地烏皂苷成分的研究

羅美琪, 曾文麗，陳 玉，熊 慧

(1.中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢430074; 2.中南民族大學(xué) 藥學(xué)院,湖北 武漢430074)

1 引言

地烏為湖北省土家族習(xí)用藥材， 為毛茛科植物林蔭銀蓮花(Anemoneflaccida)的干燥根莖, 夏季采挖, 除去須根, 洗凈, 干燥。 主要分布于陜西南部、甘肅南部、江蘇南部、浙江西北部、江西、湖北西部、湖南、四川、貴州、云南西北部, 具有祛風(fēng)濕, 利筋骨之功效。 常用于風(fēng)濕疼痛, 跌打損傷[1, 2]。 研究發(fā)現(xiàn)地烏含有黃酮、甾體、香豆素、有機(jī)酸、酚類和五環(huán)三萜類皂苷等多種化學(xué)成分, 其中五環(huán)三萜皂苷為其主要的活性成分，其苷元主要為齊墩果酸, 通常C-3位和C-28位與糖鏈相連形成皂苷。 為進(jìn)一步研究地烏的化學(xué)成分、探究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ), 本文采用大孔吸附樹(shù)脂D101色譜、中壓反相色譜、硅膠色譜、制備型高效液相色譜等方法分離純化, 并結(jié)合現(xiàn)代波譜技術(shù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)。 從乙醇提取物中分離得到9個(gè)三萜皂苷。

2 儀器、試劑及藥材

核磁共振波譜儀(AVANCEIIITM500MHz, 德國(guó)布魯克); 高效液相色譜儀(Ultimate3000半制備型, 美國(guó)戴安, DAD檢測(cè)器); 半制備型色譜柱(YMC-PackODS-A, 250 mm×10.0 mm, 5 um); 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE2000A, 上海亞榮生化儀器廠); 循環(huán)水式真空泵(SHB-I, 鄭州長(zhǎng)城儀器); 正相硅膠(200～300目, 青島海洋化工); 反相硅膠(50 um, YMC·GELODS-A-HG, AAG12S50); 硅膠板GF254(青島海洋化工); 分析純?nèi)軇?國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑), 色譜純?cè)噭?昌泰興業(yè))。

圖1 化合物1～9的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

地烏藥材(一)采自湖北省長(zhǎng)陽(yáng)土家族自治縣都鎮(zhèn)灣鎮(zhèn)璞嶺村(2021年6月份), 地烏藥材(二)采自湖北省長(zhǎng)陽(yáng)土家族自治縣都鎮(zhèn)灣鎮(zhèn)璞嶺村(2020年6月份), 由中南民族大學(xué)劉新橋博士鑒定為毛茛科植物林蔭銀蓮花Anemone flaccida Fr.Schmidt的根-地烏, 存放于中南民族大學(xué)藥學(xué)院。

3 提取與分離

新鮮地烏藥材(一)200 g，自然陰干粉碎, 用70%乙醇浸泡提取3次, 每次24 h, 提取液減壓過(guò)濾濃縮得乙醇提取物60.3 g, 提取物水溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次, 乙酸乙酯、正丁醇萃取物減壓濃縮分別得到2.9 g、31.2 g。 正丁醇部分經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂D101柱層析, 依次用純水、30%、50%、70%、100%乙醇-水梯度淋洗, TCL檢測(cè)并合并得到5個(gè)流分,(Fr.1～Fr.5), Fr.2經(jīng)HPLC[流動(dòng)相梯度洗脫, 0～25 min: 28%～30% CH3CN/H2O; 25～40 min： 30% CH3CN/H2O, 流速(3 mL/min)]制備得化合物1(23.9 mg, tR= 35 min), 化合物2(5.9 mg,tR= 40 min)。 Fr.3經(jīng)HPLC[流動(dòng)相, V(乙腈)∶V(水)= 58∶42, 流速(3 mL/min)]制備得化合物3(5.9 mg,tR= 6 min), Fr.4經(jīng)HPLC[流動(dòng)相梯度洗脫, 0～25 min: 28～33% CH3CN/H2O; 25～45 min: 33% CH3CN/H2O, 流速(3 mL/min)]制備得到化合物4(8.8 mg,tR= 40 min), 化合物5(4.5 mg, tR= 43 min); Fr.4經(jīng)過(guò)中壓反相柱層析甲醇-水梯度分離, 依次用30%、50%、60%、70%、100%甲醇-水洗脫, TCL檢測(cè)并合并得到5個(gè)組分(Fr.4.1～Fr.4.5), Fr.4.1再經(jīng)過(guò)中壓反相柱層析甲醇-水梯度分離, 依次用30%、50%、40%、55%、60%、100%甲醇-水洗脫, 得到5個(gè)組分(Fr.4.1.1～Fr.4.1.6), Fr.4.1.2經(jīng)HPLC[流動(dòng)相梯度洗脫, V(乙腈)∶V(水)= 30∶70, 流速(3 mL/min)]進(jìn)行純化分離得到化合物6(4.1 mg, tR= 16 min)。Fr.4.1.5經(jīng)HPLC[流動(dòng)相梯度洗脫,V(乙腈)∶V(水)=30∶70,流速(3 mL/min)]進(jìn)行純化分離得到化合物7(6.3 mg, tR=25 min)。

干燥地烏藥材(二)100 g粉碎, 用70%乙醇浸泡提取三次, 每次24 h, 提取液減壓過(guò)濾后濃縮得乙醇提取物21.0g, 提取物水溶后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次, 乙酸乙酯相、正丁醇萃取物減壓濃縮分別得到1.0 g、13.1 g。正丁醇部分經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂D101柱層析, 依次用純水、30%、50%、70%、100%乙醇-水梯度淋洗, TCL檢測(cè)并合并得到4個(gè)流分,(Fr.1～Fr.4), Fr.3經(jīng)過(guò)中壓反相柱層析甲醇-水梯度分離, 依次用30%、50%、60%、70%、100%甲醇-水洗脫, TCL檢測(cè)并合并得到7個(gè)組分(Fr.3.1～Fr.3.7), Fr.3.6經(jīng)HPLC[流動(dòng)相, V(乙腈)∶V(水)= 30∶70, 流速(3 mL/min)]進(jìn)行純化分離得到化合物8(30 mg, tR= 13 min), 9(25 mg, tR= 17 min)。

4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為白色無(wú)定型粉末, 硫酸-香草醛顯示紫紅色。HRE-SI-MS m/z: 1101.55173 [M-H]-(計(jì)算值1101.54871, C54H85O23), 分子式為C54H86O23,1H NMR(500 MHz, CD3OD)δH: 0.80(3H, s), 0.85(3H, s), 0.91(3H, s), 0.95(3H, s), 0.96(3H, s), 1.05(3H, s), 1.16(3H, s), 1.27(3H, d,J= 6.0Hz), 3.16(1H, dd,J= 11.5, 4.0 Hz), 4.38(1H, d,J= 8.0 Hz), 4.40(1H, d,J= 7.5 Hz), 5.25(1H, br s), 4.82(1H, s), 5.21(1H, d,J= 8.0 Hz),13C NMR見(jiàn)表1。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3]對(duì)比一致, 故鑒定化合物1為地烏皂苷W0a。

化合物2為白色無(wú)定型粉末, 硫酸-香草醛顯示紫紅色。HRE-SI-MS m/z: 955.49609[M-H]-(計(jì)算值955.49080, C48H75O19), 分子式為C48H76O19,1H NMR(500MHz, CD3OD)δH: 0.79(3H, s), 0.84(3H, s), 0.90(3H, s), 0.93(3H, s), 0.95(3H, s), 1.08(3H, s), 1.14(3H, s),3.16(1H, dd,J= 3.6, 13.8 Hz), 5.24(1H, br s),5.34(1H, d,J= 7.8 Hz), 4.33(1H, d,J= 7.8 Hz), 4.36(1H, d,J= 7.8 Hz),13C NMR見(jiàn)表1。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]對(duì)比一致, 故鑒定化合物2為地烏皂苷W0b。

化合物3為白色無(wú)定型粉末, 硫酸-香草醛顯示紫紅色。分子式為C48H78O17,1H NMR(500MHz, C5D5N)δH: 0.87(6H, s), 0.92(3H, s), 1.02(3H, s), 1.12(3H, s), 1.21(6H, s), 3.17(1H, dd,J= 4.0, 13.5 Hz), 5.42(1H, br s), 5.86(1H, br s), 4.98(1H, d,J= 7.0 Hz), 6.24(1H, d,J= 8.0 Hz),13C NMR見(jiàn)表1。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]對(duì)比一致, 故鑒定化合物3為cussonoside B。

化合物4為白色無(wú)定型粉末, 硫酸-香草醛顯示紫紅色。分子式C59H96O25,1H NMR(500M, C5D5N)δH: 0.89(9H, s), 1.10(3H, s), 1.20(3H, s), 1.24(3H, s), 1.25(3H, s), 1.72(3H, d,J= 6.0 Hz), 1.73(3H, d,J= 6.6 Hz), 3.32(1H, dd,J= 4.0, 11.5 Hz), 5.40(1H, br s), 6.56(1H, br s), 6.26(1H, d,J= 8.0 Hz), 5.88(1H, s), 5.01(1H, d,J= 7.5 Hz), 4.84(1H, d,J= 7.0 Hz),13C NMR見(jiàn)表1。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]對(duì)比一致, 故鑒定化合物4為地烏皂苷W3。

化合物5為白色無(wú)定型粉末, 硫酸-香草醛顯示紫紅色。分子式C59H96O25,1H NMR(500M, C5D5N),δH: 0.90(9H, s), 1.10(3H, s), 1.11(3H, s), 1.18(3H, s), 1.26(3H, s), 1.65(3H, d,J= 5.5 Hz), 1.73(3H, d,J= 6.0 Hz), 3.27(1H, dd,J= 4.0, 12.0, Hz),5.41(1H, br s), 6.27(1H, d,J= 8.0 Hz), 6.18(1H, br s), 5.02(1H, d,J= 7.9 Hz), 5.90(1H, s), 4.92(1H, d,J= 5.5 Hz),13C NMR見(jiàn)表1。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]對(duì)比一致, 故鑒定化合物5為地烏皂苷W1。

化合物6為白色無(wú)定型粉末, 硫酸-香草醛顯示紫紅色。分子式C60H98O27,1H NMR(500M, CD3OD)δH: 0.78(3H, s), 0.84(3H, s), 0.90(3H, s), 0.93(3H, s), 0.95(3H, s), 1.06(3H, s), 1.34(3H, s), 1.25(3H, d,J= 6.0 Hz), 3.19(dd, 1H,J= 3.5, 13.5 Hz), 5.24(1H, s), 5.32(1H, d,J= 8.0 Hz), 4.66(1H, d,J= 7.0 Hz),4.60(1H, br s),4.42(1H, d,J=7.0 Hz),4.39(1H,d,J=8.0 Hz),13C NMR見(jiàn)表1。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]對(duì)比一致,故鑒定化合物6為flaccidoside Ⅵ。

化合物7為白色無(wú)定型粉末, 硫酸-香草醛顯示紫紅色。分子式為C60H98O26.1H NMR(500M, C5D5N)δH: 0.81(3H, s), 0.84(6H, s), 1.04(3H, s), 1.16(3H, s), 1.19(3H, s), 1.21(3H, s), 1.67(3H, d,J= 6.0 Hz), 1.68(3H, d,J= 6.0 Hz), 3.31(1H, dd,J= 4.0, 11.5 Hz), 4.91(1H, d,J= 7.0 Hz), 4.96(1H, d,J= 8.0 Hz), 5.36(1H, br s), 5.84(1H, s), 6.21(1H, d,J= 8.5 Hz), 6.56(1H, s),13C NMR見(jiàn)表1。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]對(duì)比一致, 故鑒定化合物7為anhuienoside E。

化合物8為白色無(wú)定型粉末, 硫酸-香草醛顯示紫紅色。HRE-SI-MS m/z: 1243.60278[M+Na]+(計(jì)算值1243.60820,C59H96O26Na), 分子式為C59H96O26，1H NMR(500MHz, C5D5N)δH: 0.91(9H, s), 1.12(6H, s), 1.24(3H, s),1.28(3H,s),1.72(3H, d,J= 6.6 Hz), 3.32(1H, dd,J= 3.0, 11.0 Hz), 5.39(overlapped),4.84(1H, d,J=5.5 Hz), 5.40(overlapped), 6.27(1H,d,J=7.5 Hz), 5.01(1H, d,J= 8.0 Hz), 5.89(1H, s)，13C NMR見(jiàn)表1。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]對(duì)比一致, 故鑒定化合物8為卵葉銀蓮花苷A。

化合物9為白色無(wú)定型粉末, 硫酸-香草醛顯示紫紅色, HRE-SI-MS m/z: 1243.60278[M+Na]+(計(jì)算值1243.60820, C59H96O26Na, 分子式為C59H96O26,1H NMR(500MHz, C5D5N)δH: 0.88(3H, s), 0.89(3H, s), 0.90(3H, s),1.06(3H,s),1.10(3H,s),1.22(3H,s),1.23(3H,s),1.72(d,3H,J=7.8 Hz),3.19(1H,m),5.41(1H,br s),4.98,(1H,d,J=5.5 Hz),5.21(1H,d,J=7.5 Hz), 6.27(1H, d,J=7.5 Hz),5.01(1H,d,J=8.0 Hz),5.89(1H,s),13C NMR見(jiàn)表1。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]對(duì)比一致,故鑒定化合物9為卵葉銀蓮花苷B。

表1 化合物1-913C NMR數(shù)據(jù)

續(xù)表1

5 結(jié)論

通過(guò)對(duì)地烏乙醇提取物的系統(tǒng)分離, 得到了9個(gè)化合物, 均為齊墩果烷型三萜皂苷, 其結(jié)構(gòu)分別鑒定為地烏皂苷W0b(1),地烏皂苷W0a(2), cussonoside B(3),地烏皂苷W3(4),地烏皂苷W1(5), flaccidoside Ⅵ(6), anhuienoside E(7),卵葉銀蓮花苷A(8), 卵葉銀蓮花苷B(9)?；衔?8)和化合物(9)為首次從地烏中分離得到。本文分離鑒定的9個(gè)化合物的苷元均為齊墩果酸, 糖鏈主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸組成。除了化合物2, 其余化合物的C-28位的糖鏈均為28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基, 這些化合物之間的區(qū)別在于C-3位連的糖鏈不同, C-3位連的糖鏈主要是由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖組成兩個(gè)糖的糖鏈或葡萄糖醛酸的單糖糖鏈。此外, 同地區(qū)同種藥材, 不同時(shí)間采收，其皂苷類化學(xué)成分會(huì)有一定程度的差異。