香樟葉浸提物對(duì)銅綠微囊藻的抑制研究

王 玲，吳曉青，單 龍

(江蘇省鹽城環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇 鹽城 224000)

1 引言

樟樹系樟樹屬的常綠喬木植物,是我國(guó)亞熱帶綠闊葉林的主要樹種之一，資源豐富。樟樹具有驅(qū)蟲、防腐、耐蛀的特點(diǎn)，可提取樟樹葉色素、香料等用來制成植物農(nóng)藥、氧化劑和醫(yī)藥產(chǎn)品等[1～3]。樟樹葉為可再生資源,其應(yīng)用前景廣闊，其含有的黃酮類化合物具有抗過敏、降血壓、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、保肝和降血脂等活性[4，5]。在食品學(xué)和醫(yī)學(xué)中均已得到廣泛應(yīng)用，在食品工業(yè)上可作抗氧化劑、色素和甜味劑等[6],在醫(yī)學(xué)上對(duì)治療冠心病、腦血栓和消除自由基等方面有顯著效果[7]。目前，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究大多僅針對(duì)樟樹葉中精油的提純和利用[8]，而對(duì)于其黃酮的提取及含量測(cè)定研究甚少。本文采用乙醇提取法提取樟樹葉中的黃銅類化合物，并對(duì)對(duì)每個(gè)影響因素進(jìn)行了分析，采用正交實(shí)驗(yàn)確定了最佳提取方案。同時(shí)采用硝酸鋁比色法測(cè)定了香樟葉中黃酮的含量。

微囊藻是一類全球性分布的藍(lán)藻，在我國(guó)大部分富營(yíng)養(yǎng)化的水體中，銅綠微囊藻在數(shù)量和發(fā)生頻率上都占有優(yōu)勢(shì)[9，10]。銅綠微囊藻為多細(xì)胞的群體,細(xì)胞呈淺藍(lán)色、亮綠色或橄欖綠色,大多生長(zhǎng)在湖泊池塘等有機(jī)質(zhì)豐富的水體中,營(yíng)浮游生活。當(dāng)條件適合時(shí),常會(huì)暴發(fā)大規(guī)模的水華[11]，并且在藻細(xì)胞死亡或細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)時(shí)會(huì)向水中釋放藻毒素導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)失衡，危害人體健康[12，13]。因此，有效控制水體富營(yíng)養(yǎng)化,防治水華成為環(huán)境領(lǐng)域需要深入研究的前沿和熱點(diǎn)問題。

化感物質(zhì)是一類由植物或微生物產(chǎn)生的天然活性物質(zhì)，具有易降解、高效性等優(yōu)點(diǎn)，不會(huì)在生態(tài)系統(tǒng)中積累，生態(tài)安全性良好[14～16]。近期，國(guó)內(nèi)外相繼開展了利用化感物質(zhì)抑制銅綠微囊藻的研究，如Xiao等[17]從大麥秸稈中分離出的黃酮木質(zhì)素(Salcolin)，對(duì)銅綠微囊藻具有抑制作用；Li等[18]發(fā)現(xiàn)從蘆葦中提取的2-甲基乙酰乙酸乙酯(EMA)能夠有效抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)；Nakai等[19]從穗狀狐尾藻中分離出水溶性多酚和脂肪酸，并證實(shí)以上物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻具有強(qiáng)抑制作用；胡利靜等[20]使用水楊酸抑制銅綠微囊藻，同樣取得了良好的抑藻效果；趙倩名等[21]研究表明槲皮素、兒茶素、山奈酚、異鼠李素和木犀草素在一定程度上阻礙了銅綠微囊藻細(xì)胞的生長(zhǎng)和對(duì)光的捕獲與吸收，從而導(dǎo)致其正常生理代謝功能紊亂。因此，本文選用香樟葉提取液以及加入聚丙烯酰胺緩釋劑后研究提取液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)，以期為揭示黃酮化合物抑制藻類生長(zhǎng)的機(jī)理提供進(jìn)一步的理論支持。

2 材料和方法

2.1 材料與儀器

香樟葉采自江蘇省鹽城市鹽塘河公園植物園內(nèi)，所有化學(xué)試劑均為AR級(jí)。

2.2 銅綠微囊藻的培養(yǎng)

銅綠微囊藻使用BG-11培養(yǎng)液，其配制及用量見表2。

表2 BG-11母液成分及培養(yǎng)液配制用量

將銅綠微囊藻接種于BG-11培養(yǎng)液(用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌)，培養(yǎng)溫度25±2 ℃, 光照強(qiáng)度為12000×66%lx，光暗比12∶12，靜置培養(yǎng)，每天定時(shí)搖動(dòng)。培養(yǎng)7 d后, 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。當(dāng)藻生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)增長(zhǎng)末期后，數(shù)其個(gè)數(shù)，在達(dá)到106個(gè)/mL后即可用于實(shí)驗(yàn)。藻種每7 d轉(zhuǎn)接1次，使細(xì)胞始終處于旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以備實(shí)驗(yàn)使用。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

在接有藻種的培養(yǎng)液中加入一定系列濃度的植物提取液，每天觀察藻的生長(zhǎng)(測(cè)定藻個(gè)數(shù)、光密度)，由此分析提取液對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)是否有抑制作用。

2.4 數(shù)據(jù)處理

提取液對(duì)藻類的抑制率公式為:

IR(%) = (1-N/N0)×100%

(1)

式(1)中,IR為抑制率；N為加入提取液組藻密度；N0為對(duì)照組藻密度。

3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

3.1 提取液的制備

采摘新鮮的香樟葉，洗凈，放于烘箱中30～40 ℃左右烘干，粉碎成粉。

準(zhǔn)確稱取10 g左右的香樟葉粉末于燒杯中，加入適量的純凈水，浸泡48 h，超聲提取，減壓抽濾，定容成100 g(干重)/L，即為水提取液。4 ℃下保存待用。

準(zhǔn)確稱取10 g左右的香樟葉粉末于燒杯中，加入適量的提取劑丙酮(甲醇)，浸泡48 h，超聲提取，減壓抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在35℃左右減壓蒸餾，以除去提取劑丙酮(甲醇)，剩余提取物用蒸餾水溶解并定容成100 g(干重)/L，即為丙酮(甲醇)提取液。4℃下保存待用。

制得200 g/L的香樟葉水提取液，以2 g聚丙烯酰胺/100 g提取液的比例加入緩釋劑，即為緩釋水提取液，4 ℃下保存待用。

3.2 化感作用實(shí)驗(yàn)

取提取液為母液，稀釋為不同的濃度梯度，得到提取液的濃度系列。當(dāng)藻細(xì)胞初始濃度為1×106個(gè)/mL左右時(shí)，在無菌條件下將提取液、藻種(5 mL)置于250 mL錐形瓶?jī)?nèi),加入培養(yǎng)液使培養(yǎng)體系總體積為200 mL。光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件光暗比：14∶10,溫度25±2 ℃。實(shí)驗(yàn)期間每日定時(shí)搖動(dòng)各錐形瓶?jī)纱危瑫r(shí)隨機(jī)調(diào)換錐形瓶在培養(yǎng)箱中的位置。

3.3 藻生長(zhǎng)量的測(cè)定

采用藻細(xì)胞計(jì)數(shù)和光密度2個(gè)指標(biāo)表示藻生長(zhǎng)量。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法是用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡(10×40倍)下計(jì)數(shù),平行計(jì)數(shù)2次,取平均值作為此樣品計(jì)數(shù)結(jié)果。光密度的測(cè)定方法是用722型分光光度計(jì)在波長(zhǎng)650 nm下,以蒸餾水作為參比,測(cè)定藻液的吸光度A650。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

4.1 香樟葉水提取液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

與空白對(duì)照相比，加入香樟葉水浸提液后，銅綠微囊藻的生長(zhǎng)都受到了一定程度的抑制，浸提液濃度越大，抑制作用效果越明顯。在光密度趨勢(shì)圖中，浸提物濃度為1 g/L、2 g/L、4 g/L的藻液光密度都大于對(duì)照組，而濃度為9 g/L、12 g/L藻液的光密度明顯小于對(duì)照組，7 g/L時(shí)，光密度與空白對(duì)照部分重疊，相差不大。光密度趨勢(shì)圖總體上表現(xiàn)為低促高抑作用(圖1～3)。

圖1 添加香樟葉水浸出液的銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線的影響

圖2 添加香樟葉水浸出液的銅綠微囊藻光譜吸收曲線

圖3 添加香樟葉水浸出液的銅綠微囊藻抑制率曲線

4.2 香樟葉甲醇提取液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

香樟葉甲醇浸提液是對(duì)甲醇浸泡抽濾液在35 ℃下減壓蒸餾，基本去除甲醇溶劑后，用水溶解(不溶物超聲溶解)并定容為100g/L，這樣可以扣除溶劑甲醇對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響。另外，由于浸提液本身有顏色，對(duì)光密度有一定的影響，所以采取不加藻而提取物濃度相同的空白培養(yǎng)液作為背景，以扣除背景影響(圖4、5)。

圖4 添加香樟葉甲醇浸出液的銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線的影響

圖5 添加香樟葉甲醇浸出液銅綠微囊藻光譜吸收曲線

不管是藻密度趨勢(shì)圖還是光密度趨勢(shì)圖，都可以看出，加入甲醇浸提液后，銅綠微囊藻的生長(zhǎng)都受到抑制，而且浸提液濃度越大，抑制作用越強(qiáng)(圖6)。

圖6 添加香樟葉甲醇浸出液銅綠微囊藻抑制率曲線

藻密度趨勢(shì)圖中，1 g/L、2 g/L、4 g/L的浸提液中，藻的生長(zhǎng)雖然受到抑制，但是抑制效果并不明顯，抑制率在50%上下徘徊，而8 g/L開始，抑制效果顯著上升，基本在80%左右(除了第2天，藻計(jì)數(shù)可能存在一定誤差)。而光密度趨勢(shì)圖也可以看出，1 g/L、2 g/L、4 g/L浸提液的吸光度也都處于大于0的狀態(tài)，8 g/L時(shí)，吸光度在0左右，而之后的濃度(12 g/L、16 g/L)吸光度都為負(fù)值。

4.3 香樟葉丙酮提取液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

丙酮提取液制作與甲醇提去液相似，既要扣除溶劑對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響又要扣除提取物本身顏色對(duì)吸光度的影響。

藻密度趨勢(shì)圖中，加入浸提液后，培養(yǎng)前期(2 d)，藻的生長(zhǎng)量都很小，后期(3 d后)，低濃度的浸提液中藻開始明顯生長(zhǎng)，而高濃度浸提液中藻細(xì)胞數(shù)依然很少。

藻生長(zhǎng)穩(wěn)定后(2 d后)，基本上所有濃度的浸提液中，銅綠微囊藻的抑制率都要超過50%，表現(xiàn)為顯著抑制，只有在后期(第7 d)，低濃度的浸提液才表現(xiàn)出抑制率快速下降的問題，這說明它們的作用不持久，而高濃度是相對(duì)比較穩(wěn)定。

光密度趨勢(shì)圖中，基本上所有濃度的浸提物的吸光度都表現(xiàn)為負(fù)值(除了0.5 g/L的第6、7 d)，這說明丙酮浸提液抑制效果總體很好(圖7～9)。

圖7 添加香樟葉丙酮浸出液銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線

圖8 添加香樟葉丙酮浸出液銅綠微囊藻光譜曲線

圖9 添加香樟葉浸出液銅綠微囊藻抑制率曲線

4.4 同一濃度不同溶劑提取液對(duì)銅綠微囊藻的生物量的影響

在3 g/L時(shí)，甲醇、水、丙酮浸提液都表現(xiàn)了抑制作用，而甲醇浸提液開始表現(xiàn)出抑制作用，所以采用3 g/L時(shí)3種溶劑的浸提液作為比較，以此來比較3種溶劑提取效果(圖10)。

圖10 添加相同濃度不同溶劑香樟葉浸出液銅綠

不同溶劑的提取液制作過程基本上消除了溶劑本身對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響，這樣可以直接通過藻的生長(zhǎng)情況來判斷溶劑的提取效果。圖10即為3 g/L濃度時(shí)3種溶劑提取液抑制藻生長(zhǎng)的抑制率趨勢(shì)圖，從圖中可以看出，丙酮的提取液抑制作用最好，水次之，甲醇抑制效果最低。

4.5 香樟葉水提取液加入緩釋劑聚丙烯酰胺對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

在香樟葉水提取液加入聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺可以先將提取物包裹在凝膠組織中，在培養(yǎng)液中適時(shí)釋放，以達(dá)到與培養(yǎng)液中提取物濃度保持平衡，這樣既可以保證培養(yǎng)液中提取物的濃度保持在同一濃度，也可以使抑制作用時(shí)間持續(xù)長(zhǎng)久一些。

香樟葉水浸提液中加入緩釋劑后，從藻密度趨勢(shì)圖中看出，濃度為4 g/L、8 g/L、甚至是12 g/L時(shí)，藻的密度都比空白對(duì)照組大，表現(xiàn)為促進(jìn)作用。但是16 g/L開始，藻密度就急速降低，從抑制率趨勢(shì)圖可以看出，16 g/L開始，抑制率基本保持在50%以上，而且在抑制率趨勢(shì)圖中，可以看出，低濃度是浸提液的抑制率有上升的趨勢(shì)，開始表現(xiàn)為小的抑制作用。同樣，這樣的低促高抑的趨勢(shì)也可以在光密度趨勢(shì)圖中看出(圖11～圖13)。

圖11 添加香樟葉水浸提液緩釋后銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線

圖12 添加香樟葉水浸出液緩釋后銅綠微囊藻光譜曲線

圖13 添加香樟葉水浸出液緩釋后銅綠微囊藻抑制率曲線

出現(xiàn)這種結(jié)果，可能一部分是因?yàn)樘崛∫旱囊种谱饔貌粔蛎黠@，另外，聚丙烯酰胺緩釋劑本身可能對(duì)藻的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)過程中，加入聚丙烯酰胺的藻培養(yǎng)液有寫粘稠，有部分藻黏在錐形瓶的底部，無法進(jìn)行計(jì)數(shù)，這對(duì)藻密度的結(jié)果有很大影響，但是這也從另一個(gè)側(cè)面說明，聚丙烯酰胺可以促進(jìn)藻類的絮凝沉降，那么，在實(shí)際應(yīng)用中，聚丙烯酰胺可以作為絮凝劑，加速造的絮凝沉降，并在水體與底泥的界面上抑制藻類的生長(zhǎng)。

4.6 同一濃度下有無緩釋劑對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響比較

4 g/L時(shí)，香樟葉水浸提液對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)為明顯的抑制作用，抑制率基本高于50%，而加入緩釋劑后，藻密度明顯增大，抑藻效率下降，甚至表現(xiàn)出促進(jìn)藻類生長(zhǎng)。這坑內(nèi)一部分是因?yàn)樵宄练e在錐形瓶底部，另外，聚丙烯酰胺對(duì)藻的生長(zhǎng)可能有一定的促進(jìn)作用(圖14)。

圖14 同一濃度下有無緩釋劑對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線影響比較

5 結(jié)論

(1)香樟葉的水、甲醇、丙酮等溶劑的提取液對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)都有一定的抑制作用，且提取液濃度越高，抑制效果越好。水提取液還表現(xiàn)出低促高抑的作用，分界濃度為7 g/L。

(2)香樟葉的水、甲醇和丙酮3種溶劑的提取液中，丙酮提取液的抑制效果最明顯，水次之，甲醇抑制效果最低。

(3)香樟葉水提取液加入聚丙烯酰胺緩釋劑后，對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)也表現(xiàn)出一定的低促高抑作用，但是作用效果比水提取液抑制效果差，可能是因?yàn)榫郾０繁旧韺?duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，另外由于加入了聚丙烯酰胺，培養(yǎng)液有些粘稠，較多藻沉積在錐形瓶底部對(duì)藻的計(jì)數(shù)也有較大影響。