褪黑素與內(nèi)源生物鐘介導的哺乳動物季節(jié)性繁殖機理研究進展

趙淑琴，韓亞軒，魯巨貴，楊 榛

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學基礎實驗教學中心，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅蘭州 730070；3.甘肅省蘭州市紅古區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，甘肅蘭州 730070）

在以往的生產(chǎn)生活中，特定物種的繁殖季節(jié)按照長期規(guī)律來看都是恒定不變的，雄性動物精子最大活躍期和雌性動物的排卵期都是在每年相對固定的時間開始和結束的，這種年度節(jié)律是通過復雜的調(diào)控機制進行調(diào)控[1]。季節(jié)性繁殖除受下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamic-Pituitary-Gonadal Axis，HPGA）的調(diào)控，還受內(nèi)源生物鐘調(diào)控。哺乳動物通過視網(wǎng)膜感知光周期的穩(wěn)定變化，將信號傳遞給下丘腦，此時一條途徑是位于下丘腦的視交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）對光信號作出整合，引起SCN 上生物鐘基因的表達發(fā)生變化，然后SCN 將此信號傳遞給外周生物鐘，引起繁殖相關的基因節(jié)律性表達，最終使動物生殖激素發(fā)生變化，調(diào)控動物的季節(jié)性繁殖；另一條途徑則是光周期信號作用于松果體，導致松果體節(jié)律性分泌褪黑素（Melatonin，Mel），褪黑素又參與HPGA 的調(diào)控，使生殖激素的分泌發(fā)生節(jié)律性變化，最終共同調(diào)控動物的季節(jié)性繁殖[2]。本文通過綜述褪黑素、褪黑素信號通路以及生物鐘基因在季節(jié)性繁殖動物調(diào)控中的作用機制，以及褪黑素-褪黑素受體信號通路與生物鐘基因之間的直接交互作用和間接交互作用，一方面有助于在分子水平上將信號通路與晝夜節(jié)律生物鐘聯(lián)系起來，另一方面可以為完善哺乳動物體內(nèi)生物鐘網(wǎng)絡的調(diào)控機制，為研究季節(jié)性繁殖動物的調(diào)控機制提供基礎。

1 褪黑素對季節(jié)性繁殖動物的作用機制

1.1 褪黑素通過HPGA 對生殖的調(diào)控 褪黑素是一種吲哚類激素，它是由哺乳動物和人體內(nèi)的松果體分泌，化學名稱為N-乙酰-5-甲氧基色胺（N-acetyl-5-methoxytrypto mine）[3]。褪黑素的合成和分泌受光的抑制，在夜間激活，呈現(xiàn)夜增晝低的趨勢。褪黑素通過與膜相關的G 蛋白偶聯(lián)受體結合發(fā)揮作用，在人類和哺乳動物中褪黑素受體有MT1 和MT2 受體[3-4]。

松果體是褪黑素合成的主要場所，是所有哺乳動物感應季節(jié)性變化的關鍵。褪黑素的合成途徑是：當光信號通過刺激視網(wǎng)膜，將神經(jīng)沖動傳遞給SCN，再通過腎上腺素能神經(jīng)作用于松果體腎上腺素能受體，激活細胞內(nèi)第二信使。其中，第二信使cAMP 和Ca2+誘導激活褪黑素合成的限速酶5-羥基-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（AANAT），使5-羥色胺轉(zhuǎn)變?yōu)镹-乙酰-5-羥色胺，最后生成褪黑素[5]（圖1）。如果將松果體切除，會導致季節(jié)性繁殖行為不能隨著季節(jié)變化而同步變化[6]。其調(diào)控機理是當切除松果體后，對光信號不能做出應答，導致褪黑素無法合成，就失去了褪黑素對 HPGA 和生殖的調(diào)控，最終使季節(jié)性繁殖行為不能隨著季節(jié)變化而同步變化。

圖1 光照信號通過視網(wǎng)膜-松果體途徑對褪黑素的調(diào)控

褪黑素通過HPGA 對生殖的調(diào)控有直接和間接2種方式（圖2）。直接調(diào)節(jié)是指褪黑素直接作用于性腺，調(diào)控生殖激素的分泌，影響動物繁殖[7]。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以改變睪丸生精細胞、黃體細胞和卵泡顆粒細胞的形態(tài)，保護正在黃體化的顆粒細胞免受卵泡中活性氧的影響，在排卵期間促進黃體生成以產(chǎn)生黃體酮[8-9]。有文獻報道在馬精液冷凍稀釋液中加入1mmol/L 褪黑素可保護精子，提高凍精的受孕率[10]。在褪黑素的存在下，睪丸支持細胞可以顯著增強睪丸間質(zhì)細胞雄激素的合成，褪黑素可以調(diào)節(jié)間質(zhì)和支持細胞的分泌功能[11]。間接方式是指褪黑素通過作用于HPGA，影響促性腺激素釋放激素（GnRH）和促性腺激素（GTH）的分泌來調(diào)控動物生殖[12]。GTH 根據(jù)功能分為促黃體素（LH）和促卵泡激素（FSH），F(xiàn)SH 的主要功能是參與固醇類的合成及精子和卵子的產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)褪黑素作用于性腺軸使血漿中FSH、LH 水平降低，間接抑制了靶性腺激素的分泌[13]。LH 主要是影響排卵和排精，有文獻報道褪黑激素顯著降低了LH 和雌二醇（17β-estradiol，E2）的血漿水平，在排卵過程中部分抑制下丘腦-垂體-卵巢軸，并誘導卵巢、輸卵管和子宮內(nèi)雌激素受體、孕激素受體、雄激素受體的差異調(diào)節(jié)[14]。E2和睪酮（Testosterone，T）是生殖過程中最主要的類固醇激素，F(xiàn)SH 和LH 通過血液循環(huán)作用于性腺，與相應的受體結合后促進配子發(fā)生和類固醇激素合成[12]。有文獻報道，當褪黑素分泌量濃度較高時，會形成視網(wǎng)膜-SCN-松果體的神經(jīng)內(nèi)分泌反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，反過來抑制視交叉上核對松果體的刺激作用，直接影響生物鐘機制[13]。

圖2 褪黑素對HPG 軸的調(diào)節(jié)

除此以外，褪黑素、促甲狀腺激素（TSH）參與SCN 與下丘腦垂體軸之間的聯(lián)系。垂體結節(jié)部（PT）存在大量的褪黑素受體，是調(diào)控繁殖的首要作用點，褪黑素在此調(diào)節(jié)TSH 的分泌[15]。因此，當大腦深處的光感受器感知并將光信息傳遞到PT，產(chǎn)生TSH。這種PTTSH 通過誘導下丘腦脫碘酶的產(chǎn)生使甲狀腺激素（T3）生物活性水平升高，而升高的T3 反過來抑制促性腺激素釋放激素分泌，以此介導HPGA 的季節(jié)性變化[16]。

褪黑素作為調(diào)節(jié)繁殖季節(jié)的重要激素，這一點己經(jīng)在對馬、倉鼠等長日照動物和綿羊等短日照動物的研究中獲得了證明。根據(jù)動物種類、年齡、性別等不同，褪黑素對生殖系統(tǒng)的影響會表現(xiàn)出促進、抑制、無作用等結果。如褪黑素對牛、鼠類、禽類等動物起抑制生殖的作用，對綿羊和鹿等起促進作用，對光不敏感動物則表現(xiàn)為無作用[7,17-18]。褪黑素的分泌與接受的光照成反比，在光照強度比較低的黃昏和拂曉時褪黑素的釋放被完全抑制[19]。對于長日照動物而言，褪黑素分泌量增加導致GnRH 分泌減少，影響性腺功能；對于短日照動物，褪黑素信號會使得性腺功能活躍。補充外源性褪黑素使馬的睪酮濃度降低、小鼠睪丸退化[12,20]。另一方面，外源性褪黑素可以促進公羊體內(nèi)LH 和FSH 分泌，能夠引起血清睪酮水平的較大日波動[21]。有文獻報道給切除松果體的公羊埋植褪黑素來模擬長日照褪黑素信號，實驗發(fā)現(xiàn)70 d 后公羊體內(nèi)重建了LH 節(jié)律分泌模型。而短日照的褪黑素信號卻不能誘導LH 季節(jié)性節(jié)律分泌模式，可以得出羊的LH 的分泌是由長日照褪黑素信號調(diào)節(jié)的[22]。因此光照的信息支配著長日照和短日照動物的分類，同樣支配著褪黑素的節(jié)律性分泌，其相互之間也許是獨立的[18]。

1.2 褪黑素作用于性腺類固醇激素對生殖的調(diào)控 早期報道褪黑素可抑制雌激素等性腺類固醇合成，這是褪黑素和雌激素信號通路之間相互干擾的第一個跡象。隨后的研究表明褪黑素通過3 個關鍵機制影響雌激素的作用：①通過抑制性腺合成激素（包括雌激素）來降低其循環(huán)水平；②通過與ERα作為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（SERM）的相互作用來改變雌激素結合、DNA 結合和轉(zhuǎn)錄活性；③通過抑制從膽固醇或其他類固醇中合成雌激素的關鍵酶如芳香化酶、硫酸鹽酶和醛酮還原酶（AKRs）的活性[17]。褪黑素對哺乳動物生殖生理的影響還不完全清楚，但褪黑素確實對卵巢顆粒細胞中的類固醇生成發(fā)揮了一些調(diào)節(jié)作用。研究證明褪黑素激活Gαi2 蛋白降低cAMP/PKA 水平，以及PKA 敏感部位ERα絲氨酸236（s236）的磷酸化，介導了褪黑素對ERα轉(zhuǎn)錄活性的抑制[23]。

Ahmad 等[24]在毛竹鼠睪丸內(nèi)注射褪黑素，體外培養(yǎng)毛竹鼠睪丸間質(zhì)細胞，發(fā)現(xiàn)細胞中類固醇激素的生成下降，睪酮水平降低，雄激素受體（AR）、雄激素結合蛋白（ABP）、3β-羥基固醇脫氫酶（3β-HSD）活性都有所降低。Valenti 等[25]報道了成年大鼠的睪丸間質(zhì)細胞中存在褪黑素受體。Wu 等[26]研究小鼠睪丸間質(zhì)腫瘤細胞時發(fā)現(xiàn)：單獨用人絨毛膜促性腺激素/環(huán)磷酸腺苷（hCG/cAMP）類似物處理細胞，睪酮水平升高、類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）表達升高；用hCG/cAMP類似物處理細胞并加入褪黑素發(fā)現(xiàn)，褪黑素在3 h內(nèi)抑制細胞中睪酮產(chǎn)生、StAR 表達降低，StAR 蛋白的表達和類固醇的產(chǎn)生因褪黑激素濃度從1 nmol/L 到10 nmol/L 而降低，說明褪黑素通過阻斷StAR 蛋白表達、特異性結合位點抑制小鼠睪丸間質(zhì)細胞類固醇生成。

2 生物鐘

2.1 生物鐘的組成 晝夜更替是地球自轉(zhuǎn)而產(chǎn)生，生物體為適應這種環(huán)境，在生物體內(nèi)產(chǎn)生的呈周期性、穩(wěn)定可持續(xù)的內(nèi)源性生物現(xiàn)象為晝夜節(jié)律。晝夜節(jié)律使得生物體的各項生理活動呈現(xiàn)一定的時間周期變化，包括激素的分泌、睡眠與覺醒、新陳代謝與細胞分裂、血壓體溫等的周期性變化[27]。在生物體內(nèi)，月節(jié)律、年節(jié)律、周節(jié)律都屬于節(jié)律系統(tǒng)。

生物鐘作為晝夜節(jié)律振蕩器的重要組成元件，幾乎在所有組織中都存在。主時鐘位于哺乳動物大腦區(qū)域的下丘腦視交叉上核（SCN），其他器官的生物鐘被稱為外周生物鐘。中樞時鐘系統(tǒng)由時鐘基因Period（Per1/2/3）、Crytochrome（Cry1/2）、Clock、Bmal1、CKIε、Rev-Erbα等和其編碼的蛋白，以及一些代謝相關基因組成。通過神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌和體液等的傳導作用于外周時鐘系統(tǒng)，和外周時鐘系統(tǒng)共同組成生物鐘[28]。哺乳動物內(nèi)源性的晝夜節(jié)律與環(huán)境保持同步，主要依賴于中樞時鐘系統(tǒng)與外周時鐘系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)作用，晝夜節(jié)律也協(xié)調(diào)哺乳動物的生命活動和生理狀態(tài)的平衡有序。

生物節(jié)律形成的核心分子機制就是生物鐘構成的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路。時鐘蛋白Clock 和Bmal1 形成異二聚體，它們識別并結合到E-box（CACGTG）上，E-box是下游鐘控基因的啟動子。于是靶基因的轉(zhuǎn)錄被激活，翻譯出新的蛋白質(zhì)，調(diào)控機體的節(jié)律。白天Bmal1-Clock 異二聚體作為反饋環(huán)中的核心調(diào)節(jié)因子，使細胞核內(nèi)Per、Cry或其他基因的轉(zhuǎn)錄活性增加，導致細胞質(zhì)中Cry 和Per 的蛋白水平的升高。夜間這些蛋白通過核孔進入細胞核，并形成Cry-Per 復合物，識別并結合到Bmal1-Clock 異二聚體上，抑制了Bmal1-Clock 異二聚體的功能，導致Per、Cry基因的轉(zhuǎn)錄活性關閉，隨后Cry-Per 復合物被泛素化后降解。于是隨著Cry-Per復合物被蛋白酶體降解，解除了對Bmal1-Clock 異二聚體的抑制，這樣新一輪的轉(zhuǎn)錄又將開始[29]。如此就形成了一個轉(zhuǎn)錄-翻譯負反饋環(huán)（圖3）。

圖3 主時鐘轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)的的調(diào)節(jié)模式[30]

與外周生物鐘不同，SCN 主鐘對于生物體生物鐘節(jié)律至關重要，一旦SCN 主鐘遭到損壞，整個生物個體生物鐘節(jié)律可能直接喪失。Ralph[31]以松鼠猴為實驗對象得出以下結論，當松鼠猴的SCN 被破壞后，它的節(jié)律性行為及內(nèi)分泌消失，當重新移植SCN 后，松鼠猴的節(jié)律性行為又得以恢復。SCN 主鐘的生物鐘節(jié)律表現(xiàn)非常穩(wěn)定，尤其是與外周生物鐘相比較而言。

2.2 生物鐘對季節(jié)性繁殖動物的作用機制 SCN 核團作為中央生物鐘，是通過一種偶聯(lián)同步化機制來確保有機體的各項機能維持穩(wěn)定，血管活性腸肽（Vasoactive Intestinal Peptide，VIP）神經(jīng)肽就是一個起到重要作用的神經(jīng)遞質(zhì)。SCN 通過產(chǎn)生VIP 和精氨酸加壓素（AVP）2 種神經(jīng)肽，將生物鐘信號傳至卵巢、睪丸等外周組織。VIP 也可直接刺激下丘腦的GnRH 神經(jīng)元活動，影響GnRH 的分泌，并且能間接作用于RF 酰胺相關肽（抑制GTH 的釋放）神經(jīng)元活動，抑制其對GnRH 神經(jīng)元的作用，從而參與HPGA 的調(diào)控[32]。Hughes 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠VIP基因或是VIP 受體基因（Vasoactive Intestinal Peptide Receptor 2，VIPR2）敲除后，小鼠的日常行為及生理水平的生物鐘節(jié)律都受到了很大的破壞和影響，盡管基因敲除小鼠的生物鐘負反饋環(huán)路在細胞水平上的是完整的，同時其生物鐘在細胞水平上的運行也是正常的，但是對于小鼠機體生物鐘的破壞是存在的。

受節(jié)律生物鐘的調(diào)控，雌激素、睪酮、褪黑素、糖皮質(zhì)激素等的分泌通常呈現(xiàn)一種周期性規(guī)律。在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)，性激素分泌的晝夜節(jié)律發(fā)生變化，晝夜節(jié)律紊亂導致乳腺癌發(fā)病率增高[19]。很多研究數(shù)據(jù)顯示，生物鐘與雌二醇-雌二醇受體（E2-ERa）信號通路間存在關聯(lián)，并且E2-ERa 信號通路參與了生物鐘基因的轉(zhuǎn)錄過程[34]。Rossetti 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，E2 使生物鐘基因Bmal1表達上調(diào)，其相互作用在乳腺導管的發(fā)育過程中產(chǎn)生重要作用，在人乳腺細胞系中敲低ERa，并加入E2 發(fā)現(xiàn)，Per2和Bmal1的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，雌二醇受體以雌二醇依賴的方式調(diào)控Per2-Bmal1 時鐘機制。在E2-ERa 信號通路的下游存在生物鐘基因Per2，Per2的啟動子上存在雌激素反應元件（ERE），ERa 結合在ERE 上促使Per2的轉(zhuǎn)錄，使細胞質(zhì)內(nèi)Per2 蛋白含量升高；升高的Per2 蛋白反過來抑制ERa 與ERE 結合，使乳腺腫瘤細胞增殖受到抑制，研究發(fā)現(xiàn)，具有家族原發(fā)性乳腺癌患者的乳腺組織，生物鐘基因Per1和Per2的表達顯著低于正常人群的乳腺組織[36]。另有文獻報道，體外培養(yǎng)大鼠的子宮上皮細胞加入E2 后Per1基因高表達[37]。這進一步表明了E2 與生物鐘存在關聯(lián)。

3 褪黑素信號通路與生物鐘交互作用

3.1 褪黑素與生物鐘基因在中樞途徑中的交互作用 褪黑素對于大多數(shù)生物體來說，其最主要的功能就是為生物體提供時間信息。松果體和視網(wǎng)膜產(chǎn)生的褪黑素晝夜變化規(guī)律從魚類到哺乳動物都是非常恒定的，褪黑素波峰都出現(xiàn)在夜晚。褪黑素合成酶（AANAT）是褪黑素合成的限速酶，該酶活性和褪黑素的水平具有同步性。生物鐘可以調(diào)節(jié)AANAT 活性，AANAT 活性在也受到光照條件的抑制[38]。研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1-Clock 異二聚體能夠作用于AANAT基因啟動子的E-box 元件上，增強了AANAT基因的轉(zhuǎn)錄，促進了褪黑素的合成，這樣使得AANAT的表達和褪黑素的濃度也表現(xiàn)為晝夜節(jié)律性，即夜間表達較高；而在白天，由于Bmal1-Clock 異二聚體受到Cry 蛋白的抑制，AANAT基因的轉(zhuǎn)錄也受到抑制，使AANAT表達較低，褪黑素的合成也隨之減少，在白天出現(xiàn)表達較低的現(xiàn)象[39]。

Yamanaka 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，給與小鼠5d 的全黑暗條件，垂體細胞中Clock基因表達升高，Per1/2及Bmal1基因表達降低；用褪黑素注射處理后，Clock基因表達水平降低，Per1/2的表達水平升高，Bmal1沒變化，推測褪黑素、褪黑素合成酶及生物鐘基因之間存在反饋作用環(huán)路。還有實驗表明，生物鐘Cry基因是感光基因，且是AANAT 轉(zhuǎn)錄的阻遏物，在Cry1和Cry2雙缺陷小鼠（Cry1-/-/ Cry2-/-）中褪黑素含量很低，將Cry1-/-/ Cry2-/-小鼠持續(xù)一段黑暗時間的處理后，其生物鐘節(jié)律丟失，AANAT和時鐘基因Per1的表達水平很高[41]。還有研究表明，較長光照時間的刺激，能夠引發(fā)Per2基因的高表達，而Per2基因的高表達會抑制AANAT表達，因而推測Per2基因的表達與褪黑素的合成具有相反的模式[42]。當敲除小鼠松果體細胞中的褪黑素受體MT1時，小鼠垂體細胞中Per1、Cry1、Clock和Bmal1基因的表達顯著降低，說明生物鐘基因節(jié)律性表達與褪黑素受體的存在有著密切關系[43]。

本實驗室團隊在前期以季節(jié)性繁殖動物雙峰駝卵巢顆粒細胞為模型，研究其生殖調(diào)控過程中發(fā)現(xiàn)，通過免疫定位實驗顯示MT1 和MT2 受體蛋白主要存在于細胞膜和細胞質(zhì)中，Cry1 和Cry2 蛋白主要存在于細胞核和細胞質(zhì)中；當過表達基因MT1/2后，Cry1/2基因的表達顯著增加，可通過cAMP/PKA/CREB 通路解釋清楚；但是當過表達Cry1/2后，MT1/2基因的表達也顯著增加，推測Cry基因?qū)T1/2的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，暗示MT1/2的啟動子中含有Cry基因的結合元件[44]。

3.2 褪黑素與生物鐘基因在外周途徑中的交互作用 褪黑素作為中樞生物鐘的輸出和外周振蕩器的輸入，在調(diào)節(jié)中起著重要作用。關于褪黑素的生物作用已經(jīng)被報道過很多，但最好的描述是它作為一種神經(jīng)激素和光/暗周期的牽引劑，以及SCN 外周時鐘的同步器的生物鐘作用[9]。夜間血液中褪黑素水平升高，會通知身體細胞和器官現(xiàn)在是夜間，并幫助組織目標器官和器官系統(tǒng)進入適當?shù)捏w內(nèi)平衡代謝節(jié)奏，白晝長度或光照時間/相位的改變都會使SCN 活動及伴隨的松果體產(chǎn)生褪黑素的活動不同步[18]。

LH 作為調(diào)控生殖的重要激素，在哺乳動物的排卵、性激素的分泌過程中發(fā)揮重要作用。有文獻報道，褪黑素對LH 有直接調(diào)節(jié)作用，其關鍵作用是影響前列腺素合成酶（又稱環(huán)氧合酶，Cyclooxygenase2，COX2)，COX2 也是影響排卵的重要因素，COX2啟動子中存在E-box 序列，Bmal1-Clock 異二聚體可與E-box 序列結合調(diào)控COX2的表達，當敲除卵巢顆粒細胞中的Bmal1基因，COX2表達和前列腺素合成顯著降低[45]。這表明前列腺素使卵泡破裂的調(diào)控機制依賴于卵巢上的生物鐘的調(diào)控。

Ding 等[46]研究還發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以間接影響睪酮水平，睪丸內(nèi)睪酮的合成需要一系列睪丸合成酶(P450scc、P450c17、3β-HSD、17β-HSD) 的作用形成，睪丸內(nèi)存在Bmal1基因，該基因可誘導睪丸合成酶合成。Chung 等[47]研究發(fā)現(xiàn)，類固醇急性調(diào)節(jié)基因（StAR）的轉(zhuǎn)錄可以直接被Bmal1基因激活；當敲除小鼠Bmal1基因時，StAR基因表達顯著降低，睪酮水平也隨之降低，可以看出，Bmal1基因在調(diào)控哺乳動物分泌睪酮時起到關鍵作用。另外，當切除小鼠的松果體后，睪酮和Bmal1、StAR、Rev-erbα的表達均發(fā)生顯著變化，當注射褪黑素后各項參數(shù)得到恢復[48]。因此可以得出，褪黑素可通過調(diào)控鐘基因Bmal1的表達來影響睪酮生成。在敘利亞倉鼠中，給與正常的光照節(jié)律，其Bmal1基因的表達無明顯節(jié)律，而Per1基因存在節(jié)律性，其在夜間的表達水平最高；將倉鼠長時間置于黑暗環(huán)境時，其褪黑素分泌的節(jié)律性消失，倉鼠性腺衰退，而此時Bmal1基因的表達則表現(xiàn)出明顯的節(jié)律性，Per1基因的節(jié)律性消失[49]，說明褪黑素和生物鐘基因都受光暗條件的限制，相互依存、相互影響。

AANAT、HIOMT、MT1、MT2基因是褪黑素合成和發(fā)揮作用的關鍵。文獻報道，在大鼠的卵丘-卵母細胞復合體（COC）中存在上述基因，同時，還存在Clock、Bmal1、Cry1/2、Per1/2等生物鐘基因，在排卵后輸卵管壺腹部獲得的成熟COC 上的Bmal1基因表達水平較高，其他基因在卵巢組織中分離的未成熟COC上的表達水平較高；切除松果體后，COC 中AANAT、HIOMT、MT1、MT2等基因的表達水平發(fā)生變化；注射褪黑素后，上述基因的表達恢復生物鐘節(jié)律[50]。上述實驗結果表明，褪黑素通過影響COC 進而影響生物鐘基因的表達，對卵巢功能具有調(diào)控作用。

Steven 等[19]研究表明，MT1 蛋白和MT2 蛋白形成的異二聚體抑制cAMP 的積累，與cAMP 相關的信號通路受到調(diào)控，使生物鐘基因表達發(fā)生改變。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，Cry 蛋白主要存在于卵巢顆粒細胞的細胞核中，卵巢顆粒細胞上存在褪黑素受體基因（MT1、MT2）和節(jié)律基因（Clock、Cry1、Cry2、Per1、Per2、Per3）的表達；過表達MT1/2基因后，cAMP 產(chǎn)生受到抑制，除Cry1/2表達極顯著升高外，其他基因（GNB2、PKA、CREB、Per1/2/3、Clock）均極顯著降低[44]。過表達Cry1/2后，cAMP 的產(chǎn)生受到抑制，除MT1/2的表達極顯著升高外，其他基因均顯著降低[44]。MT與Cry通過cAMP/ PKA/ CREB 通路構成一個環(huán)路（圖4）。此結果解釋為，當過表達MT1/2基因，cAMP 產(chǎn)生受到抑制，使有活性的PKA 生成降低，進一步影響CREB 的磷酸化，使得Per的轉(zhuǎn)錄受到抑制，負反饋調(diào)節(jié)因子Cry 激活，其表達含量升高。該結果與核心節(jié)律的生物鐘調(diào)控機制完全一致。為進一步驗證基因的相關性，當過表達基因Cry后檢測相關信號通路基因的變化，結果顯示與過表達MT的結果完全一致。有2 種分析途徑，一是過表達的Cry抑制了cAMP，進而影響cAMP/PKA/ CREB 信號通路，使結果與過表達MT完全一致，二是暗示了MT和Cry之間存在的聯(lián)系發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。

圖4 cAMP/PKA/CREB 信號通路介導的褪黑素對生物鐘基因的作用機制[44]

4 總結與展望

生物鐘基因受光照控制，其分子機制根據(jù)轉(zhuǎn)錄-翻譯負反饋環(huán)路進行振蕩，控制生物體的各項節(jié)律性生理活動和行為。本文總結了有節(jié)律的褪黑素合成不但通過HPGA 通路調(diào)控哺乳動物的季節(jié)性繁殖，還通過下丘腦甲狀腺激素-GnRH 調(diào)控動物的繁殖。位于SCN 的主生物鐘通過感光基因表達的變化引起生物鐘基因的節(jié)律性振蕩，之后將這種振蕩傳遞給外周生物鐘，使性激素合成相關基因的表達發(fā)生變化，進而調(diào)控生殖。本文分別從生物鐘基因?qū)ι车恼{(diào)控，及褪黑素介導的生物鐘基因?qū)ι车恼{(diào)控，從中樞途徑和外周途徑兩方面入手闡述其相互作用關系，為完善褪黑素、生物鐘作用的季節(jié)性繁殖規(guī)律提供更具體的思路，是控制動物季節(jié)性繁殖行為的重要內(nèi)容。

動物利用光周期的變化來適應即將到來的繁殖季節(jié)，這對于深入理解動物季節(jié)性繁殖的機制有幫助。雖然人類不是季節(jié)性的，但人類有很多生物節(jié)律，如睡眠-覺醒節(jié)律、青春期發(fā)育等。生物節(jié)律的紊亂導致體內(nèi)激素水平異常，與乳腺癌、甲狀腺疾病有很大的聯(lián)系，因此了解動物季節(jié)性繁殖的分子機制有助于更好地理解人類的生物節(jié)律。盡管人們已經(jīng)非常了解褪黑素的合成途徑，但是，褪黑素驅(qū)動節(jié)律本身的機制，以及與生物鐘分子機制中存在的千絲萬縷關系還是未知的，褪黑素受體基因啟動子中是否含有誘使或者結合生物鐘基因轉(zhuǎn)錄的核心位點還需要進一步驗證，這也是本實驗室的下一步計劃。