整合SV40 Large T抗原基因的人胚肺成纖維細(xì)胞IMR90的蛋白質(zhì)組和代謝組研究

向 升,余 巍

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438)

隨著質(zhì)譜儀器的進(jìn)步和實(shí)驗(yàn)方法的發(fā)展,組學(xué)分析發(fā)展成為生命科學(xué)的熱門研究領(lǐng)域。蛋白質(zhì)是許多細(xì)胞生物學(xué)過程中的關(guān)鍵角色。蛋白質(zhì)的表達(dá)、功能和相互作用是細(xì)胞動(dòng)態(tài)過程的基礎(chǔ)[1]。此外,細(xì)胞的整體蛋白質(zhì)水平會(huì)響應(yīng)外部刺激而發(fā)生波動(dòng),具有動(dòng)態(tài)性。蛋白質(zhì)組學(xué)能夠幫助我們捕捉細(xì)胞整體蛋白質(zhì)水平的變化,是理解基因功能最重要的方法之一,并且對(duì)于疾病的早期診斷、發(fā)展和預(yù)后檢測(cè)至關(guān)重要[2]。細(xì)胞中的代謝物反映了細(xì)胞的新陳代謝水平。細(xì)胞產(chǎn)生的代謝物參與細(xì)胞內(nèi)眾多生物學(xué)過程,如表觀遺傳調(diào)控、酶催化的化學(xué)反應(yīng)等,對(duì)細(xì)胞功能至關(guān)重要[3]。因此,代謝組擁有大量信息,被認(rèn)為可以預(yù)測(cè)表型[4]。蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析,能夠幫助我們探究將基因型與表型聯(lián)系起來的潛在因果機(jī)制。

蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)是細(xì)胞維持正常功能的基礎(chǔ)。細(xì)胞衰老伴隨著功能障礙蛋白和受損細(xì)胞器的逐步積累。這些無效成分的積累和聚集使得細(xì)胞蛋白穩(wěn)態(tài)被破壞,并增加了細(xì)胞死亡的風(fēng)險(xiǎn)[5]。對(duì)秀麗隱桿線蟲5 000多種蛋白質(zhì)進(jìn)行組學(xué)分析,結(jié)果表明該線蟲的蛋白質(zhì)組在衰老過程中經(jīng)歷了廣泛的重塑[6]。此外,在細(xì)胞代謝過程產(chǎn)生并逐步積累的分子損傷也是衰老的主要驅(qū)動(dòng)力[7-9]。通過非靶向代謝組學(xué),研究人員發(fā)現(xiàn),隨著年齡的增長,代謝物的多樣性(不同代謝物的總數(shù))會(huì)增加[10]。因此,蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的聯(lián)合分析有望幫助我們深入理解細(xì)胞衰老過程中基因型與表型之間的潛在聯(lián)系。

IMR90是人胚肺成纖維細(xì)胞,具有有限的增殖壽命,會(huì)隨著不斷傳代而進(jìn)入危機(jī)期。前人研究表明,SV40轉(zhuǎn)化IMR90細(xì)胞(未進(jìn)入增殖危機(jī))后,該細(xì)胞具有有限的增殖壽命,并表現(xiàn)出衰老相關(guān)表型,但不會(huì)進(jìn)入衰老周期停滯狀態(tài)[11]。在這項(xiàng)研究中,我們通過SA-β-Gal染色實(shí)驗(yàn)表明,整合SV40 Large T抗原基因的IMR90細(xì)胞——IMRT細(xì)胞,β-半乳糖苷酶(β-Gal)表達(dá)水平升高;與此同時(shí),IMRT細(xì)胞中的衰老相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平顯著升高,與IMR90細(xì)胞相比,表現(xiàn)出衰老樣分化的跡象。我們通過蛋白質(zhì)組學(xué)和靶向代謝組學(xué)進(jìn)行聯(lián)合分析,比較IMR90與IMRT中的差異蛋白質(zhì)和差異代謝物。發(fā)現(xiàn)一些差異性代謝物如6-磷酸葡萄糖、肉堿、磷酸膽堿、亮氨酸-異亮氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸等與蛋白質(zhì)組學(xué)中鑒定的代謝通路中的蛋白水平的變化有密切聯(lián)系,有望用作體內(nèi)衰老成纖維細(xì)胞的潛在生物標(biāo)志物。進(jìn)一步在IMR90細(xì)胞中沉默谷胱甘肽過氧化物酶1基因GPX1則顯著促進(jìn)了IMR90細(xì)胞衰老標(biāo)志物的表達(dá)升高,表明GPX1在細(xì)胞衰老進(jìn)程中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Gluta-max(Invitrogen,35050),NEAA(Invitrogen,11140),Sodium pyruvate(Invitrogen,11360070),MEM培養(yǎng)基(Gibco,2913505)和FBS(Gibco,51411C)購于賽默飛公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR116-02)購于上海天根生物有限公司。溶酶體β-半乳糖苷酶染色試劑盒(C0605)購于碧云天公司。IMRT細(xì)胞由同濟(jì)大學(xué)毛志勇實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng),IMR90細(xì)胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)干細(xì)胞庫。

1.2 SV40 Large T抗原基因的驗(yàn)證

培養(yǎng)IMRT和IMR90細(xì)胞,待細(xì)胞長滿之后,用TRIzol(Life Technologies,Rockville,美國)法提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒,將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板,分別用SV40 Large T抗原基因和GAPDH的特異性引物進(jìn)行PCR。使用的引物為:SV40-F(5′-CTG ACTTTGGAGGCTTCTGG-3′)和SV40-R(5′-GCAGTAGCAATCAACCCACA-3′)。GAPDH-F(5′-ATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3′)和GAPDH-R(5′-TGGCAGGTTTTTCTAGACGGCAG-3′)。PCR結(jié)束后,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 SA-β-Gal染色實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞生長密度良好時(shí),吸除培養(yǎng)基,PBS洗去表面殘余培養(yǎng)基,加入2 m Lβ-半乳糖苷酶染色固定液,室溫固定15 min。吸除細(xì)胞固定液,用PBS清洗細(xì)胞,3 min,洗3次。吸除PBS,每瓶加入2 m L染色工作液。用封口膜封住培養(yǎng)瓶,37℃孵育過夜。普通光學(xué)顯微鏡下觀察,拍照。

1.4 蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備及上機(jī)

培養(yǎng)IMRT和IMR90細(xì)胞。消化,離心收集細(xì)胞,計(jì)數(shù)。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),確保每組細(xì)胞的數(shù)量為1×106個(gè)。預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞,除盡培養(yǎng)基,獲得細(xì)胞沉淀。液氮速凍,樣品保存在-80℃。蛋白質(zhì)組學(xué)分析在復(fù)旦大學(xué)人類表型組研究院蛋白質(zhì)組平臺(tái)上進(jìn)行。采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)(Label-free)技術(shù),不同樣品分別經(jīng)蛋白提取、Trypsin酶解、肽段分級(jí)以及高精度質(zhì)譜分析后,比較各樣本質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的相對(duì)定量。

1.5 代謝組學(xué)樣品制備及上機(jī)

培養(yǎng)IMRT和IMR90細(xì)胞。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),確保每組細(xì)胞的數(shù)量為1×106個(gè)。預(yù)冷的PBS洗去細(xì)胞表面的殘留培養(yǎng)基,加入80%甲醇(HPLC級(jí)),-80℃孵育20 min;4℃,4 000 g離心10 min,保留上清。干燥濃縮樣品,干燥后的代謝物樣品保存在-80℃。干燥后的樣品加入100μL的乙腈,渦旋30～60 s;4℃,16 000 r/min,離心15 min。取80μL上清,轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中,上機(jī)分析。代謝組學(xué)分析在復(fù)旦大學(xué)代謝與整合生物學(xué)研究院平臺(tái)上進(jìn)行。

1.6 差異蛋白和差異代謝物的選擇

在分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)時(shí),通過比較不同樣本中同一肽段的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度和譜圖計(jì)數(shù)對(duì)相應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量?；谫|(zhì)譜得到的數(shù)據(jù),對(duì)鑒定到的兩組蛋白的豐度進(jìn)行差異分析(t-test),以兩組蛋白豐度平均值的Fold Change＞2,P＜0.05為閾值確定差異表達(dá)蛋白。代謝組學(xué)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的是代謝物的濃度?；谫|(zhì)譜得到的數(shù)據(jù),對(duì)鑒定到的兩組蛋白的豐度進(jìn)行差異分析(t-test),以兩組蛋白豐度平均值的Fold Change＞2,P＜0.05為閾值確定差異表達(dá)蛋白。

1.7 生物信息學(xué)分析

為進(jìn)一步比較IMRT和IMR90兩組生物學(xué)功能的差異,我們采用基因本體(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫(http:∥www.geneontology.org/),按照細(xì)胞組分、生物學(xué)過程、分子功能對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行GO分類。采用京都基因與基因組百科全書(KEGG)(http:∥www.genome.jp/kegg/)注釋通路數(shù)據(jù)庫分析差異蛋白質(zhì)和差異代謝物富集的代謝通路。

1.8 si-RNA基因沉默

依托于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司,合成siRNA:GPX1-F(5′-AUUCUCGAUAAGUAGUACCTT-3′)和GPX1-R(5′-GGUACUACUUAUCGAGAAUTT-3′);陽性對(duì)照GAPDH-F(5′-UGACCUCAACUACAUGGUUTT-3′)和GAPDH-R(5′-AACCAUGUAGUUGAGGUCATT-3′),陰性對(duì)照-F(5′-UUCUCCGSSCGUGUCSCGUTT-3′)和R(5′-ACGUUGACACGUUCGGAGAATT-3′),使用Lipofectamine?RNAiMAX Reagent(Invitrogen)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,siRNA最終濃度為100 nmol/L。轉(zhuǎn)染6 h更換培養(yǎng)基,48～60 h后,提取RNA檢測(cè)。

1.9 RT-PCR檢測(cè)

通過TRIzol法提取RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行檢測(cè)。使用的RT-PCR引物:IL6-F(5′-CACCGGGAACGAAAGAGAAG-3′)和IL6-R(5′-TCATAGCTGGGCTCCTGGAG-3′),IL8-F(5′-ACATGACTTCCAAGCTGGCC-3′)和IL8-R(5′-CAGAAATCAGGAAGGCTGCC-3′),CDKN1A-F(5′-TCACTGTCTTGTACCCTTGTGC-3′)和CDKN1A-R(5′-GGCGTTTGGAGTGGTAGAAA-3′),GPX1-F(5′-GCGGGGCAAGGTACTACTTA-3′)和GPX1-R(5′-CTCTTCGTTCTTGGCGTTCT-3′),GAPDH-F(5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′)和GAPDH-R(5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′)和內(nèi) 參L3MBTL2-F(5′-CCAAGACCAAGAGGTTCTGC-3′)和L3MBTL2-R(5′-TTTGGTCGGTGGTTTTCC-3′)。所有PCR程序均進(jìn)行44個(gè)循環(huán)。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用Excel 2015、SPSS 22.0和R 3.5.1分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果

2.1 SV40病毒的Large T抗原基因的整合

SV40病毒的Large T抗原基因能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化并激發(fā)細(xì)胞的增殖潛能[12]。將SV40 Large T抗原基因整合進(jìn)正常的人胚肺成纖維細(xì)胞IMR90的基因組中,能夠誘導(dǎo)IMR90細(xì)胞轉(zhuǎn)化。我們先對(duì)IMRT細(xì)胞中的SV40 Large T抗原基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如圖1(a)所示,在IMR90細(xì)胞中已整合了SV40病毒的Large T抗原基因。通過SA-β-Gal染色實(shí)驗(yàn),比較IMR90與IMRT細(xì)胞,結(jié)果如圖1(b)所示,視野中的IMRT細(xì)胞被染成藍(lán)色,而正常傳代的IMR90細(xì)胞沒有被染上顏色。這表明,IMRT細(xì)胞與衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活性高,表現(xiàn)出衰老細(xì)胞相關(guān)的表型。

圖1 SV40 Large T抗原基因的插入及相關(guān)表型的驗(yàn)證Fig.1 Verification of the phenotype and insertion of SV40 Large T in IMR90

2.2 IMRT和IMR90的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

我們通過非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,對(duì)IMRT和IMR90細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析(圖2,見第618頁)。圖2(a)為蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定到的結(jié)果,我們?cè)贗MRT組和IMR90組細(xì)胞中,都鑒定到了約3 300種蛋白。相關(guān)性分析結(jié)果(圖2(b))顯示IMRT與IMR90組內(nèi)樣本的相關(guān)性明顯高于組間樣本的相關(guān)性。主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)結(jié)果(圖2(c))顯示IMRT和IMR90的蛋白質(zhì)組具有明顯的差異。結(jié)果表明,SV40 Large T抗原基因插入后的IMR90細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量和種類發(fā)生了變化。

圖2 IMRT和IMR90的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定與分析Fig.2 Identification and analysis of proteomics of IMRT and IMR90

基于質(zhì)譜鑒定的蛋白,我們對(duì)每個(gè)樣品中的每個(gè)蛋白的表達(dá)量進(jìn)行了可視化。如圖3(a)所示,IMRT組的蛋白質(zhì)表達(dá)量與IMR90組蛋白質(zhì)的表達(dá)量有顯著不同。我們對(duì)兩組蛋白的豐度進(jìn)行差異分析(ttest),以兩組蛋白豐度平均值的Fold Change＞2或＜0.5(IMRT/IMR90),P＜0.05為閾值確定差異表達(dá)蛋白。一共鑒定到了402個(gè)差異表達(dá)蛋白,其中在IMRT組中表達(dá)上調(diào)的蛋白有210個(gè),在IMRT組中表達(dá)下調(diào)的蛋白有192個(gè),如圖3(b)所示。

圖3 IMRT和IMR90組間差異表達(dá)蛋白質(zhì)分析Fig.3 Analysis of differentially expressed proteins between IMRT and IMR90 groups

2.3 差異蛋白的GO功能注釋分析和KEGG通路分析

對(duì)IMRT和IMR90中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能注釋分析,分別從生物過程、細(xì)胞組成和分子功能等方面進(jìn)行注釋。分析結(jié)果表明,IMRT/IMR90的下調(diào)蛋白參與36個(gè)生物過程,22個(gè)細(xì)胞組成和24個(gè)分子功能;IMRT/IMR90的上調(diào)蛋白參與46個(gè)生物過程,41個(gè)細(xì)胞組成和26個(gè)分子功能。根據(jù)P值進(jìn)行排序,選擇前15個(gè)進(jìn)行可視化作圖(圖4)。在生物過程分類中,代謝過程和細(xì)胞過程等過程占據(jù)較大的比例。上調(diào)蛋白質(zhì)參與r RNA剪切、三羧酸循環(huán)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化還原等過程;下調(diào)蛋白質(zhì)參與糖酵解過程、糖異生過程、凋亡過程的調(diào)控和細(xì)胞增殖等過程;在細(xì)胞組成分類中,大部分差異蛋白質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和細(xì)胞器中。上調(diào)蛋白質(zhì)參與構(gòu)成線粒體的各個(gè)部分,包括線粒體內(nèi)膜,線粒體基質(zhì)以及線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ等細(xì)胞組分;下調(diào)蛋白參與構(gòu)成細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞外泌體和細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附連接(Cell-cell adherens junction)等細(xì)胞組分。在分子功能分類中,酶的催化活性和蛋白質(zhì)結(jié)合活性所占比例較高。上調(diào)蛋白具有蛋白質(zhì)結(jié)合、電子載體活性(Electron carrier activity)、NADH脫氫酶活性和GTPase活性(GTPase activity)等功能;下調(diào)蛋白質(zhì)具有蛋白質(zhì)結(jié)合、poly(A)RNA結(jié)合(poly(A)RNA binding)、鎂離子結(jié)合、微管結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等功能。

圖4 差異表達(dá)蛋白的GO分析結(jié)果Fig.4 GO analysis of differentially expressed proteins

為進(jìn)一步比較IMRT和IMR90兩組細(xì)胞生物學(xué)功能的差異,我們使用KEGG對(duì)兩組的差異蛋白進(jìn)行通路富集。通過KEGG通路顯著性富集發(fā)現(xiàn),在IMRT組中上調(diào)的差異蛋白質(zhì)主要富集于三羧酸循環(huán)((TCA cycle)、氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)、丙酸酯代謝(Propanoate metabolism)、丙酮酸代謝(Pyruvate metabolism)、脂肪酸降解(Fatty acid degradation)等代謝途徑,以及帕金森病(Parkinson disease)、亨廷頓病(Huntington disease)、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease)、非酒精性脂肪肝病(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)等衰老相關(guān)疾病的通路中(圖5(a),見第620頁)。下調(diào)蛋白質(zhì)顯著富集于谷胱甘肽代謝(Glutathione metabolism)、磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway)、糖酵解/糖異生(Glycolysis/Gluconeogenesis)、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝(Alanine,aspartate and glutamate metabolism)等代謝途徑(圖5(b),見第620頁)。

圖5 差異蛋白通路富集分析結(jié)果Fig.5 Analysis of differential protein pathway enrichment

2.4 IMRT和IMR90的代謝組質(zhì)譜鑒定分析

代謝物質(zhì)譜鑒定采用三重四極桿5500TMLC/MS/MS系統(tǒng)。該系統(tǒng)是對(duì)樣品進(jìn)行靶向代謝物分析,可以檢測(cè)和(半)定量分析約280種代謝物。對(duì)兩組樣品的質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示IMRT與IMR90組內(nèi)樣本的相關(guān)性明顯高于組間樣本的相關(guān)性(圖6(a),見第620頁)。主成分分析結(jié)果(圖6(b),見第620頁)顯示IMRT和IMR90的代謝物組具有明顯的差異。結(jié)果表明,IMRT細(xì)胞中的代謝水平發(fā)生了顯著變化。

圖6 IMRT和IMR90的代謝組學(xué)鑒定分析Fig.6 Metabolomics analysis of IMRT and IMR90

基于質(zhì)譜鑒定的代謝物,我們對(duì)每個(gè)樣品中的代謝物,依據(jù)t-test的分析結(jié)果,根據(jù)P值選擇了前30的代謝物的濃度進(jìn)行可視化。如圖7(a)(見第621頁)所示,IMRT組的代謝物濃度與IMR90組的代謝物濃度有顯著不同?；诖?我們對(duì)兩組代謝物的豐度進(jìn)行差異分析(t-test),以兩組蛋白豐度平均值的Fold Change＞2或＜0.5(IMRT/IMR90),P＜0.05為閾值確定差異代謝物。一共鑒定到了16個(gè)差異代謝物,其中在IMRT組中上調(diào)的代謝物有5個(gè),在IMRT組中下調(diào)的代謝物有11個(gè)(圖7(b))。

2.5 差異代謝物的KEGG通路富集分析

為進(jìn)一步比較IMRT和IMR90兩組細(xì)胞生物學(xué)功能的差異,我們使用KEGG對(duì)兩組的差異代謝物進(jìn)行通路富集。KEGG通路富集結(jié)果(圖8)顯示差異代謝物主要富集在氨基酸代謝通路、糖類代謝通路、脂質(zhì)代謝通路以及核苷酸代謝通路中。包括丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝(Alanine,aspartate and glutamate metabolism)、精氨酸生物合成(Arginine biosynthesis)、賴氨酸降解(Lysine degradation)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化(Pentose and glucuronate interconversions)、膦酸酯和次膦酸酯代謝(Phosphonate and phosphinate metabolism)、甘油磷脂代謝(Glycerophospholipid metabolism)、嘌呤代謝(Pyrimidine metabolism)和嘧啶代謝(Purine metabolism)。

圖8 差異代謝物通路富集分析結(jié)果Fig.8 Analysis of differential metabolites pathway enrichment

2.6 IMRT細(xì)胞的代謝組學(xué)分析證實(shí)蛋白組學(xué)的改變

在IMRT細(xì)胞中,依據(jù)代謝組數(shù)據(jù)的分析,6-磷酸葡萄糖、丙氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸-異亮氨酸和膽堿以及磷脂酰膽堿等,相較于IMR90組有顯著差異(圖9,見第622頁)。6-磷酸葡萄糖顯著減少,而6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途徑的重要中間產(chǎn)物。這與蛋白質(zhì)組學(xué)中鑒定到葡萄糖磷酸變位酶1(PGM1)和6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)的表達(dá)下調(diào)相關(guān)。肉堿在細(xì)胞內(nèi)能夠把脂肪酸運(yùn)輸?shù)骄€粒體,磷酸膽堿在細(xì)胞能夠與膽堿互相轉(zhuǎn)化,膽堿參與脂肪酸代謝,肉堿和磷酸膽堿含量上調(diào),與脂肪酸降解途徑中特長鏈特異性?；o酶A脫氫酶(ACADVL)以及短鏈烯酰輔酶A水合酶(ECHS1)上調(diào)相關(guān)。亮氨酸-異亮氨酸的上調(diào),與蛋白質(zhì)組學(xué)中鑒定到的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶1(ACAT1)的上調(diào)相關(guān),該酶調(diào)控異亮氨酸的分解代謝。丙氨酸的下調(diào)與蛋白質(zhì)組學(xué)觀察到的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝通路下調(diào)相吻合。谷氨酰胺在細(xì)胞內(nèi)能夠參與合成谷胱甘肽,谷氨酰胺的下調(diào)與蛋白質(zhì)組學(xué)中鑒定到的谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1),谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M2(GSTM2),谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3(GSTM3),谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)以及谷氨酸-半胱氨酸連接酶(GCLM)的下調(diào)相關(guān)。

圖9 6種差異代謝物的濃度分析Fig.9 Concentration of six differential metabolites

2.7 沉默GPX1促進(jìn)IMR90細(xì)胞衰老標(biāo)志物的表達(dá)升高

在IMRT細(xì)胞中,蛋白質(zhì)組學(xué)中鑒定到的谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)含量下調(diào),與此同時(shí),代謝組中鑒定到谷氨酰胺顯著下調(diào)。GPX1屬于谷胱甘肽過氧化物酶家族,在細(xì)胞內(nèi)能夠催化谷胱甘肽還原有機(jī)氫過氧化物和H2O2,從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。在IMRT細(xì)胞中,與IMR90細(xì)胞相比,衰老相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)顯著升高,結(jié)果如圖10(a)所示。我們?cè)贗MR90細(xì)胞中,用siRNA沉默GPX1(圖10(b)),并檢測(cè)處理之后IMR90細(xì)胞中衰老標(biāo)志物的表達(dá),結(jié)果顯示,GPX1沉默之后,衰老標(biāo)志物的表達(dá)升高(圖10(c))。SA-β-Gal染色顯示,處理組中,陽性細(xì)胞的比率占91.1%(圖10(d))。

圖10 siRNA沉默GPX1促進(jìn)IMR90細(xì)胞衰老Fig.10 siRNA silencing GPX1 promotes IMR90 cell senescence

3 討論

質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)分析的發(fā)展為蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究提供了有力的技術(shù)支持,并且質(zhì)譜已成為蛋白質(zhì)和代謝物鑒定與定量的重要工具[13]。蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)是細(xì)胞正常功能的基礎(chǔ),疾病通常伴隨著多種水平的蛋白質(zhì)功能障礙[14]。蛋白質(zhì)組學(xué)能夠快速確定細(xì)胞,組織或生物體中的總蛋白質(zhì)含量,因此可作為聯(lián)系基因型和表型的方法[15]。代謝組學(xué)反應(yīng)了復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)過程的結(jié)果,包括基因組,表觀遺傳學(xué),轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué),這意味著代謝組可能反映了整個(gè)系統(tǒng)的衰老和表型[16]。因此,通過衰老相關(guān)的代謝組學(xué)分析也可以幫助我們可以更好地理解衰老的機(jī)制。目前,正常細(xì)胞與誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞的蛋白質(zhì)水平差異以及代謝活性相似程度尚不清楚,因此在此項(xiàng)研究中,我們通過蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的聯(lián)合分析,探究了細(xì)胞衰老在基因型和表型方面的相關(guān)性。

本研究利用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究IMR90和IMRT細(xì)胞之間的蛋白差異。通過對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的分析,在IMRT細(xì)胞中,葡萄糖磷酸變位酶1(PGM1),6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)等糖酵解途徑中的催化酶,特長鏈特異性?；o酶A脫氫酶(ACADVL),短鏈烯酰輔酶A水合酶(ECHS1)等脂肪酸降解途徑中的關(guān)鍵酶,乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶1(ACAT1)等參與氨基酸代謝的相關(guān)酶,以及谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1),谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等谷胱甘肽代謝通路中相關(guān)酶的含量變化顯著。我們的研究還鑒定了差異蛋白富集通路,在IMRT細(xì)胞中上調(diào)的通路,如三羧酸循環(huán),丙酮酸代謝和脂肪酸降解等,在阿霉素誘導(dǎo)衰老的人乳腺癌細(xì)胞MCF7中進(jìn)行的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中同樣表現(xiàn)為上調(diào)[17]。此外,在IMRT細(xì)胞中,上調(diào)蛋白也顯著富集于帕金森病、亨廷頓病、阿爾茨海默病、非酒精性脂肪肝病等衰老相關(guān)疾病的通路中。

基于三重四極桿5500TMLC/MS/MS系統(tǒng)[18],我們對(duì)IMR90和IMRT進(jìn)行靶向代謝物鑒定。代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示,差異代謝物主要富集在氨基酸代謝通路,糖類代謝通路,脂質(zhì)代謝通路以及核苷酸代謝通路中。其中,6-磷酸葡萄糖,肉堿,磷酸膽堿,亮氨酸-異亮氨酸,谷氨酰胺和丙氨酸等在IMRT細(xì)胞中有顯著變化。6-磷酸葡萄糖是糖酵解過程中的產(chǎn)物,也能夠參與己糖胺途徑和磷酸戊糖途徑[19]。我們的研究發(fā)現(xiàn),IMRT細(xì)胞中,糖酵解和磷酸戊糖通路蛋白水平下降,G6PD的表達(dá)下降,相關(guān)代謝物6-磷酸葡萄糖含量下調(diào),這些結(jié)果為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)細(xì)胞衰老與葡萄糖代謝之間的關(guān)系提供了新的思考。肉堿是將脂肪酸運(yùn)輸?shù)骄€粒體以進(jìn)行β氧化所必需的。線粒體脂肪酸氧化途徑與衰老過程可能發(fā)生的各種分子和代謝機(jī)制密切相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道,酰基肉堿的積累表明線粒體功能障礙[20],線粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)失衡,進(jìn)而引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)[21-22]。而在我們的研究中,發(fā)現(xiàn)在IMRT細(xì)胞中的肉堿水平升高,與脂肪酸降解通路中的蛋白質(zhì)水平上調(diào)吻合。

細(xì)胞衰老表現(xiàn)出甘油磷酸膽堿與磷酸膽堿的比率增加,暗示了磷脂代謝在細(xì)胞衰老中的重要作用[23]。Quijano等[24]通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)在致癌基因誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞衰老過程中脂質(zhì)代謝發(fā)生了明顯變化。另一項(xiàng)研究通過NMR光譜法確定了WI-38成纖維細(xì)胞中甘油磷酸膽堿(GPC)的水平升高是其衰老的代謝指標(biāo),并且與引起衰老狀態(tài)的觸發(fā)因子無關(guān)[25-26]。在我們的研究中,衰老IMRT細(xì)胞中的磷酸膽堿水平顯著升高,進(jìn)一步證實(shí)了衰老細(xì)胞中的磷脂代謝的變化,這與前人的研究相同。因此,磷酸膽堿有望作為細(xì)胞衰老的潛在分子指標(biāo)。

代謝組學(xué)的分析結(jié)果表明,IMRT細(xì)胞中亮氨酸含量增加。Perez等[27]的研究表明,在肝星狀細(xì)胞中,亮氨酸通過影響線粒體功能進(jìn)而引起細(xì)胞的ROS水平升高。此外,亮氨酸通過抑制過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶以及蛋白質(zhì)硫醇基團(tuán)的氧化而在大腦皮層中引起氧化應(yīng)激[28]。谷氨酰胺本身可以促進(jìn)核苷酸的生物合成和尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-Glc NAc)的合成,以支持蛋白質(zhì)折疊和運(yùn)輸[29],或者通過谷氨酰胺酶(GLS或GLS2)轉(zhuǎn)化為谷氨酸[30]。谷氨酸可參與谷胱甘肽的合成,并在細(xì)胞中參與其他的代謝過程[31],對(duì)于維持細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)十分重要。因此,IMRT細(xì)胞中谷氨酰胺含量的下降,不利于細(xì)胞的ROS的清除,從而進(jìn)一步維持細(xì)胞的衰老狀態(tài)。研究表明,在果蠅中,丙氨酸的含量也會(huì)隨著年齡的增長而改變[32]。IMRT中丙氨酸的含量下調(diào),與丙氨酸、天氨酸和谷氨酸的代謝下調(diào)相關(guān),但丙氨酸與細(xì)胞衰老的關(guān)系并不清楚。

與此同時(shí),我們鑒定到谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)在IMRT細(xì)胞中顯著下調(diào),相關(guān)代謝物谷氨酰胺也顯著下調(diào)。因此,我們?cè)贗MR90細(xì)胞中沉默GPX1,結(jié)果顯示,沉默GPX1的IMR90細(xì)胞衰老相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)升高,并且SA-β-Gal染色為陽性。這表明GPX1蛋白水平對(duì)于IMR90細(xì)胞的衰老進(jìn)程至關(guān)重要。

綜上,本研究的結(jié)果表明,IMRT表現(xiàn)出衰老細(xì)胞的表型,與IMR90相比,IMRT細(xì)胞的蛋白組和代謝組發(fā)生了明顯變化,組學(xué)分析表明,這些差異與細(xì)胞衰老高度相關(guān),并且GPX1蛋白對(duì)于IMR90細(xì)胞的衰老進(jìn)程至關(guān)重要。細(xì)胞衰老是正常的生理過程,某些參與調(diào)節(jié)衰老的代謝物,如谷氨酰胺[33],已得到充分研究和認(rèn)識(shí)。但許多其他的代謝物,例如肉堿,磷酸膽堿和丙氨酸等,如何調(diào)控細(xì)胞衰老進(jìn)程,目前仍不清楚。圍繞這些代謝物的研究將幫助我們更好地了解介導(dǎo)細(xì)胞衰老的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。本研究從多組學(xué)的角度分析了細(xì)胞衰老過程中與衰老相關(guān)的蛋白質(zhì)和代謝物的變化,旨在尋找與細(xì)胞衰老發(fā)生發(fā)展相關(guān)的特異性蛋白和代謝物,進(jìn)而為探究細(xì)胞衰老機(jī)制,篩選細(xì)胞衰老的潛在生物標(biāo)志物及靶向清除衰老細(xì)胞藥物提供理論依據(jù)。