復(fù)方刺五加對雛雞消化功能與腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

孫夢晴，霍墨涵，姜曉文，李子俊，馬 雋，葛 銘，于文會,2,3

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150030；3.黑龍江省普通高校動物普通疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

節(jié)本增效是養(yǎng)殖場提高養(yǎng)殖效益的重要手段。養(yǎng)殖場在節(jié)本增效時(shí)，促進(jìn)飼料轉(zhuǎn)化，提高飼料報(bào)酬是最常用的方法。中藥飼料添加劑可健脾胃，提高胃腸功能，促進(jìn)消化酶的分泌。雛雞的腸道健康，對其消化吸收、生長發(fā)育具有重要的意義[1]。中藥具有多效性，有些中藥具有促進(jìn)胃腸蠕動，提高日糧中營養(yǎng)物質(zhì)消化與吸收的作用，進(jìn)而可提高飼料報(bào)酬[2]。有研究表明，中藥飼料添加劑能顯著改善斷奶仔豬的生長性能，提高消化道內(nèi)脂肪酶、淀粉酶等的活性[3-4]。山楂、枳殼、神曲等中藥，可以促進(jìn)飼料的消化吸收；黃芪、刺五加等中藥，可促進(jìn)體內(nèi)物質(zhì)的合成與代謝，增加消化酶的活性[5]，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，提高養(yǎng)殖效益。

腸道菌群利用機(jī)體的各種酶和不同的代謝通路[6]，為自身和宿主提供一定的營養(yǎng)和能量，同時(shí)維持腸道黏膜屏障和系統(tǒng)自身的免疫功能[7]。因此，腸道微生物菌群對維護(hù)腸道的穩(wěn)態(tài)，保障雛雞腸道健康具有十分重要的作用[8-9]。于佳楠等[10]研究發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)日糧中添加黃芪、甘草、黨參、陳皮、當(dāng)歸、白術(shù)和升麻能夠改善蘆花雞腸道菌群的組成。刺五加性溫，味辛、微苦，歸脾、腎經(jīng)，具有益氣健脾的作用；枳殼味苦、辛、酸，性微寒，歸脾經(jīng)，具有行滯消積的功效；黃芪性甘，味微溫，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽、生津養(yǎng)血的作用。本研究通過在雛雞飼料里添加不同劑量的復(fù)方刺五加中藥，探討復(fù)方刺五加中藥對雛雞消化吸收和對腸道菌群的作用效果，為復(fù)方刺五加中藥的研發(fā)和在畜牧業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 將刺五加、枳殼、黃芪(均購自哈爾濱中藥大市場)，按照2∶1∶1的比例進(jìn)行配伍，經(jīng)過粉碎機(jī)粉碎、過篩、混勻，組成復(fù)方刺五加；胃蛋白酶活性試劑盒、脂肪酶活性檢測試劑盒、淀粉酶活性檢測試劑盒、糜蛋白酶活性檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；4%多聚甲醛(含DEPC)、乙醇、丙酮、二甲苯、蘇木精、伊紅，均購自黑龍江久豐生物有限公司。

1.1.2 主要儀器 JY2002 型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)，中國醫(yī)藥器機(jī)六廠產(chǎn)品；生化分析儀，美國愛德士公司產(chǎn)品；顯微鏡，江南永新產(chǎn)品。

1.1.3 試驗(yàn)動物 未經(jīng)免疫的1日齡蛋雞，購自哈爾濱先鋒孵化場。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)雞的飼養(yǎng)環(huán)境 試驗(yàn)前對雞籠、飲水器、喂食器用新潔爾滅進(jìn)行清洗消毒，浸泡2 h后取出，清水沖洗晾干即可使用。動物房消毒前關(guān)閉門窗，使用高錳酸鉀熏蒸消毒法，消毒后通風(fēng)換氣48 h后方可使用。將64只雛雞隨機(jī)分為4個(gè)組，每組16只飼養(yǎng)于同一籠內(nèi)。1～7日齡雛雞生長最合適的溫度為35 ℃左右，在每一雞籠內(nèi)安裝熱燈，為雛雞生長提供適宜溫度，濕度控制在65%左右；7日齡后，環(huán)境溫度每周可下降2 ℃。24 h保持溫度均衡，高低溫差不能超過3 ℃。動物飼養(yǎng)與試驗(yàn)符合東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利管理規(guī)定。

1.2.2 試驗(yàn)分組與飼喂 分組：將64只雛雞隨機(jī)分為4個(gè)組，每組16只，分別為空白組、復(fù)方刺五加低劑量組(0.5 kg/t)、復(fù)方刺五加中劑量組(1.0 kg/t)和復(fù)方刺五加高劑量組(2.0 kg/t)。

飼喂：雛雞適應(yīng)飼喂7 d后開始正式試驗(yàn)，試驗(yàn)周期為21 d。每日早上和下午每籠各飼喂250 g對應(yīng)組別的雛雞飼料。將飲水器注滿白開水，每日早、晚各換水1次，供雛雞自行飲用。

1.2.3 雛雞主要生長指標(biāo)檢測 體重檢測：在正式試驗(yàn)第7、14天和第21天時(shí)分別在同一時(shí)間稱量每組中每只雛雞的體重并記錄。

采食量檢測：每日早上和下午每籠各飼喂250 g對應(yīng)組別的雛雞飼料，第2天飼喂前，清除托盤中的糞便，回收并稱量每組剩余飼料,計(jì)算每日采食量。

每日采食量/g=500 g-回收飼料量/g。

料重比檢測：料重比/%=試驗(yàn)期間每組雛雞的飼料總攝入量/試驗(yàn)期間每組雛雞的總增重×100%

1.2.4 雛雞血清生化指標(biāo)檢測 21 d試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)抽取3只體重相近的雛雞，心臟采血2～3 mL于10 mL離心管，靜置，3 000 r/min離心10 min，取上層血清至EP管，-20 ℃保存。用生化分析儀檢測每組總蛋白(TP)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、總膽固醇(TC)和血糖(GLU)含量。

1.2.5 雛雞胃腸消化酶活性檢測 21 d試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)取3只雛雞處死，取腺胃組織和小腸組織。分別稱取0.2 g腺胃組織和0.2 g小腸組織于研缽中，加入液氮研磨，加適量生理鹽水，3 000 r/min離心10 min，取上清。ELISA檢測胃蛋白酶活性、脂肪酶活性、淀粉酶活性和糜蛋白酶活性，檢測方法參照說明書進(jìn)行。

1.2.6 雛雞小腸絨毛和隱窩深度檢測 21 d 試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)取3只雛雞處死，每只取2 cm的小腸組織，4%多聚甲醛固定，24 h后水洗2 h，經(jīng)過乙醇、丙酮固定、二甲苯脫水、透明后，進(jìn)行包埋，切片，用蘇木精和伊紅(H.E.)染色，樹膠封片，顯微照相設(shè)備進(jìn)行圖像采集，進(jìn)行組織切片絨毛高度、隱窩深度的測量。每組取5張切片觀察、測定，取平均值。腸絨毛高度為從腸腺絨毛聯(lián)結(jié)處到絨毛頂端的長度；隱窩深度為從腸腺基部到腸腺絨毛聯(lián)結(jié)處的長度，并計(jì)算絨毛高度與隱窩深度的比值。

1.2.7 雛雞腸道菌群檢測 21 d試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)取3只雛雞處死，每只取2 g盲腸內(nèi)容物，用16S rDNA擴(kuò)增子測序法測定腸道菌群。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法 使用SPSS 20.0軟件對結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，并用Prism 8軟件繪制柱狀圖，P<0.01表示存在極顯著差異，P<0.05表示存在顯著差異，P>0.05表示無顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 雛雞主要生長指標(biāo)檢測 如表1所示，與空白組比較，中劑量組雛雞的平均體重極顯著增長(P<0.01)，低劑量組顯著增長(P<0.05)；各組雛雞平均日采食量均無顯著性差異(P>0.05)；與空白組比較，中劑量組雛雞料重比極顯著降低(P<0.01)，而高劑量組、低劑量組也呈顯著降低(P<0.05)。

表1 雛雞主要生長指標(biāo)

2.2 雛雞血清生化指標(biāo)檢測 如圖1所示，與空白組比較，3個(gè)復(fù)方刺五加劑量組雛雞GLU、TP、LDL、HDL、TC含量均有升高，其中GLU含量中劑量組極顯著升高(P<0.01)，低劑量組、高劑量組顯著升高(P<0.05)；TP含量中劑量組極顯著升高(P<0.01)，低劑量組、高劑量組顯著升高(P<0.05)；LDL含量3個(gè)復(fù)方刺五加劑量組均極顯著升高(P<0.01)；HDL含量中劑量組極顯著升高(P<0.01)，高劑量組顯著升高(P<0.05)；TC含量中劑量組極顯著升高(P<0.01)，低劑量組、高劑量組顯著升高(P<0.05)。

圖1 雛雞血清生化指標(biāo)

2.3 雛雞胃腸道消化酶活性檢測 如圖2所示，與空白組比較，3個(gè)復(fù)方刺五加劑量組的胃蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性均有所增加，其中胃蛋白酶活性、糜蛋白酶活性中劑量組、低劑量組差異極顯著(P<0.01)，高劑量組差異顯著(P<0.05)；脂肪酶活性、淀粉酶活性中劑量組差異極顯著(P<0.01)，低劑量組、高劑量組差異顯著(P<0.05)。

圖2 雛雞胃腸道消化酶活性

2.4 雛雞小腸絨毛和隱窩深度檢測 如圖3所示，21 d試驗(yàn)結(jié)束后，各組黏膜面光整，黏膜皺壁完好；腺體、隱窩、杯狀細(xì)胞正常，未見炎性細(xì)胞浸潤。各組絨毛長度和隱窩深度比值測量結(jié)果見圖4，空白組絨毛平均長度為715.46 μm，隱窩深度為126.08 μm；低劑量組絨毛平均長度為418.21 μm，隱窩深度為65.69 μm；中劑量組絨毛平均長度為1 063.63 μm，隱窩深度為163.40 μm；高劑量組絨毛平均長度為862.51 μm，隱窩深度為142.00 μm；與空白組相比，絨毛長度與隱窩深度的比值中劑量組極顯著升高(P<0.01)，低劑量組、高劑量組顯著升高(P<0.05)。

圖3 雛雞小腸黏膜組織切片(H.E.染色，400×)

圖4 雛雞小腸絨毛長度和隱窩深度比值

2.5 雛雞腸道菌群檢測

2.5.1 OTU分析 如圖5所示，圖中不同顏色的花瓣代表不同的分組及其特有 OTU 個(gè)數(shù)，花瓣重疊部分的數(shù)字代表所有分組共有的 OTU 個(gè)數(shù)?？瞻捉M有470個(gè)OUT、低劑量組有610個(gè)OTU、中劑量組有513個(gè)OTU、高劑量組有586個(gè)OTU。與空白組比較，低劑量組獨(dú)有230個(gè)OTU、中劑量組獨(dú)有144個(gè)OTU、高劑量組獨(dú)有209個(gè)OTU。結(jié)果表明與空白組比較，3個(gè)復(fù)方刺五加劑量組菌群多樣性均有所增加。

圖5 各組雛雞腸道菌群OTU韋恩圖

2.5.2 Alpha多樣性分析 雛雞腸道菌群稀釋性曲線圖中，在一定范圍內(nèi)，群落中有大量物種被發(fā)現(xiàn)時(shí)曲線表現(xiàn)為急劇上升；物種不隨測序數(shù)量的增加而增多時(shí)，曲線趨于平緩。由圖6A可知，多樣性由多到少依次為中劑量組、低劑量組、高劑量組和空白組。雛雞腸道菌群等級豐度曲線圖中，橫軸上的長度反映物種的豐富度，曲線越寬，物種的組成越豐富；曲線的形狀反映物種組成的均勻度，曲線越平坦，物種組成的均勻度越高。由圖6B可知，各組豐富度由大到小依次為中劑量組、低劑量組、空白組和高劑量組。

圖6 Alpha多樣性分析結(jié)果

2.5.3 基于門水平差異性分析 如圖7所示，前10種菌群分別為硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、脫鐵桿菌綱(Deferribacteres)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、E-變形菌門(Epsilonbacteraeota)、柔膜菌門(Tenericutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。其中占比例最多的3種菌群為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)；與空白組比較，3個(gè)復(fù)方刺五加劑量組中厚壁菌門占比均增加，中劑量組增幅最大；3個(gè)復(fù)方刺五加劑量組中擬桿菌門占比均降低，中劑量組降低幅度最明顯；3個(gè)復(fù)方刺五加劑量組中變形菌門中劑量組占比降低，低劑量組和高劑量組占比升高。

圖7 各組雛雞腸道菌群基于門水平差異性分析

3 討論

3.1 復(fù)方刺五加對雛雞消化吸收功能的影響 脾主運(yùn)化，胃主受納、熟腐水谷[11]。復(fù)方刺五加由刺五加、枳殼、黃芪等組成，具有燥濕運(yùn)脾、行氣和胃的作用。有研究表明，刺五加含有的微量元素和氨基酸等可以促進(jìn)動物機(jī)體的食欲，并提高動物機(jī)體的免疫力[12-13]；枳殼因具有行滯消脹、理氣寬中的功效[14]，對食積氣滯具有調(diào)節(jié)疏通作用[15]。本研究對主要生長指標(biāo)檢測的結(jié)果顯示，每只雛雞的平均體重與初始體重比較，空白組增加了169 g、低劑量組增加了184 g、中劑量組加了211 g、高劑量組增加了178 g；在料重比方面，中劑量組的料重比最低，為23.38%，與空白組相比降低了4.2%。料重比反映了飼料利用率，雞的飼料利用率是肉雞生產(chǎn)中最重要的經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。一般來說，料重比越低，飼料利用率越高，投入的飼料少而雛雞體重增加的多，同比，經(jīng)濟(jì)效應(yīng)也好。本研究對血清生化指標(biāo)檢測的結(jié)果顯示，3個(gè)復(fù)方刺五加劑量組的血清總蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、總膽固醇和血糖含量均有所升高，其中中劑量組與空白組相比增加極顯著(P<0.01)，說明復(fù)方刺五加能夠促進(jìn)雛雞體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、脂質(zhì)代謝和糖代謝。本研究對胃腸道消化酶檢測結(jié)果顯示，3個(gè)復(fù)方刺五加劑量組胃腸道中胃蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的含量與空白組相比較均顯著增加(P<0.05或P<0.01)，表明復(fù)方刺五加能夠明顯地提高小腸中各消化酶的活性。小腸的主要作用是消化吸收、受盛化物、分清泌濁。小腸中十二指腸的絨毛最長。小腸絨毛有規(guī)律的擺動有利于阻礙有害細(xì)菌在腸黏膜上的黏附，腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性與機(jī)體的生長發(fā)育密切相關(guān)[16]，小腸的生長發(fā)育情況可以通過腸道絨毛與隱窩的比值來反映。本研究對小腸絨毛長度與隱窩深度的比值的檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，中劑量組的小腸絨毛形態(tài)生長發(fā)育更好，十二指腸絨毛的長度和隱窩深度的比值升高極顯著(P<0.01)，低劑量組和高劑量組升高顯著(P<0.05)。本研究結(jié)果表明，復(fù)方刺五加能夠提高腸絨毛的長度和隱窩深度的比值，促進(jìn)雛雞腸道的發(fā)育，提高腸道的消化吸收功能。

3.2 復(fù)方刺五加對雛雞腸道菌群的影響 家禽生產(chǎn)性能除了受到日糧、飼養(yǎng)環(huán)境和遺傳等因素影響外，腸道微生物及其代謝產(chǎn)物也是一個(gè)重要的影響因素[17]。本研究中，3個(gè)復(fù)方刺五加劑量組菌群多樣性與豐富度與空白組相比均增多，中劑量組增加最明顯；3個(gè)復(fù)方刺五加劑量組腸道菌群中占比最多的3種為擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門；3個(gè)復(fù)方刺五加劑量組與空白組比較，厚壁菌門占比均增加，中劑量組增加最明顯；擬桿菌門占比均降低，中劑量組降低最明顯；變形菌門中劑量組占比降低，低劑量組和高劑量組占比升高。厚壁菌門和擬桿菌門的占比增加促進(jìn)了脂肪代謝和糖類代謝[18]，增加機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而提高腸道的消化吸收，促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育。變形菌門的細(xì)菌大多數(shù)為兼性厭氧菌[19]，因?yàn)槟c道內(nèi)缺氧所以變形菌門在正常的腸道中含量很少，而且很多都是有害菌群。變形菌門占比降低使腸道內(nèi)致病菌減少，降低了對腸道的損傷作用。本研究結(jié)果表明，復(fù)方刺五加能增加腸道菌群的豐富度和多樣性，影響變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門在腸道菌群中的占比，保護(hù)腸道健康，促進(jìn)了腸道的消化吸收。綜上可知，復(fù)方刺五加能夠提高雛雞消化吸收功能，增加腸道菌群的多樣性并提高益生菌群豐度，促進(jìn)飼料轉(zhuǎn)化和生長發(fā)育。