綿羊NDRG1 基因表達和干擾載體的構(gòu)建及驗證

龍德智，孫楠禎，郝科興，陳慧慧，王 靜，胡廣東

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832000）

N-myc 下游調(diào)節(jié)基因1（N-myc Downstream Regulated Gene 1，NDRG1）是一種蛋白大小為43 Kda，廣泛分布于哺乳動物組織中的轉(zhuǎn)移抑制因子。研究表明，該基因可參與包括NF-κB 通路[1]、TGF-β通路[2]和Wnt/β-catenin等信號通路的調(diào)控過程[3]，在多種轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[1]。研究表明，NDRG1通過Wnt/β-catenin通路調(diào)節(jié)鈣粘蛋白E（E-Cadherin）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）使細(xì)胞發(fā)生遷移或侵襲[4-5]。因此，NDRG1 被認(rèn)為是一種信號通路的中央調(diào)節(jié)劑。此外，NDRG1基因在妊娠小鼠胚胎附植過程中表達量顯著升高，深入研究發(fā)現(xiàn)，NDRG1表達變化會影響胚胎的粘附及侵襲過程，進而調(diào)控胚胎附植成敗[6]。

目前，關(guān)于NDRG1基因影響胚胎附植機制研究主要集中在人和小鼠上，與綿羊胚胎附植相關(guān)研究尚未見報道，而研究該基因?qū)d羊胚胎附植機制的調(diào)控，需要構(gòu)建可靠的轉(zhuǎn)基因載體。因此，本文以綿羊NDRG1基因為研究對象，利用RT-PCR 擴增綿羊NDRG1基因CDS 區(qū)，構(gòu)建表達和干擾載體并確認(rèn)其在細(xì)胞中的表達情況，為研究NDRG1基因在綿羊細(xì)胞中的作用提供研究材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HEK 293T 細(xì)胞、pcDNA3.1（+）和pGBplv-U6-mcherry-puro 質(zhì)粒由本實驗室保存，pGM-T 載體購自Promega 公司（美國），綿羊滋養(yǎng)層細(xì)胞由本實驗室利用組織塊分離法獲得。

1.2 主要試劑 Trizol 購自Invitrogen 公司（美國），T4 DNA 連接酶（TaKaRa，中國大連）、PrimeScriptTMRT-PCR Kit（TaKaRa，中國大連）購自寶生物工程（大連），HIFI DNA Taq 聚合酶購自全式金生物公司（中國北京），OMEGA 質(zhì)粒提取試劑盒（美國）購自上海生工生物工程有限公司，凝膠回收試劑盒購自Axygen生物技術(shù)有限公司（美國），大腸桿菌DH5α購自TIANGEN 公司（中國北京），DMEM 購自GIBCO 公司（美國），BamHI 和EcoRI 購自NEB 公司（美國），脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectamine 2000 ReAgent）購自Invitrogen 公司（美國），兔抗NDRG1 和鼠抗β-actin抗體購自碧云天公司（中國上海）。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI 已公布預(yù)測的綿羊NDRG1基因序列（登錄號：XM_027972876.2），利用Primer 5 軟件設(shè)計NDRG1 CDS 區(qū)擴增引物和qPCR 檢測引物，擴增引物上下游分別引入BamHI 和EcoRI 酶切位點（表1）；根據(jù)在線靶點設(shè)計軟件設(shè)計NDRG1-RNAi 片段，RNAi 片段添加Loop 環(huán)序列和KpnI 酶切位點并在上下游分別添加AgeI 和EcoRI 酶切位點（表1），送上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

表1 實驗所用引物及序列

1.4NDRG1基因CDS 區(qū)克隆 以綿羊滋養(yǎng)層細(xì)胞為材料，利用Trizol 法提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA 鏈。以制備的cDNA 為模板，PCR 擴增NDRG1基因CDS 區(qū)全序列。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：10×Buffer 5 μL，LA Taq 酶0.5 μL，dNTP 4 μL，上下游引物各1μL（10 μmol/L），cDNA 模板2 μL（1 μg/μL），補水至50 μL。PCR 反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，退火10 s，72℃延伸10 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段與pGEM-T Vector 載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，過夜培養(yǎng)挑取單菌落，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pNDRG1-T，由上海生工生物工程技術(shù)公司進行雙向測序。利用DNAMAN 軟件將測序結(jié)果與NCBI 已公布預(yù)測的綿羊NDRG1基因序列進行序列比對。

1.5 NDRG1 表達載體構(gòu)建 以重組質(zhì)粒pNDRG1-T 和pcDNA3.1（+）為模板，利用BamHI 和EcoRI 進行雙酶切，分別膠回收雙酶切后的NDRG1基因目的片段和pcDNA3.1（+）骨架載體，利用T4 DNA 連接酶于4℃水浴過夜連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，構(gòu)建表達載體命名為pcDNA3.1-NDRG1。

1.6 NDRG1 干擾載體構(gòu)建 將合成的干擾片段稀釋至50 μmol/L，取4.5 μL 的正義鏈和反義鏈寡核苷酸（oligo）序列和1 μL 退火buffer，于93℃ 3 min 進行退火反應(yīng)，降至室溫，-20℃保存待用。以pGBplv-U6-mcherry-puro 質(zhì)粒為模板，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶AgeI 和EcoRI 剪切，膠回收雙酶切后的載體骨架。將酶切后線性化的pGBplv-U6-mcherry-puro 與退火后的oligo 片段連接，反應(yīng)體系如下：ligation Mix 7.5 μL，回收的干擾載體1 μL，退火oligo 片段6.5 μL，總體系為15 μL，于恒溫水浴系統(tǒng)4 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，過夜培養(yǎng)挑取單菌落，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，分別命名為NDRG1-shRNA1、NDRG1-shRNA2、NDRG1-shRNA3 和NDRG1-shRNA4。

1.7 重組質(zhì)粒酶切鑒定 將抽提好的表達重組載體（pcDNA3.1-NDRG1）利用BamHI 和EcoRI 進行雙酶切鑒定，干擾重組載體（NDRG1-shRNA1、NDRG1-shRNA2、NDRG1-shRNA3 和NDRG1-shRNA4）利用KpnI 進行單酶切鑒定，于37℃恒溫水浴系統(tǒng)反應(yīng)1 h后凝膠電泳鑒定。鑒定結(jié)果無誤進行無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提以獲得足夠量重組質(zhì)粒，-20℃保存。

1.8 重組載體基本功能驗證

1.8.1NDRG1基因表達載體基本功能驗證 快速溶解HEK293T 于24 孔板加入含10%FBS 和1% 雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達70%～80%可進行轉(zhuǎn)染。設(shè)置空白組、C1 對照組（pEGFP-C1）和過表達組（pcDNA3.1-NDRG1），利用Lipofectamine 2000 ReAgent 脂質(zhì)體進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（相關(guān)過程參見說明書）。轉(zhuǎn)染48 h 后檢測NDRG1 轉(zhuǎn)錄水平，利用Trizol 法提取總RNA，使用Prime ScriptTMRT-PCR Kit 將樣品RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR 分析備用。qRT-PCR 反應(yīng)體系：10 μL SYBR Premix Ex Taq TM II（2×），PCR上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，2 μL cDNA 模板（50 ng/μL），6.4 μL ddH2O。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃50s；95℃5s，60℃30s，40個循環(huán)；95℃15s，60℃1min，95℃ 15 s。以β-actin基因為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算NDRG1基因的相對表達量（PCR 引物序列表見表1），各組實驗至少重復(fù)3 次。轉(zhuǎn)染48 h 后檢測NDRG1 蛋白表達水平，收集細(xì)胞利用細(xì)胞裂解液（由RIPA 裂解緩沖液和PMSF 蛋白酶抑制劑組成）重懸細(xì)胞，冰上裂解5 min。加入等量4×SDS-蛋白上樣緩沖液，置于100℃水浴鍋中煮沸10 min。將提取的細(xì)胞蛋白進行SDS-PAge凝膠電泳，各組蛋白上樣量均為20 μL，選用Blue Plus II Protein Marker。經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育，在暗室中使用Western Bright ECL 化學(xué)發(fā)光底物進行顯色反應(yīng)并用膠片曝光，用ImAgeJ 軟件對目的條帶進行灰度分析。

1.8.2NDRG1基因干擾載體基本功能驗證 轉(zhuǎn)染設(shè)置表達組（pcDNA3.1-NDRG1）、干擾載體對照PLV 組（pcDNA3.1-NDRG1 和pGBplv-U6-mcherry-puro）、N1 組（pcDNA3.1-NDRG1 和NDRG1-shRNA1）、N2組（pcDNA3.1-NDRG1 和NDRG1-shRNA2）、N3 組（pcDNA3.1-NDRG1 和NDRG1-shRNA3）和N4 組（pc DNA3.1-NDRG1 和NDRG1-shRNA4）。轉(zhuǎn) 染48 h 后檢測NDRG1 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的表達，方法見1.8.1。

1.9 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用單因素方差分析比較各處理組間NDRG1 轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平的差異，以LSD-t 檢驗法進行組間兩兩比較。“*”為P＜0.05，“**”為P＜0.01，“***”為P＜0.001，P＜0.05 即為顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1NDRG1基因CDS 區(qū)的獲取與序列分析 擴增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小為1 378 bp（圖1A），與NCBI 比對結(jié)果一致，TA 克隆載體雙酶切鑒定結(jié)果顯示目的片段大小與預(yù)期一致（圖1B）。綿羊NDRG1基因CDS 區(qū)核苷酸編碼氨基酸384 個，序列進行比對結(jié)果顯示，綿羊擴增片段與預(yù)測片段相比1 031位點存在一個G →A 堿基突變（圖1C），但氨基酸比對完全相同（圖1D），以上說明綿羊NDRG1基因CDS 區(qū)克隆成功。

圖1 NDRG1 基因克隆及鑒定

2.2 重組表達和干擾載體酶切鑒定結(jié)果 用BamHI 和EcoRI 雙酶切重組表達載體pcDNA3.1-NDRG1，得到2 條大小約為5 428 bp 和1 378 bp 的條帶（圖2A），結(jié)果與預(yù)期相符，證明重組表達載體構(gòu)建成功。用KpnI分別對4 條重組干擾載體NDRG1-shRNA1、NDRG1-shRNA2、NDRG1-shRNA3 和NDRG1-shRNA 4進行單酶切，得到2 條大小約5 651 bp 和2 041 bp 的兩條帶（圖2B），結(jié)果與預(yù)期相符，證明4 條重組干擾載體構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.3 重組表達質(zhì)粒在HEK293T 細(xì)胞中的功能驗證 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NDRG1 和pEGFP-C1 導(dǎo)入HEK293T 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h 后熒光觀察結(jié)果見圖3，結(jié)果初步判斷重組質(zhì)粒導(dǎo)入HEK293T細(xì)胞中。qRT-PCR結(jié)果顯示，pcDNA3.1-NDRG1 組NDRG1基因的表達水平極顯著高于空白對照組和C1對照組（圖4A）；Western Blot 結(jié)果顯示，出現(xiàn)了2條清晰的大小分別為43 kDa 和42 kDa 的蛋白條帶，結(jié)果與預(yù)期相符，pcDNA3.1-NDRG1 組NDRG1 蛋白表達水平極顯著升高（圖4B），上述結(jié)果表明，重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1-NDRG1 能正常在細(xì)胞中表達。

圖3 重組表達載體熒光鑒定（200 μm）

圖4 重組表達載體mRNA 和蛋白相對表達水平

2.4 有效干擾片段篩選結(jié)果 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染24 h 后觀察熒光圖為圖5，結(jié)果顯示重組干擾質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入HEK293T 細(xì)胞中。qRT-PCR 結(jié)果顯示，PLV 組與pcDNA3.1-NDRG1組相比NDRG1基因表達無顯著性差異；干擾組N1、N2、N3 和N4 組與pcDNA3.1-NDRG1 組相比NDRG1基因表達量均顯著或極顯著降低，N3 組NDRG1基因表達量最低，N1、N2、N3 和N4 組NDRG1基因相對表達量分別為36%、61%、30% 和79%，其干擾效率分別為64%、39%、70% 和21%。Western Blot 結(jié)果顯示，PLV 組與pcDNA3.1-NDRG1 組相比蛋白表達水平無顯著性差異，N1、N2、N3 和N4 組與pcDNA3.1-NDRG1 組相比蛋白表達水平均極顯著降低（圖6），N1、N2、N3 和N4 組NDRG1 蛋白相對表達量分別為9.4%、11%、9.2%和61%，其干擾效率分別為90.6%、89%、90.8%和39%，根據(jù)NDRG1 的表達水平篩選出N3 組干擾效果最好，即NDRG1-shRNA3 為最佳干擾載體（圖7）。

圖5 重組干擾載體熒光鑒定（400 μm）

圖6 重組干擾載體mRNA 和蛋白相對表達水平

圖7 重組干擾載體干擾效率

3 討 論

NDRG 家族中有4 個成員，即NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4，NDRG1是其中最早發(fā)現(xiàn)的基因[7]，NDRG 家族蛋白結(jié)構(gòu)相似度極高，有共同的α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)域，但NDRG1 更為特殊，其C 端（339-369殘基）存在10 個氨基酸組成的3 個串聯(lián)重復(fù)的序列（GTRSRSHTSE）[8]，這使得其能夠與金屬離子結(jié)合并參與應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞保護的生理功能相關(guān)[9-12]。NDRG1是一種能夠普遍表達于多種組織中的基因，但是其表達方式更具有選擇性，NDRG1 mRNA 能夠在心臟、卵巢、骨骼肌、結(jié)締組織和血管中表達，但其蛋白卻未能在這些組織中檢測出來，更深入的研究發(fā)現(xiàn)NDRG1 的亞細(xì)胞定位因組織的類型而不同，而細(xì)胞定位決定了其在細(xì)胞的功能，這也說明NDRG1 在不同細(xì)胞會行使不同的功能[13-14]。

關(guān)于綿羊NDRG1 表達載體和干擾載體的構(gòu)建在國內(nèi)未見報道，本實驗利用綿羊滋養(yǎng)層細(xì)胞cDNA，通過RT-PCR 的方法成功擴增出NDRG1基因CDS 區(qū)序列。經(jīng)比對顯示克隆的綿羊NDRG1 編碼區(qū)在1 031 位點存在一個由G 突變?yōu)锳 的單堿基突變，但氨基酸比對發(fā)現(xiàn)二者氨基酸完全相同，并未引起氨基酸序列的改變。核苷酸的差異可能來自于核苷酸的多態(tài)性，但并不影響蛋白的表達，克隆的綿羊NDRG1基因可用于后續(xù)實驗。

實驗中將克隆的NDRG1 序列插入pcDNA3.1+載體構(gòu)建表達載體，設(shè)置空白對照組，同時由于pcDNA3.1+不含熒光標(biāo)記基因故設(shè)置了C1 對照檢驗細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。RNAi 技術(shù)是用雙鏈RNA（Double-Stranded RNA）引起真核生物體內(nèi)同源序列mRNA 特異性降解從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上阻斷相關(guān)基因表達使基因沉默，根據(jù)其來源分為內(nèi)源性siRNA（endo-siRNA）和外源性siRNA（exo-RNA）[15]。由于siRNA 在細(xì)胞中易分解并不能長期存在，故實驗選擇構(gòu)建shRNA 干擾載體的方法達到干擾基因的目的。實驗中構(gòu)建了4 個干擾載體分別為NDRG1-shRNA1、NDRG1-shRNA2、NDRG1-shRNA3 和NDRG1-shRNA4，干擾的靶點位置分別為113、214、426 和602。干擾載體轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示重組干擾載體成功導(dǎo)入293T 細(xì)胞，實驗結(jié)果顯示4 個干擾載體都可以抑制NDRG1 蛋白在HEK293T 細(xì)胞的表達，即設(shè)計的干擾片段能靶向結(jié)合NDRG1基因113、214、426 和602 位點從而達到抑制基因表達的作用，其中靶點位置426 的干擾載體（NDRG1-shRNA3）干擾效果最好，干擾效率的差異和位點的不同有關(guān)[16]。

NDRG1 因為抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的能力受到關(guān)注，繼被確定為結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移因子后又證明NDRG1 能在其他組織中起到抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移能力[13]。Kachhap 等[17]深入探究發(fā)現(xiàn)其原理是NDRG1 能夠參與囊泡在核周區(qū)域和細(xì)胞表面之間的循環(huán)，即含有NDRG1 的囊泡與含有E-鈣粘蛋白（E-cadherin）的囊泡融合，使E-cadherin循環(huán)到細(xì)胞膜上影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化繼而影響癌細(xì)胞的侵襲與遷移。哺乳動物胚胎的著床方式為表面著床，胚胎滋養(yǎng)層僅與子宮腔上皮細(xì)胞接觸并在接觸位點發(fā)生粘附，細(xì)胞增殖、遷移，血管發(fā)生等生物學(xué)行為[18]。妊娠的發(fā)生從一定角度上來說與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移大相徑庭，其過程都發(fā)生細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Lachat 等[14]通過對大量組織進行免疫熒光和免疫組化證明NDRG1 mRNA 和蛋白能夠在胎盤組織中表達，NDRG1 在子癇孕婦胎盤中能夠差異性表達，并通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶（ERK）/基質(zhì)金屬蛋白9（MMP-9）通路影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲，同時NDRG1 的上調(diào)通過PI3K/AKT 抑制人胎盤的血管生成，研究人員也證明NDRG1 表達的降低會導(dǎo)致小鼠妊娠失敗[6,19-20]。為探究NDRG1基因在綿羊妊娠過程中的具體作用，本實驗構(gòu)建NDRG1 的表達及干擾載體為后續(xù)實驗提供實驗材料。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了綿羊NDRG1基因表達載體和干擾載體，為進一步研究NDRG1基因在綿羊中的調(diào)控機制提供材料。