抗肺炎克雷伯氏菌的北冰洋來源菌株的篩選與鑒定

石悅煒，徐麓凱，李相達(dá)，陳 怡，鄭 立，金黎明

(1.大連民族大學(xué) 生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116605；2. 自然資源部第一海洋研究所自然資源部海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266061)

肺炎克雷伯氏菌是腸桿菌科克雷伯氏菌屬的一種革蘭氏陰性桿菌，自然存在于健康人體中，大多呈大葉分散，一般出現(xiàn)在肺上葉(右上葉多)，在臨床中該菌是第二大條件致病菌。具有健康免疫系統(tǒng)的人很少會發(fā)生該菌引起的疾病感染，但在免疫力受損、防御功能缺陷或者接受有創(chuàng)傷性治療的情況時(shí)會引發(fā)肺炎等炎癥疾病[1]。肺炎克雷伯氏菌的宿主范圍較廣，不僅能引起包括人類和靈長類的動(dòng)物感染肺內(nèi)出血、膿氣胸、心包炎等疾病，還能引起植物疾病，如玉米頂腐病、香蕉葉斑病、高粱葉斑病和石榴枯萎病等[2]。近年來，因?yàn)榭股卦谂R床感染疾病中的大規(guī)模應(yīng)用和不規(guī)范使用，部分正常菌群、條件致病菌正慢慢取代傳統(tǒng)致病菌而變成主要病原菌[3]。肺炎克雷伯氏菌是社區(qū)獲得性感染的首要致病菌之一，它會致使呼吸道、消化道和泌尿系統(tǒng)產(chǎn)生感染，在新生兒病房、泌尿科病房等病房突發(fā)盛行[4]。肺炎克雷伯氏菌對抗生素耐藥的情況越來越不樂觀，特別是對碳青霉烯類的耐藥性十分嚴(yán)重，也造成了臨床治療上的難題。因此，尋找高效、低毒、安全、穩(wěn)定的抗肺炎克雷伯氏菌藥物迫在眉睫，對于控制感染流行和臨床治療有著重要的意義[5]。

海洋具有獨(dú)特的氣候及地理特征，如高壓、寡營養(yǎng)、無光照、局部高溫等，生存于其中的海洋微生物為了能適應(yīng)這些環(huán)境，必須以不同于陸生微生物的生存策略以求生存，從而形成了特殊的微生物生態(tài)系統(tǒng)。因此海洋微生物也被賦予了獨(dú)特的生物學(xué)特性，使其可能產(chǎn)生不同于陸生微生物的結(jié)構(gòu)新穎、性質(zhì)獨(dú)特的代謝產(chǎn)物，為新藥及新抗生素的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。海洋成為了人類重要的微生物資源寶庫[6-8]，也使其孕育了獨(dú)特的微生物類群，為科研工作者研究微生物抗菌活性物質(zhì)提供條件，具有明顯的優(yōu)勢和特點(diǎn)。廣闊的海洋如同包攬星辰的宇宙，是生命的發(fā)源地也是生命的搖籃[9]，而海洋微生物資源的拓展和生物活性的發(fā)現(xiàn)已然成為人們研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，海洋特殊的生長環(huán)境增加了發(fā)現(xiàn)新型活性次級代謝產(chǎn)物的可能性，展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力[10-12]。

本研究以生物抗菌活性為導(dǎo)向，從北冰洋海泥樣品中分離純化并篩選出能夠抑制肺炎克雷伯氏菌生長的菌株，采用形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rDNA基因序列分析對其進(jìn)行菌種鑒定，并對其抑菌廣譜性進(jìn)行研究，為后期從中探索得到高效力抗菌活性物研究奠定基礎(chǔ)，并進(jìn)一步對其抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行研究，應(yīng)用前景廣闊。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣 品

樣品為自然資源部第一海洋研究所提供的南極科學(xué)考察得到的北冰洋海泥樣品。

1.1.2 菌 株

白色念珠菌(Candidaalbicans)CMCC 52201、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 6538、大腸桿菌(Escherichiacoli)CMCC 44102、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticu)CGMCC 1.1616、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PAO1、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)CICC 21484、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)BNCC 194496、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)BNCC 336951、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)BNCC 186113，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯(nutrient broth，NB)培養(yǎng)基：牛肉粉3 g、氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、去離子水1.0 L。

營養(yǎng)瓊脂(Nutrient Agar Medium，NA)培養(yǎng)基：牛肉粉3 g、氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、瓊脂20 g、去離子水1.0 L。

LB(Luria Broth)海水培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母提取物5 g、海水1.0 L。

LA(Luria Agar)海水培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母提取物5 g、瓊脂20 g，海水1.0 L。

葡萄糖培養(yǎng)基：蛋白胨2.7 g、氯化鈉5 g、磷酸氫二鈉0.3 g、1%的溴麝香草酚蘭水溶液3.0 ml、瓊脂15.0 g、去離子水1.0 L。

通用培養(yǎng)基：蛋白胨2 g、葡萄糖10 g、酵母膏1 g、瓊脂20 g、去離子水1.0 L。

明膠培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、明膠120 g、牛肉浸膏3 g、去離子水1.0 L。

苯丙氨酸培養(yǎng)基：DL苯丙氨酸2 g(或L苯丙氨酸1 g)、氯化鈉5 g、酵母浸膏3 g、瓊脂12 g、磷酸氫二鈉1 g、去離子水1.0 L。

MRS即用型培養(yǎng)基：MRS肉湯48.3 g、去離子水1.0 L。

BHI即用型培養(yǎng)基：BHI肉湯38.5 g、去離子水1.0 L。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、 ZWY-A2102C雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司)、HVE-50高壓滅菌器(日本SANYO)、SW-CJ-2FD潔凈工作臺(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、MJ-180B生化恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 海洋微生物的分離及純化

菌株的分離采用稀釋涂布平板法：取北冰洋海泥樣品0.5 g于試管中，加入4.5 mL生理鹽水，混勻，靜置2 h，取10-6～10-2稀釋濃度各100 μL，涂布平板。將上述接種完的培養(yǎng)皿，分別放在12 ℃和37 ℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5～6 d后，再用接種針挑取形態(tài)不同的細(xì)菌單菌落，分別在12 ℃和37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d。

1.3.2 拮抗菌株的篩選

初篩：吸取100 μL肺炎克雷伯氏菌懸液接種到40 mL NA培養(yǎng)基中，混勻，倒入培養(yǎng)皿待凝固，將待測菌液采用平板劃線法劃線于培養(yǎng)基上。37 ℃條件培養(yǎng)12 h，查看劃線的菌株區(qū)域旁是否出現(xiàn)明顯透明的抑菌帶。

復(fù)篩：采用瓊脂擴(kuò)散法[13]。吸取200 μL初篩顯示抑菌活性的菌懸液接種到200 mL液體LB海水培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)(180 r·min-1)24 h，發(fā)酵液6 000 r·min-1、4 ℃條件下離心10 min，取上清旋蒸濃縮100倍。12 000 r·min-1、4 ℃條件下離心10 min，取上清打孔。將300 μL海洋微生物粗發(fā)酵液加入孔中，37 ℃條件培養(yǎng)12 h，測量抑菌圈的直徑。重復(fù)上述步驟三次。

1.3.3 肺炎克雷伯氏菌拮抗菌株的鑒定

(1)形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)。將篩選得到的肺炎克雷伯氏菌拮抗菌株劃線接種于LA海水培養(yǎng)基中，37 ℃條件培養(yǎng)12 h，觀察其形態(tài)特點(diǎn)，再根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[14]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]對其生理生化特征進(jìn)行鑒定，包括革蘭氏染色、糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)等。

(2)分子生物學(xué)鑒定。使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：模板7 μL、細(xì)菌通用引物27F和1492R各2 μL、2×Taq Plus Master Mix酶25 μL、雙蒸水(dd H2O)14 μL，總體積為25 μL；PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min、98 ℃變性30 s、55 ℃退火15 s、72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸5 min。

由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心的GenBank數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行同源性搜索比對，再采用MEGA 6.0軟件中的鄰接法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

1.3.4 抑菌譜研究

采用瓊脂擴(kuò)散法研究菌株濃縮發(fā)酵液對各種致病菌的抑制效果[17]。鮑曼不動(dòng)桿菌使用BHI培養(yǎng)基、肺炎克雷伯氏菌使用NB培養(yǎng)基、屎腸球菌使用MRS培養(yǎng)基，其他致病菌均使用LB培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋微生物的分離純化

從北冰洋海泥樣品中共分離出114株海洋微生物。

2.2 肺炎克雷伯氏菌拮抗菌株的篩選

2.2.1 初篩結(jié)果

初篩出12株對肺炎克雷伯氏菌有明顯抑制性的菌株如圖1。

圖1 初篩結(jié)果

2.2.2 復(fù)篩結(jié)果

采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行復(fù)篩[18]，結(jié)果如圖2，見表1?？梢奛o.98發(fā)酵液抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)(22.21±0.37)mm。

圖2 12株菌株復(fù)篩結(jié)果菌譜圖

表1 12株菌株復(fù)篩結(jié)果菌譜直徑

2.3 No.98菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察

No.98菌株在LA海水培養(yǎng)基上形態(tài)如圖3a。長出的菌落為乳白色，半透明凸起的圓形，易挑起，無褶皺，表面光滑呈乳狀。革蘭氏鏡檢結(jié)果為紫色如圖3b，說明No.98菌株為革蘭氏陽性菌。

a)菌落形態(tài) b)革蘭氏染色結(jié)果圖3 No.98菌株的形態(tài)學(xué)特征

2.3.2 生理生化鑒定結(jié)果

No.98菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表2。由結(jié)果可知，No.98菌株能分解葡萄糖產(chǎn)酸且不產(chǎn)氣，能使明膠液化，能產(chǎn)生過氧化氫酶，苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)均呈陰性。

表2 菌株No.98的生理生化特征

2.3.3 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

基于16S rDNA基因序列構(gòu)建No.98菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。由圖可知，該發(fā)育樹為有根樹，有唯一特殊結(jié)點(diǎn)及方向，各點(diǎn)由唯一途徑產(chǎn)生不同結(jié)點(diǎn)。No.98菌株與其他芽孢桿菌屬菌株聚于同一根，故可推斷其為芽孢桿菌。因其與死谷芽胞桿菌(Bacillusvallismortis)聚于一支，親緣關(guān)系最為相近，結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化特征，暫定No.98菌株為死谷芽胞桿菌(Bacillusvallismortis)。

圖4 基于16S rDNA序列No.98菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 No.98菌株的抑菌譜

抑菌譜測定結(jié)果如圖5、見表3。根據(jù)初篩和復(fù)篩結(jié)果得出No.98菌株對肺炎克雷伯氏菌抑菌效果最好，對其他致病菌也有一定的拮抗作用。如，對作為革蘭氏陽性致病菌的屎腸球菌有抑制作用，抑菌圈為(12.33±0.04)mm；對作為革蘭氏陰性致病菌的鮑曼不動(dòng)桿菌有抑制作用，抑菌圈為(14.13±0.83)mm。由此可以看出No.98菌株具有廣譜抑菌性。但是No.98菌株對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、副溶血性弧菌沒有抑制性。

表3 菌株No.98抑菌譜的測定結(jié)果

圖5 No.98菌株抑菌譜圖

3 結(jié) 論

本研究以肺炎克雷伯氏菌為指示菌，從北冰洋海泥中共分離出114株海洋微生物，其中12株對肺炎克雷伯氏菌有抑制作用，抑菌效果最優(yōu)的為No.98菌株，其抑菌圈直徑達(dá)(22.21±0.37)mm。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定，確定其為死谷芽胞桿菌(Bacillusvallismortis)。通過抑菌譜實(shí)驗(yàn)得出該菌對鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、屎腸球菌、肺炎克雷伯氏菌和銅綠假單胞菌都具有一定的抑制作用，由此可以看出NO.98菌株具有較廣的抑菌譜。

近年來，極地微生物的研究迎來熱潮，由于其獨(dú)特的理化特性、新鮮的次生代謝產(chǎn)物和豐富的基因資源，在醫(yī)藥、環(huán)保、工業(yè)以及食品等多個(gè)領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。在本研究中，北冰洋微生物特殊的生存環(huán)境，有可能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的活性物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)篩選出NO.98菌株，后續(xù)將對其代謝物質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。