NaCl脅迫對2種補血草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

鄭伶杰，丁丁，丁馮潔，郭艷超

(河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所/唐山市植物耐鹽研究重點實驗室/河北省鹽堿地綠化技術(shù)創(chuàng)新中心，河北唐山 063299)

據(jù)報道，我國現(xiàn)有鹽堿地總面積達99.13萬平方千米，約占國土面積的10%，主要分布在黃淮海平原、東部濱海地區(qū)、新疆和西藏部分地區(qū)以及東北松嫩平原等地[1]。鹽堿地土壤存在有機質(zhì)含量少、肥力弱、理化性狀差、對植物有害的離子多等諸多問題，因此，選擇適應(yīng)性強的植物類型是實現(xiàn)鹽堿地綠化的重要途徑之一。

補血草屬植物是白花丹科(Plumbaginaceae)多年生泌鹽草本植物，有耐干旱、耐鹽堿、耐土壤貧瘠等特點，多分布于沙漠、戈壁灘和鹽化草甸等環(huán)境，具有重要的生態(tài)利用價值[2]。補血草不僅可以作為園林綠化植物用于打造城市群體景觀，也是不可多得的干花植物和插花素材；此外，補血草的根、葉、花還可以入藥，具有醫(yī)療保健功效，可為醫(yī)藥工業(yè)原料。

澳洲補血草和歐洲補血草是河北省鹽堿地綠化技術(shù)創(chuàng)新中心從國外引進的2種補血草屬新品種，株型整齊美觀，景觀效果好。根據(jù)本課題組前期觀察，2種補血草在河北濱海地區(qū)生長良好，可作為鹽堿地綠化的優(yōu)良地被植物。目前關(guān)于補血草屬植物耐鹽性的研究多集中在二色補血草、大葉補血草、黃花補血草等品種，對澳洲補血草和歐洲補血草的相關(guān)研究還未見報道。因此，本試驗以澳洲補血草和歐洲補血草的種子和幼苗為試驗材料，分別設(shè)計不同濃度NaCl處理，比較不同濃度鹽脅迫對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，以期為耐鹽補血草品種選育和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料經(jīng)河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所王文成研究員鑒定為澳洲補血草和歐洲補血草，種子由河北省鹽堿地綠化技術(shù)創(chuàng)新中心提供。

1.2 補血草種子在NaCl脅迫下的萌發(fā)試驗

1.2.1 試驗設(shè)計及處理方法 試驗于2020年11月在河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所實驗室內(nèi)進行，采用隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)置NaCl溶液質(zhì)量百分比濃度分別為0(CK1)、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%，3次重復(fù)。選取完整程度一致的2種補血草種子，先用次氯酸鈉溶液浸泡20 min，然后用無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干，均勻擺放于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑120 mm)中，每皿30粒，隨后分別加入各濃度NaCl溶液10 mL至濾紙完全濕潤，用封口膜包裹培養(yǎng)皿邊緣防止水分流失；將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中，在溫度(25±1)℃、濕度60%、光強4000 lx條件下培養(yǎng)。1.2.2 調(diào)查指標與計算方法 以種子露白作為發(fā)芽標準，在發(fā)芽試驗第5天統(tǒng)計發(fā)芽勢，第7天統(tǒng)計發(fā)芽率，并每皿隨機取10粒已發(fā)芽種子，用游標卡尺測量胚根長、胚軸長，計算根軸比(胚根長與胚軸長的比值)。發(fā)芽率、發(fā)芽勢、相對鹽害率的計算公式如下:

1.3 補血草幼苗在NaCl脅迫下的培養(yǎng)試驗

1.3.1 試驗設(shè)計與處理方法 試驗于2021年1月至5月在本研究所試驗基地進行，采用隨機區(qū)組設(shè)計，每處理重復(fù)4次，每重復(fù)一盆。將補血草芽苗小心移栽到含營養(yǎng)土的穴盤中，置于溫度(25±1)℃、濕度60%、光照時間14 h/d、光強4000 lx的人工氣候室中正常培養(yǎng)；待芽苗長至10片真葉時，移栽至裝有基質(zhì)(蛭石和草炭等體積混勻)的花盆中，每盆一株，于室外防雨棚中繼續(xù)培養(yǎng)一個月后進行鹽脅迫處理。配制NaCl質(zhì)量百分比濃度分別為0(CK2)、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的霍格蘭營養(yǎng)液，根據(jù)試驗設(shè)計分別澆灌補血草幼苗，每次每盆澆灌600 mL，并將流入托盤中的營養(yǎng)液倒回花盆中，每3 d澆灌一次，處理30 d，取樣進行各指標測定。

1.3.2 測定指標及方法 取2種補血草植株相同部位的葉片，用游標卡尺測量葉片的覆蓋直徑、長度和寬度；將補血草幼苗地上部和地下部分別用自來水清洗干凈，濾紙吸干水分，用電子天平稱量地上部和地下部的鮮重，然后105℃殺青30 min后80℃烘干至恒重，用電子天平稱量地上部和地下部的干重，計算相對含水率。

葉片色素含量采用95%乙醇提取、分光光度法測定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍比色法測定，可溶性糖含量采用硫酸蒽酮比色法測定；脯氨酸、甜菜堿、總黃酮和總?cè)坪繀⒖嘉湎鉡3]、王思瑤等[4]的方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2019軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、處理，使用SPSS 26.0軟件進行方差分析。采用Origin 2019b軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl處理對2種補血草種子萌發(fā)的影響

2.1.1 發(fā)芽勢和發(fā)芽率 由圖1可見，澳洲補血草、歐洲補血草種子在試驗各NaCl濃度下均具有發(fā)芽能力，但明顯低于CK1(發(fā)芽勢、發(fā)芽率分別為98.8%、100%和78.9%、82.2%)。隨NaCl濃度升高，其發(fā)芽勢、發(fā)芽率均呈下降趨勢，其中，澳洲補血草在0～0.6% NaCl處理下變化較緩，0.9%NaCl處理時發(fā)芽率仍為85.6%，之后快速下降；而歐洲補血草在低濃度NaCl(0.3%～0.6%)下即快速下降，0.6% NaCl處理時發(fā)芽勢僅為18.9%，發(fā)芽率僅為CK1的24.3%，之后變化趨于平緩。兩品種間比較，澳洲補血草的發(fā)芽勢和發(fā)芽率在各濃度NaCl處理下均高于歐洲補血草，表明歐洲補血草對鹽脅迫更敏感。

圖1 不同濃度NaCl處理對補血草種子萌發(fā)的影響

根據(jù)前人研究結(jié)果[5]，發(fā)芽率為75%、50%、10%時所對應(yīng)的鹽濃度分別為補血草種子萌發(fā)期耐鹽的適宜濃度、半致死濃度和極限濃度。因此，以發(fā)芽率為因變量(y)、NaCl濃度為自變量(x)進行回歸分析，得到澳洲補血草和歐洲補血草的回歸方程分別為y＝－50.734x2＋26.815x＋96.561(P＝0.003，R2＝0.9815)和y＝50x2－129.333x＋86.2(P＝0.006，R2＝0.9684)，經(jīng)計算得出澳洲補血草和歐洲補血草種子萌發(fā)期耐鹽的適宜濃度、半致死濃度、極限濃度分別為0.97%、1.25%、1.59%和0.09%、0.32%、0.91%，表明澳洲補血草種子的耐鹽性高于歐洲補血草。

2.1.2 胚根長和胚軸長 如表1所示，在NaCl濃度為0.3%～1.5%范圍內(nèi)，總體來說2種補血草種子的胚根長、胚軸長、根軸比隨NaCl濃度升高呈降低趨勢，相對鹽害率呈上升趨勢。與CK1相比，0.3% NaCl處理顯著促進澳洲補血草胚根的伸長(11.57 mm)，并顯著抑制胚軸的伸長(1.79 mm)，根軸比達到6.5；當鹽濃度超過0.6%后，澳洲補血草的胚根長和胚軸長顯著縮短，根軸比降低，相對鹽害率大幅上升。鹽脅迫抑制了歐洲補血草種子胚根和胚軸的伸長，0.6% NaCl處理下即達到顯著水平，在較高鹽濃度(1.2%～1.5%)時胚根無法正常生長，相對鹽害率可高達94.6%。

表1 不同濃度NaCl處理對2種補血草種子萌發(fā)后胚芽的影響

2.2 鹽脅迫對兩種補血草幼苗植株性狀的影響

2.2.1 葉片覆蓋直徑 如圖2所示，鹽處理30 d后，隨著NaCl濃度的升高，2種補血草的葉片覆蓋直徑呈降低趨勢，但澳洲補血草變化幅度較小，在NaCl濃度2.0%以內(nèi)與對照無顯著差異，3.0%NaCl處理下葉片覆蓋直徑為6.05 cm，比CK2降低了23%。歐洲補血草的葉片覆蓋直徑明顯高于澳洲補血草，但受NaCl脅迫顯著抑制，且呈NaCl濃度越高抑制作用越明顯趨勢，在2.5%NaCl處理下葉片覆蓋直徑最低為10.1 cm，顯著低于對照。結(jié)合形態(tài)觀察并分析30 d內(nèi)葉片覆蓋直徑的增長量發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的增加，2種補血草的葉片覆蓋直徑增長量整體呈現(xiàn)下降趨勢，且歐洲補血草的增長量變化更為劇烈，當NaCl濃度超過2.0%后增長量被明顯抑制，葉片皺縮邊緣卷曲。

圖2 不同濃度NaCl處理對2種補血草 幼苗葉片覆蓋直徑的影響

2.2.2 葉片長度和寬度 如圖3A所示，歐洲補血草的葉片長度明顯高于澳洲補血草，但其受NaCl脅迫的影響更大。澳洲補血草葉片長度在1.0%～1.5% NaCl處理下與CK2無顯著差異，均約39.00 mm；當NaCl濃度達到2.0%后才顯著降低，以2.0% NaCl處理最低，為32.00 mm。歐洲補血草葉片長度在NaCl處理下顯著降低，2.5%NaCl處理下最低，僅為對照的60%。

由圖3B可以看出，澳洲補血草和歐洲補血草的葉片寬度整體表現(xiàn)出先升高后降低再升高的變化趨勢，低濃度NaCl處理對其葉寬生長有一定促進作用，均在1.5% NaCl處理下最大，分別為20.50 mm和23.71 mm。

圖3 不同濃度NaCl處理對2種補血草幼苗葉片長度和寬度的影響

2.2.3 地上部和地下部生長 由表2可知，澳洲補血草和歐洲補血草的地上部鮮重有隨NaCl濃度升高先增加后降低的趨勢，分別在1.5%和2.0% NaCl處理時最高，分別比CK2增加10.86%和6.54%；在較高濃度(2.5%～3.0%)NaCl脅迫下2種補血草的地上部生長都受到明顯抑制。NaCl處理明顯抑制2種補血草的地下部生長，NaCl濃度越高，其地下部鮮重下降越顯著，3.0% NaCl處理下澳洲補血草和歐洲補血草的地下部鮮重分別為CK2的58.3%和26.5%。NaCl濃度達到1.5%后顯著降低2種補血草的地上部相對含水率，但NaCl處理對地下部相對含水率無顯著影響。由地上部鮮重與地下部鮮重的比值可見，CK2處理下2種補血草的該比值均為1.1，NaCl處理使該比值增大，且NaCl濃度越高值越大，3.0% NaCl處理時澳洲補血草和歐洲補血草的該比值最大，分別為1.6和4.0，說明鹽脅迫對2種補血草尤其歐洲補血草地下部生長的抑制作用更大，鹽濃度越高越明顯。

表2 不同濃度NaCl處理對2種補血草幼苗地上部和地下部生長的影響

2.3 不同濃度NaCl脅迫對2種補血草幼苗葉片光合色素含量的影響

由圖4可知，隨著NaCl濃度的升高，澳洲補血草幼苗葉片內(nèi)葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，均在1.5% NaCl處理下達到最大值，且顯著高于CK2。歐洲補血草幼苗葉片內(nèi)的葉綠素a、總?cè)~綠素含量也呈先升高后降低的變化趨勢，均在1.0% NaCl處理下達最大值，其中總?cè)~綠素含量與CK2差異達到顯著水平；但葉綠素b含量波動變化，2.0% NaCl處理時值最高，其次為1.0% NaCl處理，均顯著高于CK2。2種補血草葉片內(nèi)類胡蘿卜素含量隨NaCl濃度升高的變化趨勢存在明顯差異，澳洲補血草的表現(xiàn)為先升高后降低再升高，歐洲補血草則表現(xiàn)為降低趨勢?？傮w來看，低濃度(1.0%～1.5%)鹽脅迫有利于補血草葉片中光合色素的積累，而較高濃度(2.0%～3.0%)鹽脅迫抑制其積累。

圖4 不同濃度NaCl處理對2種補血草幼苗葉片光合色素含量的影響

2.4 不同濃度NaCl脅迫對2種補血草幼苗葉片內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2種補血草葉片內(nèi)的可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和甜菜堿4種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對鹽脅迫的響應(yīng)不同(圖5)。隨NaCl濃度升高，2種補血草葉片內(nèi)可溶性蛋白含量均呈先升高后降低趨勢，且均在2.0%NaCl處理下最大；與CK2相比，除2.0%NaCl處理下歐洲補血草可溶性蛋白含量與CK2差異顯著外，2種補血草各處理間均差異不顯著(圖5A)。澳洲補血草葉片內(nèi)可溶性糖含量除在1.0% NaCl處理下略低于CK2外，其余NaCl處理均能增加其含量，且隨NaCl濃度升高呈先升后降變化趨勢，在2.5%NaCl處理下達到最大，與CK2差異顯著；NaCl處理明顯增加歐洲補血草葉片內(nèi)的可溶性糖含量，在1.0% NaCl處理下最大(5.03 mg/g)，顯著高于CK2，之后隨著NaCl濃度升高而逐漸降低，與CK2差異不顯著(圖5B)。由圖5C、D可以看出，澳洲補血草葉片內(nèi)的脯氨酸和甜菜堿含量隨著NaCl濃度的升高呈逐漸上升趨勢，在3.0%NaCl處理下分別是CK2的8.6倍和1.5倍；歐洲補血草葉片內(nèi)脯氨酸和甜菜堿含量均隨NaCl濃度升高先增加后減少，分別在2.5%和2.0% NaCl處理下達到最大值，分別比CK2提高3.82倍和36.5%，差異顯著。

圖5 不同濃度NaCl處理對2種補血草幼苗葉片內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.5 不同濃度NaCl脅迫對2種補血草幼苗葉片內(nèi)活性物質(zhì)含量的影響

如圖6A所示，NaCl處理降低了2種補血草葉片內(nèi)的總黃酮含量，且表現(xiàn)出隨NaCl濃度升高先下降后上升趨勢，除2.0% NaCl處理顯著降低歐洲補血草的總黃酮含量外，其余處理均與CK2差異不顯著。

由圖6B可知，2.0% NaCl處理增加了澳洲補血草葉片內(nèi)的總?cè)坪?，其余NaCl處理均降低總?cè)坪?，?.0%～1.5% NaCl處理下降低顯著。NaCl處理顯著提高了歐洲補血草葉片內(nèi)的總?cè)坪?，且隨著NaCl濃度升高呈現(xiàn)先提高后降低的變化趨勢，在2.0% NaCl處理下值最高。

圖6 不同濃度NaCl處理對2種補血草幼苗葉片內(nèi)活性物質(zhì)含量的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 鹽脅迫對2種補血草種子萌發(fā)的影響

種子萌發(fā)是作物生長過程的第一個階段，也是其適應(yīng)外界環(huán)境的關(guān)鍵時期。種子萌發(fā)期的耐鹽能力，在一定程度上可以反映種質(zhì)的耐鹽性，可以作為早期鑒定種質(zhì)耐鹽性的一個方法[6]。本試驗結(jié)果表明，0.3%～1.5% NaCl處理抑制了2種補血草種子的萌發(fā)，發(fā)芽勢和發(fā)芽率大幅下降，且NaCl濃度越高抑制效果越顯著。2種補血草間比較，歐洲補血草種子萌發(fā)對鹽脅迫更敏感，0.3% NaCl處理即顯著降低其發(fā)芽勢和發(fā)芽率，而澳洲補血草種子萌發(fā)在高于0.6%的NaCl處理下才受到顯著抑制，說明補血草屬植物在鹽脅迫下的萌發(fā)存在種間差異。前人對黑果枸杞[7]、花花柴[8]的研究表明，低濃度鹽脅迫對其種子萌發(fā)的影響不顯著，鹽濃度越大抑制效果越明顯。這可能是由于低濃度鹽脅迫下種子雖然處于輕度滲透脅迫狀態(tài)，但離子進入細胞后降低了細胞滲透勢，種子吸水能力增強，從而促進種子萌發(fā)；而高濃度鹽脅迫造成種子細胞離子失衡、滲透調(diào)節(jié)紊亂、種子吸水率下降，因此抑制種子萌發(fā)。

通過對2種補血草種子發(fā)芽率與NaCl濃度的回歸分析，以耐鹽半致死濃度和相對鹽害率為參考指標[9]，澳洲補血草種子耐鹽半致死濃度高于歐洲補血草，相對鹽害率低于歐洲補血草，表明澳洲補血草種子萌發(fā)期的耐鹽能力強于歐洲補血草。

3.2 鹽脅迫對2種補血草幼苗植株性狀及葉片中光合色素積累的影響

植株對環(huán)境變化的反應(yīng)最終體現(xiàn)在表型上，本研究結(jié)果表明鹽脅迫明顯影響了2種補血草幼苗的生長。歐洲補血草幼苗在鹽濃度2.0%下葉片覆蓋直徑的增長被明顯抑制，幾乎停止增長，而澳洲補血草在鹽濃度2.5%下才出現(xiàn)這種現(xiàn)象。分析葉片長度可以發(fā)現(xiàn)，鹽濃度2.5%下澳洲補血草葉片長與CK2相比減少低于20%，而歐洲補血草則減少40%。前人研究認為[10]，地上部生長能提高植物對光能的利用效率，促進有機物的積累，而地下部生長則體現(xiàn)了植物對土壤水分和無機養(yǎng)分的吸收能力。本研究結(jié)果顯示，隨NaCl濃度升高，2種補血草的地上部鮮重先增加后降低，地下部鮮重降低，地上部相對含水率呈降低趨勢，地下部相對含水率無顯著變化，地上部與地下部鮮重比值增加，并在3.0% NaCl處理下達到最大值(澳洲補血草和歐洲補血草分別為1.6和4.0)，說明鹽脅迫下2種補血草幼苗根系生長受到的抑制作用更強。

綜合葉片覆蓋直徑增長量、葉片長度、地上部與地下部鮮重比值等表型指標來看，澳洲補血草幼苗的耐鹽能力強于歐洲補血草，與種子萌發(fā)耐鹽性結(jié)果具有一致性。

光合作用是綠色植物機體內(nèi)主要的新陳代謝過程，光合色素含量多少能在一定程度上體現(xiàn)出植物光合作用效率的高低，影響光合產(chǎn)物的積累[11，12]。本研究結(jié)果顯示，較低濃度(1.0%～1.5%)NaCl處理可增加2種補血草幼苗葉片中總?cè)~綠素含量及澳洲補血草的類胡蘿卜素含量，較高濃度(2.0%～3.0%)NaCl處理則降低2種補血草的總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量，這與在蒙古柳[13]、檉柳[14]上的研究結(jié)果一致，表明較高濃度鹽脅迫對植物葉綠體膜系統(tǒng)造成傷害，使光合色素降解加速或合成受到抑制。

3.3 鹽脅迫對2種補血草幼苗葉片內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和活性物質(zhì)含量的影響

鹽脅迫對植物的傷害以滲透脅迫傷害為主，外界高鹽分造成的滲透勢降低，導(dǎo)致細胞吸水困難甚至失水，從而產(chǎn)生生理性干旱。植物通過轉(zhuǎn)運外界無機離子和自身合成有機小分子如脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等，可調(diào)節(jié)細胞滲透勢，保護細胞膜以及蛋白的活性，使得水分的跨膜運輸向著促進植物生長的方向進發(fā)[15－17]，從而緩解鹽脅迫造成的傷害。本研究結(jié)果顯示，NaCl處理可提高2種補血草幼苗葉片中可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和甜菜堿含量，說明鹽脅迫下甜菜堿與脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白具有協(xié)同抗逆作用，維持細胞的穩(wěn)定性，這與在番茄[18]、顛茄[19]上的研究結(jié)果一致。甜菜堿是一種季胺型水溶性生物堿，大多數(shù)植物在受到逆境脅迫時均能檢測到甜菜堿的積累[20]。

黃酮類化合物和五環(huán)三萜類化合物均屬植物次生代謝產(chǎn)物，黃酮類通過對自由基的清除和捕獲延緩或防止脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，從而發(fā)揮藥用活性功能[21]?？?cè)祁惛鶕?jù)結(jié)構(gòu)特點分為齊墩果烷型、烏蘇烷型、羽扇豆烷型和木栓烷型，具有保肝、抗炎、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等活性，在鵝掌柴[22]、桑黃[23]、刺梨[24]等藥用植物中普遍存在，對其研究主要集中于活性成分提取鑒定和藥用功能研究方面，但在補血草屬植物中的研究還未見報道。本試驗結(jié)果表明，NaCl脅迫降低補血草葉片中總黃酮的含量，這與在三葉青[25]上的研究結(jié)果一致。2種補血草葉片中總?cè)坪渴茺}脅迫的影響有所不同，這可能是因為藥用植物中活性成分合成與累積受逆境脅迫影響，而不同植物種類對逆境脅迫的響應(yīng)存在差異。

綜合本研究結(jié)果，鹽脅迫能抑制2種補血草種子萌發(fā)和幼苗生長，高濃度鹽脅迫的抑制效果更明顯；2種補血草間相比，澳洲補血草種子和幼苗的耐鹽能力強于歐洲補血草。這可為兩種補血草種質(zhì)的合理利用提供參考。