后洗膜；加入稀釋的ASK1、JNK二抗（1：5000），37℃輕搖，然后在室溫下孵育2 h；洗膜后，用ECL熒光試劑盒測(cè)定結(jié)果，計(jì)算與GAPDH比值求得ASK1、JNK蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。⑦體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的腎小管上皮細(xì)胞，一組給與PDE5抑制劑記為A組，一組給與等體積生理鹽水，記為B組，免疫印跡法檢測(cè)ASK1/JNK蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正太分布及方差齊性，描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）；多組比較采用單因素方差分析，事后檢驗(yàn)采用SNK法或t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果與N組比較，M組腎臟指數(shù)、Scr及BUN含量明顯增多（P<0.05），與M組比較，F(xiàn)、P兩組腎臟指數(shù)、Scr及BUN含量減少（P<0.05），且P組腎臟指數(shù)、Scr及BUN含量比F組降低顯著（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 腎功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.3 各組大鼠HE染色結(jié)果N組腎組織結(jié)構(gòu)、腎小球、腎小管形態(tài)正常且排列整齊，未見(jiàn)系膜細(xì)胞與基質(zhì)增生及硬化腎小球組織等損傷情況，而M組腎小管可見(jiàn)空泡樣變性和明顯皮質(zhì)擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)萎縮、脫落和壞死，且可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而與M組比較，F(xiàn)組、P組腎小球、腎小管情況明顯改善，炎細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎組織HE染色（×200）

2.3 各組大鼠各組Masson染色結(jié)果N組可見(jiàn)細(xì)胞核呈紅色，腎間質(zhì)無(wú)明顯纖維組織增生，而M組可見(jiàn)大量纖維組織增生，腎間質(zhì)膠原相對(duì)面積增大，與M組比較，F(xiàn)組、P組腎間質(zhì)纖維化增生程度、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕，腎間質(zhì)膠原相對(duì)面積明顯縮小。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠Masson染色下腎間質(zhì)纖維化面積與N組比較，*P＜0.05，與M組比較，#P＜0.05，與F組比較，aP＜0.05

圖3 各組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)Masson染色（×200倍）

2.4 各組大鼠腎組織中PDE5免疫組化結(jié)果與N組比較，M組腎組織中PDE5陽(yáng)性表達(dá)升高（P<0.05），與M組比較，F(xiàn)、P兩組腎組織中PDE5陽(yáng)性表達(dá)降低（P<0.05），且P組腎組織中PDE5陽(yáng)性表達(dá)比F組降低顯著（P<0.05）。見(jiàn)圖4，圖5。

圖4 各組大鼠腎組織中PDE5的陽(yáng)性表達(dá)與N組比較，*P＜0.05，與M組比較，#P＜0.05，與F組比較，aP＜0.05

圖5 各組大鼠腎組織PDE5免疫組化染色（×200）

2.5 各組大鼠腎組織中ASK1/JNK蛋白表達(dá)結(jié)果與N組比較，M組腎組織中ASK1、JNK蛋白表達(dá)升高（P<0.05），與M組比較，F(xiàn)、P兩組腎組織中ASK1、JNK蛋白表 達(dá) 降低（P<0.05），且P組 腎 組織中ASK1、JNK蛋白表達(dá)比F組降低顯著（P<0.05）。見(jiàn)圖6，圖7。

圖6 各組大鼠腎組織中ASK1、JNK蛋白表達(dá)與N組比較，*P＜0.05，與M組比較，#P＜0.05，與F組比較，aP＜0.05

圖7 各組大鼠腎組織中ASK1、JNK蛋白表達(dá)電泳圖

2.6 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與B組比較，A組腎小管上皮細(xì)胞中ASK1、JNK蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)圖8，圖9。

圖8 各組腎小管上皮細(xì)胞中ASK1、JNK蛋白表達(dá)與A組比較，*P＜0.05

圖9 各組腎小管上皮細(xì)胞中ASK1、JNK蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

輸尿管梗阻一般是由先天或后天因素導(dǎo)致的輸尿管發(fā)生縮窄、變性、扭曲、損傷的一種慢性腎病，而隨著人們生活習(xí)慣的不斷變化，該病的患病率呈逐年上升趨勢(shì)[6]。輸尿管梗阻的治療及預(yù)后都不容樂(lè)觀，這導(dǎo)致其已經(jīng)成為全球主要的公共健康問(wèn)題之一，這對(duì)患者的生產(chǎn)、生活造成了一定的負(fù)擔(dān)，因此探尋一種有效的治療手段就顯得尤為重要[7]。

本文研究發(fā)現(xiàn)，與M組比較，F(xiàn)、P兩組腎臟指數(shù)、Scr及BUN含量顯著減少，且P組比F組降低顯著，這說(shuō)明PDE5抑制劑可顯著改善大鼠腎功能。刺芒柄花素為異黃酮類化合物，有研究表明其在抗細(xì)胞凋亡、改善腎臟病理?yè)p傷及腎功能等方面占有重要地位，可對(duì)腎臟起到保護(hù)作用[8]。而PDE5抑制劑是臨床上治療勃起功能障礙的一線藥物，其具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗聚集等作用，同時(shí)也可廣泛用于良性前列腺增生癥以及下尿路綜合癥等疾病[9]。Scr是含氮的有機(jī)物代謝的終產(chǎn)物，BUN則是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，這兩者是反應(yīng)腎功能的重要指標(biāo)[10]。輸尿管梗阻造成的腎損傷會(huì)導(dǎo)致腎小球毛細(xì)血管的孔徑大小與電荷屏障出現(xiàn)異常，從而促使腎的代謝濾過(guò)作用降低，進(jìn)而導(dǎo)致Scr及BUN過(guò)度蓄積，最終對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用，并進(jìn)一步對(duì)腎功能造成影響[11]。而對(duì)于輸尿管梗阻大鼠，PDE5抑制劑可能是通過(guò)抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，影響細(xì)胞因子表達(dá)，調(diào)節(jié)糖脂代謝、細(xì)胞增殖及凋亡等，來(lái)增強(qiáng)大鼠腎功能，修復(fù)腎損傷，從而減少Scr及BUN沉積，進(jìn)而降低其毒害作用，最終改善腎功能。許春花等[12]研究發(fā)現(xiàn)，西地那非能減輕腎纖維化引起的腎功能損傷，可有效降低輸尿管梗阻大鼠血清中Scr及BUN含量，這與本文結(jié)果類似。

本文研究表明，PDE5抑制劑可顯著改善大鼠腎組織病理形態(tài)，減少纖維組織增生，降低腎組織纖維化面積，這說(shuō)明其療效顯著，可有效改善腎損傷并對(duì)腎臟起到一定保護(hù)作用。輸尿管梗阻在病理狀態(tài)下，腎小管上皮細(xì)胞基底膜會(huì)受到破壞，從而使由活化上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變的間充質(zhì)細(xì)胞順利通過(guò)受損的基膜，運(yùn)動(dòng)到間質(zhì)中增殖分化為成纖維細(xì)胞，最終使腎臟逐漸纖維化[13-14]。而對(duì)于輸尿管梗阻大鼠，PDE5抑制劑可能是通過(guò)促進(jìn)相關(guān)因子的表達(dá)，抑制促炎基因的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)表達(dá)等，來(lái)改善內(nèi)皮功能，從而提高上皮細(xì)胞間的粘附性，抑制上皮細(xì)胞分化，抑制細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度積聚和沉積等，進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞增殖與活化，最終減輕腎功能損傷，抑制腎纖維化病變。孫偉等[15]研究發(fā)現(xiàn)，PDE5抑制劑他達(dá)拉非對(duì)腎臟具有保護(hù)作用，其可有效改善腎纖維化及腎小管萎縮情況；張翠等[16]研究發(fā)現(xiàn)，刺芒柄花素對(duì)輸尿管梗阻大鼠具有顯著療效，其可抑制ASK1、JNK蛋白表達(dá)，阻止細(xì)胞凋亡，從而減緩梗阻性腎病病理進(jìn)程的發(fā)生和發(fā)展，這與本文結(jié)果類似。

本文研究發(fā)現(xiàn)，與M組比較，F(xiàn)、P兩組腎組織中PDE5、ASK1、JNK表達(dá)顯著降低，且P組比F組降低顯著，這說(shuō)明PDE5抑制劑可顯著抑制ASK1/JNK蛋白表達(dá)，且體外實(shí)驗(yàn)表明，PDE5抑制劑可顯著抑制ASK1、JNK表達(dá)，提示PDE5抑制劑可能通過(guò)抑制ASK1/JNK蛋白表達(dá)發(fā)揮作用。有研究表明，PDE5在腎臟等相關(guān)疾病中扮演著重要角色，其參與調(diào)控了平滑肌的動(dòng)態(tài)活力、腺組織的分泌和組織細(xì)胞增殖等疾病相關(guān)進(jìn)程[17]。ASK1是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子，JNK是ASK1的下游效應(yīng)分子，也是凋亡蛋白酶連鎖反應(yīng)的必要條件，當(dāng)ASK1在病理?xiàng)l件下被激活后，就會(huì)激活下游JNK信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和形態(tài)學(xué)改變，進(jìn)而導(dǎo)致包括腎臟疾病等多種疾病的發(fā)生[18-19]。而對(duì)于輸尿管梗阻大鼠，PDE5抑制劑可能是通過(guò)抑制PDE5的表達(dá)，來(lái)增加環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的濃度使其發(fā)揮特有的生物學(xué)作用，從而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等應(yīng)激反應(yīng)，抑制相關(guān)上游信號(hào)激活等，從而抑制ASK1過(guò)度活化，進(jìn)而減輕其下游JNK通路激活，抑制上皮細(xì)胞凋亡，減少炎癥反應(yīng)及纖維化，最終對(duì)腎臟起到一定保護(hù)作用。張思琪研究發(fā)現(xiàn)[20]，刺芒柄花素能夠保護(hù)腎間質(zhì)纖維化大鼠的腎功能，降低ASK1、JNK蛋白的表達(dá)，從而阻止腎小管上皮細(xì)胞凋亡所致的腎間質(zhì)纖維化，這與本研究結(jié)果類似。

綜上所述，PDE5抑制劑可有效改善輸尿管梗阻大鼠腎組織損傷，提高腎功能，抑制PDE5水平，其機(jī)制可能與降低ASK1/JNK蛋白表達(dá)有關(guān)。