兩種同期發(fā)情方法對河流型水牛血液生殖激素的影響

覃廣勝，劉新勇，李 輝，譚正準(zhǔn)，黃 健，曾令湖，程雋如，于農(nóng)淇，羅 華，王曉麗

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西壯族自治區(qū)水牛研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

水牛具有適應(yīng)力強，抗病力強，耐粗飼料等優(yōu)點，但同時也具有短日照季節(jié)性繁殖、發(fā)情周期不規(guī)則、受孕率低等繁殖缺點[1]。特別是在炎熱的夏季，水牛處于發(fā)情淡季[2]，發(fā)情癥狀不明顯或不發(fā)情，使水牛夏季的繁殖管理難度加大。同期發(fā)情技術(shù)可以通過利用某些外源激素人為控制空懷母畜在同一時期內(nèi)發(fā)情、排卵，從而提高母畜的受胎率和繁殖效率。國內(nèi)外對水牛同期發(fā)情方案進(jìn)行了大量的研究[3]，但國內(nèi)對河流型水牛同期發(fā)情處理時血液生殖激素的變化研究罕見報道。本試驗在夏季用Ovsynch法和CIDR-Ovsynch法對摩拉和尼里-拉菲水牛進(jìn)行同期發(fā)情處理，利用B型超聲波診斷技術(shù)(簡稱B超)監(jiān)測卵泡發(fā)育以及排卵情況，同時采集試驗水牛血液通過酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)進(jìn)行生殖激素的測定，探討同期發(fā)情處理后排卵和不排卵水牛生殖激素的變化規(guī)律，以期為水牛同期發(fā)情、人工授精等繁殖技術(shù)的研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 試驗水牛選自廣西水牛研究所水牛種畜場。選擇臨床健康，年齡4～5歲，體重550～600 kg，膘情中等以上，空懷的成年摩拉和尼里-拉菲水牛各11頭。試驗水牛隨機分成2個組，其中Ovsynch法組為摩拉和尼里-拉菲水牛各6頭，CIDR-Ovsynch法組為摩拉和尼里-拉菲水牛各5頭。試驗時間為2020年6—7月，試驗期間試驗水牛均在同一牛欄飼養(yǎng)且自由采食充足的飼料和飲水。

1.2 藥品和儀器 戈那瑞林(GnRH)(寧波第二激素廠，100 μg×10瓶/盒)；氯前列醇注射液(PGF)(上海計勝生物科技有限公司，2 mL∶0.2 mg×10支/盒)；孕酮栓(CIDR)(美國進(jìn)口，含孕酮1.56 g/支)。HS-1600V型獸用超聲波診斷儀、5.0 MHz陰道探頭(日本宏達(dá))。

1.3 試驗方法

1.3.1 同期發(fā)情處理 Ovsynch法[4]：GnRH+PGF+GnRH，選擇水牛生理周期的任意一天定義為第0天并在上午肌內(nèi)注射GnRH 100 μg/頭，第7天上午肌內(nèi)注射PGF 0.4 mg/頭，第9天上午肌內(nèi)注射GnRH 100 μg/頭。CIDR-Ovsynch法[5]：CIDR+GnRH+PGF+GnRH，第0天上午肌內(nèi)注射GnRH 100 μg/頭，同時在母牛生殖道內(nèi)放置CIDR，第7天上午肌內(nèi)注射PGF 0.4 mg/頭，并從生殖道內(nèi)撤出CIDR，第9天上午肌內(nèi)注射GnRH 100 μg/頭。

1.3.2 發(fā)情和排卵監(jiān)測 全部試驗水牛從第10天開始每天進(jìn)行B超監(jiān)測，使用獸用B超儀逐頭經(jīng)直腸掃描水牛卵巢，記錄卵巢上直徑≥9 mm卵泡數(shù)目。以第1次B超監(jiān)測時卵巢上存在卵泡直徑≥9 mm的優(yōu)勢卵泡為發(fā)情判斷標(biāo)準(zhǔn)，監(jiān)測的優(yōu)勢卵泡消失且直腸檢查發(fā)現(xiàn)有排卵凹為排卵判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。排卵的水牛排卵當(dāng)天記錄后停止監(jiān)測并記為排卵水牛，第12天仍不排卵的水牛停止監(jiān)測并記為不排卵水牛。

1.3.3 血樣采集 試驗水牛同期發(fā)情處理時的第0、7、9天以及之后直至排卵的每天都采集血樣，不排卵水牛采集血樣至第12天。于采血當(dāng)天早上9點試驗水牛未采食前通過頸靜脈采集全血10 mL，室溫靜置2 h待血液凝固后3 000 r/min離心10 min，分離血清分裝到EP管中，標(biāo)記好號碼后置于-80 ℃冰箱保存待測。

1.3.4 血液生殖激素測定 血清樣品送江蘇晶美生物科技有限公司采用ELISA進(jìn)行測定，測定指標(biāo)包括：促卵泡素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P4)、抑制素(INH)和胰島素樣生長因子1(IGF-1)。各指標(biāo)測定樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值均為0.95以上，批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均分別小于10%和15%。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016初步整理后采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 水牛發(fā)情、排卵情況 由表1可知，Ovsynch法中有1頭試驗水牛未發(fā)情，發(fā)情率為91.67%，CIDR法全部的試驗水牛都發(fā)情，發(fā)情率為100%。但2種同期發(fā)情方法的排卵率均有所下降，Ovsynch法的排卵率為75.00%，而CIDR法僅有40.00%的試驗水牛排卵。由表2可知，摩拉水牛的發(fā)情率和排卵率均高于尼里-拉菲水牛，摩拉水牛的發(fā)情率和排卵率分別為100%和81.82%，而尼里-拉菲水牛的發(fā)情率和排卵率為90.91%和36.36%。

表1 不同處理方法的發(fā)情和排卵情況

表2 摩拉和尼里-拉菲水牛的發(fā)情和排卵情況

2.2 水牛FSH測定 由表3可知，第0天用Ovsynch法測得的排卵水牛FSH濃度顯著高于用CIDR法測得的濃度(P<0.05)；第10天用Ovsynch法測得的排卵牛FSH濃度顯著低于用CIDR法以及Ovsynch法測得的不排卵水牛濃度(P<0.05)；第11天用Ovsynch法測得的排卵水牛濃度FSH顯著低于不排卵水牛濃度(P<0.05)。由圖1A可知，2種方法處理的不排卵水牛FSH濃度在第9～12天呈小幅度波動變化，而排卵水牛在9～11 d呈逐漸下降趨勢，且第11天濃度小于不排卵水牛。

表3 排卵水牛和不排卵水牛血清FSH水平在同期發(fā)情處理中不同時間段的比較

圖1 排卵水牛和不排卵水牛血清FSH(A)和LH(B)變化規(guī)律

2.3 水牛LH測定 由表4可知，第0天用Ovsynch法測得的排卵水牛LH濃度顯著低于用CIDR法測得的濃度(P<0.05)；第9天用Ovsynch法測得的排卵水牛和不排卵水牛LH濃度均顯著低于用CIDR法測得的濃度(P<0.05)，且用CIDR法測得的排卵水牛LH濃度顯著高于不排卵水牛(P<0.05)；第10天用Ovsynch法測得的排卵水牛LH濃度顯著低于用CIDR法測得的濃度(P<0.05)；第11天用Ovsynch法測得的排卵水牛和不排卵水牛LH濃度均顯著低于用CIDR法測得的濃度(P<0.05)。由圖1B可知，2種方法處理的排卵水牛和不排卵水牛LH變化總體均呈逐漸上升的趨勢，且9～12 d CIDR法測得的濃度高于Ovsynch法。

2.4 水牛E2測定 由表5可知，第7天用Ovsynch法測得的排卵水牛和不排卵水牛E2濃度顯著高于用CIDR法測得的濃度(P<0.05)；第9天用Ovsynch法測得的排卵水牛E2濃度顯著高于用CIDR法測得的濃度(P<0.05)；第11天用Ovsynch法測得的排卵水牛E2濃度顯著高于不排卵水牛(P<0.05)。由圖2A可知，CIDR法處理的排卵水牛和不排卵水牛在第0天和第7天E2濃度均低于Ovsynch法；2種方法處理的排卵水牛和不排卵水牛E2濃度在7～12 d總體呈逐漸上升的趨勢，其中在10～11 d排卵水牛濃度呈大幅上升且高于不排卵水牛，在10～12 d不排卵水牛濃度呈小幅度波動變化。

表5 排卵水牛和不排卵水牛血清E2水平在同期發(fā)情處理中不同時間段的比較

圖2 排卵水牛和不排卵水牛血清E2(A)和P4(B)變化規(guī)律

2.5 水牛P4測定 由表6可知，第7天用CIDR法測得的排卵水牛P4濃度顯著高于不排卵水牛(P<0.05)；第9天用Ovsynch法測得的不排卵水牛P4濃度顯著低于Ovsynch法排卵水牛以及CIDR法不排卵水牛濃度(P<0.05)；第10天Ovsynch法測得的排卵水牛P4濃度顯著高于Ovsynch法不排卵水牛以及CIDR法排卵水牛濃度(P<0.05)；第11天用Ovsynch法測得的排卵水牛P4濃度顯著高于用CIDR法測得的濃度(P<0.05)。由圖2B可知，Ovsynch法處理的排卵水牛和不排卵水牛P4濃度在0～7 d和9～12 d均呈上升趨勢，CIDR法處理的排卵水牛和不排卵水牛P4濃度在0～7 d基本不變，7～12 d呈逐漸上升趨勢，且10～12 d的濃度低于Ovsynch法。

表6 排卵水牛和不排卵水牛血清P4水平在同期發(fā)情處理中不同時間段的比較

2.6 水牛INH測定 由表7可知，第7天用Ovsynch法測得的不排卵水牛INH濃度顯著高于CIDR法不排卵水牛(P<0.05)；第10天用Ovsynch法測得的不排卵水牛INH濃度顯著低于Ovsynch法排卵水牛以及CIDR不排卵水牛濃度(P<0.05)。由圖3A可知，2種方法處理的排卵水牛和不排卵水牛INH濃度變化總體均呈波動上升的趨勢。

表7 排卵水牛和不排卵水牛血清INH水平在同期發(fā)情處理中不同時間段的比較

2.7 水牛IGF-1測定 由表8可知，第10天用Ovsynch法測得的排卵水牛IGF-1濃度顯著高于Ovsynch法不排卵水牛濃度(P<0.05)。由圖3B可知，2種方法處理的排卵水牛IGF-1濃度變化總體均呈逐漸上升的趨勢，而2種方法處理的不排卵水牛IGF-1濃度在7～12 d呈波動上升趨勢，且10～12 d的濃度低于排卵水牛。

圖3 排卵水牛和不排卵水牛血清INH(A)和IGF-1(B)變化規(guī)律

表8 排卵水牛和不排卵水牛血清IGF-1水平在同期發(fā)情處理中不同時間段的比較

3 討論

國內(nèi)外對水牛的同期發(fā)情方案進(jìn)行了大量的研究，開發(fā)出以O(shè)vsynch法和CIDR-Ovsynch法為代表的多種基礎(chǔ)以及改良方案[3,7]。Mirmahmoudi等[8]使用Ovsynch法在水牛發(fā)情淡季進(jìn)行同期發(fā)情處理后得到的發(fā)情率為49%(230/414)，而Neglia等[5]使用CIDR-Ovsynch法得到的發(fā)情率為30%(6/20)。本試驗發(fā)現(xiàn)，在水牛發(fā)情淡季使用Ovsynch法的發(fā)情排卵效果優(yōu)于使用CIDR法，此結(jié)果與已有報道一致，且摩拉水牛的發(fā)情排卵效果優(yōu)于尼里-拉菲水牛。陳明棠等[6]使用Ovsynch法的研究結(jié)果則顯示，摩拉水牛的發(fā)情率(67.09%)和排卵率(77.36%)均低于尼里-拉菲水牛的發(fā)情率(87.18%)和排卵率(89.66%)，考慮到陳明棠等的研究是收集了不同牛場、不同季節(jié)、不同年齡段的大量數(shù)據(jù)得出的結(jié)果，而本試驗中試驗水牛數(shù)量較少，摩拉水牛和尼里-拉菲水牛的發(fā)情排卵情況還需進(jìn)一步研究。

FSH在雌性哺乳動物中能刺激有腔卵泡的生長和成熟，以及顆粒細(xì)胞的增殖和E2的產(chǎn)生，在排卵前FSH濃度隨著排卵前卵泡分泌E2的增加而迅速下降。Kaker等[9]研究發(fā)現(xiàn)，水牛FSH在排卵前達(dá)到峰值后逐漸下降。王慧英等[10]也觀察到水牛血清FSH在排卵前4天開始緩慢上升至峰值15.62 ng/mL，在排卵后又明顯下降。本試驗發(fā)現(xiàn)，排卵水牛在排卵當(dāng)天的FSH濃度迅速下降并低于不排卵水牛，不排卵水牛在此階段FSH濃度變化平緩未呈下降趨勢，與已有報道相符。LH具有誘導(dǎo)排卵以及刺激卵巢產(chǎn)生P4的作用，LH在排卵前激增并出現(xiàn)峰值，從而觸發(fā)排卵。Rahe等[11]研究發(fā)現(xiàn)，水牛與牛一樣，LH在排卵前和發(fā)情日激增。Rhodes等[12]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后母牛和乏情母牛進(jìn)行P4處理會促進(jìn)LH脈沖性釋放。而Barile等[13]則發(fā)現(xiàn)，同期發(fā)情處理與自然發(fā)情的LH峰值結(jié)果一致。本試驗結(jié)果表明，無論水牛是否排卵，LH均呈逐漸上升的趨勢，但CIDR法處理的水牛在9～12 d的LH濃度高于Ovsynch法，說明外源P4處理的確會促進(jìn)LH脈沖性釋放。

雌激素負(fù)責(zé)雌性生殖系統(tǒng)的生長和調(diào)節(jié)以及繼發(fā)性特征，E2是雌激素4種類型之一，由發(fā)育中的卵泡顆粒細(xì)胞產(chǎn)生并具有與卵巢卵泡發(fā)育情況一致的周期性。排卵前由于黃體逐漸消失，P4的含量降低，此時可岀現(xiàn)E2的排卵前高峰。賈銀海等[14]發(fā)現(xiàn)，母水牛在發(fā)情第15～17天出現(xiàn)E2最高峰值244.70 pg/mL。王慧英等[10]也觀察到水牛血清E2含量在發(fā)情周期的第19天開始發(fā)情時升高達(dá)到最高峰值。本試驗發(fā)現(xiàn)，排卵水牛E2濃度在10～11 d時大幅上升，而不排卵水牛在10～12 d時呈先小幅上升后又下降的趨勢，說明排卵水牛具有排卵前E2高峰，而不排卵水牛則沒有。P4具有刺激子宮內(nèi)膜的血管生長和營養(yǎng)分泌以支持胚胎植入的功能。因為黃體是循環(huán)P4的來源，P4水平的上升和下降與黃體的生長和衰退一致。王慧英等[10]觀察到水牛P4含量由發(fā)情周期的第5天緩慢上升，到第13天達(dá)到峰值，在第19天發(fā)情開始時有一個明顯下降的過程且保持相對平穩(wěn)的水平。本試驗發(fā)現(xiàn)，Ovsynch法處理的水牛P4水平在0～12 d呈逐漸上升的趨勢，而CIDR法處理的水牛P4水平在第0天和第7天基本保持不變，7～12 d呈小幅度波動上升且部分天數(shù)濃度小于Ovsynch法?？紤]到CIDR法中CIDR在母牛陰道內(nèi)逐漸釋放P4，可能是外源P4影響了水牛內(nèi)源P4的釋放，導(dǎo)致CIDR處理的水牛P4水平總體較低，具體還需進(jìn)一步的研究。

FSH、LH、E2、P4這4種生殖激素在生殖周期的變化規(guī)律已有大量研究，也有研究表明INH和IGF-1與卵泡發(fā)育有關(guān)[15-16]。INH對FSH的合成和分泌具有選擇性的抑制作用，還可通過自分泌和旁分泌作用調(diào)節(jié)E2的生成。Singh等[17]研究發(fā)現(xiàn)，水牛血漿FSH水平與同期相對較低的INH水平以及較高的E2水平相對應(yīng)，即INH和E2對水牛FSH分泌均有反饋調(diào)節(jié)作用。本試驗結(jié)果顯示，2種方法處理的水牛無論是否排卵，INH水平總體均呈波動上升的趨勢，與前人的研究結(jié)果一致。IGF-I可由卵巢顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞合成和分泌，具有刺激顆粒細(xì)胞和顆粒黃體細(xì)胞分泌E2和P4的作用[18]。本試驗發(fā)現(xiàn)，2種方法處理的排卵水牛IGF-1水平呈平緩上升趨勢，且在第9～11天的濃度高于不排卵水牛，而不排卵水牛則呈波動上升的趨勢。排卵水牛在第9～11天時IGF-1和E2濃度都呈大幅上升的變化規(guī)律，說明IGF-1的確具有刺激E2分泌的作用，與前人的研究結(jié)果相符。

綜上所述，河流型水牛用Ovsynch法比CIDR法的發(fā)情排卵效果好，摩拉水牛的同期發(fā)情排卵效果優(yōu)于尼里-拉菲水牛；同期發(fā)情處理后正常排卵的河流型水牛在排卵前具有明顯的FSH濃度下降以及E2、IGF-1濃度上升規(guī)律。