葡萄中微生物細菌研究進展

荊曉姝，蘇玲，張倩倩，湯曉宏，張一帆，管雪強

（1. 山東省葡萄研究院/山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術創(chuàng)新中心，山東濟南 250100；2. 山東農業(yè)大學園藝科學與工程學院，山東泰安 272018）

植物根際、葉際、果實周圍以及植物的內部環(huán)境，為細菌提供了良好的生態(tài)位，形成了不同的微生物群組合。植物相關微生物（表面微生物、根際微生物以及內生菌）通過與植物互作而影響植物的生長[1]。在生長過程中，植物和微生物交互作用，使微生物的群落結構發(fā)生變化[2]，進而影響植物的抗性（生物脅迫和非生物脅迫）和次級代謝產物的產量[3]。微生物對植物的促生機制分為直接促生作用和間接促生作用，直接促生作用包括影響植物體內激素含量[4]，改進植物根際營養(yǎng)狀況如促進難溶性磷、鉀和微量元素的釋放、聯(lián)合固氮等[5-6]，以及刺激植物產生誘導系統(tǒng)抗性[1,7]等；間接促生作用包括產生抑制病原菌以及害蟲的抗生素、抗菌蛋白或鐵載體等次級代謝產物[8]，降解農藥等生物外源性物。

葡萄由于種植年限較長，其生長發(fā)育與微生物關系密切。在生長過程中，葡萄大部分內生菌株來源于土壤，并通過根內層向地上部遷移。因此，土壤和根際菌群結構決定葡萄地上部分的菌落，影響著果實的風土環(huán)境[9]。此外，植物促生菌能夠通過各種途徑提高植物抵抗生物脅迫或非生物脅迫能力。葡萄接種促生菌株后，體內植物激素ABA、SA等含量會增加[7,10-11]。植物激素進一步誘導多種防御途徑：（1）滲透調節(jié)途徑：可以調節(jié)氣孔開度、糖代謝產物或者萜烯類化合物的產量，減少水分流失，增加抗逆性[10,12-14]；（2）活性氧調節(jié)途徑：通過活性氧信號調節(jié)抗氧化防御基因的轉錄水平，提高抗逆性[10,15-18]。植物通過以上途徑增強植物在生物脅迫以及非生物脅迫下的抗逆性。在葡萄生長過程中，病害嚴重影響葡萄的質量和產量。拮抗微生物是傳統(tǒng)而重要的生物防治，通過產生抑制病原菌以及害蟲的抗生素、抗菌蛋白或鐵載體等次級代謝產物，減少病原菌的傷害，利用拮抗菌株并挖掘其代謝產物，開發(fā)微生物源農藥是當今新農藥研發(fā)的重要來源之一。綜上所述，研究葡萄相關微生物對于微生物資源開發(fā)，以及利用微生物實現(xiàn)葡萄的綠色栽培和果實的品質提升是葡萄產業(yè)提質增效的重要路徑。

1 葡萄微生物細菌種群結構研究進展

現(xiàn)有研究表明，影響葡萄微生物細菌種群結構的因素有葡萄園風土、樹齡、砧木種類、葡萄品種及發(fā)育階段等，其中葡萄園風土是由管理方式、葡萄園位置、土壤質地、氣候等綜合決定的。

在葡萄園中，土壤、樹皮、葉片和果實上的細菌群落大小和結構既有生態(tài)系統(tǒng)特異性，又有交互作用。由于生態(tài)環(huán)境的營養(yǎng)程度不同，細菌豐度以及多樣性在不同的生態(tài)位中有差異，表現(xiàn)為土壤和樹皮中較高，葉片和果實稍低[19]。尤其是果實早期階段，與土壤和樹皮相比較，果實中細菌的豐度和多樣性更少。在不同的生態(tài)位中，核心微生物菌群放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria） 均有存在，但是數(shù)量不同[19]。并且，細菌群落結構也具有相似性：土壤和樹皮的群落結構相似，樹葉和果實的群落結構相似。土壤中的微生物菌群結構與土壤pH以及質地相關[20]，主要為放線菌門、變形菌門（以β-變形菌門為主）。此外，擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門、梭菌門（Clostridia）、厚壁菌門和酸菌門 （Acidobacteria）的豐度有顯著地域差異[19-20]。樹皮中主要是放線菌門、梭菌門和多種變形菌門（α-、ε-、γ-變形菌門）。葉片和漿果中主要是變形菌門，且以α-和γ-變形菌門為主[19]。種群結構分析表明，葡萄果實表面的核心微生物菌群結構大致相同[21]。從門的水平來講，優(yōu)勢菌門為變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門。從屬的水平上來講，優(yōu)勢菌屬為假單胞菌 （Pseudomonas）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、芽孢桿菌（Bacillus）、短小桿菌（Curtobacterium）、甲基桿菌（Methylobaxterium）[21-23]，這些屬種的細菌占整個細菌總量的1/3[21]。

細菌在不同的生態(tài)位中具有種屬特異性。在土壤和樹皮中，50%的種屬是土壤和樹皮中特有的，在樹葉和葡萄果實中不存在。同樣，在果實和葉片中，50%的種屬果實和葉片特有，在樹干和土壤中不存在[21]。并且，葉片和果實的微生物菌群種屬具有豐度差異性。與葉片的菌群相比較，有些菌群在果實中更容易檢測到[21]。假單胞菌在葉片和果實中具有絕對優(yōu)勢，是微生物核心群中最豐富的屬之一，因此以假單胞菌為例研究菌群的生態(tài)位特異性。通過序列比對將假單胞菌分為兩類：I類假單胞菌和II類假單胞菌。進一步研究發(fā)現(xiàn)，果實中主要是I類假單胞菌，葉片中主要是II類假單胞菌以及少量I類假單胞菌[21]。以上結果說明，細菌在不同的生態(tài)位中維持平衡和遷移。

嫁接是葡萄生產中最常見和主要的繁殖方式，因此砧木與葡萄微生物菌落的豐度、多樣性以及種群關系密切，嫁接的砧木種類決定了根內層的微生物群，也決定了地上部分的微生物群[9]。

以‘馬克貝爾’和‘赤霞珠’作為研究對象，分析葡萄園風土和葡萄品種對土壤微生物群落多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)葡萄園風土對葡萄的微生物組成影響大于葡萄品種[20,24]。但是，在特定的地理位置范圍內，葡萄品種在微生物群落中起著重要作用。由于不同葡萄品種的果實在大小、形狀以及生長特性上具有差異，微生物的生物多樣性以及豐度也不同[24]，因此，可以根據(jù)關鍵細菌和真菌類群的豐度區(qū)分葡萄品種。

在相同的葡萄園內，與葡萄品種相比較，樹齡對微生物菌群的影響更大[23]。對同一葡萄園內不同樹齡的土壤微生物進行分析發(fā)現(xiàn)，隨著樹齡的增加，土壤微生物的群落多樣性先逐漸降低，然后再逐漸升高。并且，老齡園的細菌降幅明顯高于新齡園[25]。長期種植葡萄后，土壤細菌中變形菌門、擬桿菌門、疣微菌門（Verrucomicrobia）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）的豐度明顯增加，芽單胞菌門、酸桿菌門、放線菌門等的豐度顯著降低[26]。同樣，地上部分葡萄果實和葉片上的細菌也呈現(xiàn)相同的趨勢[23,26]。隨著樹齡的增長，葡萄內生菌中的變形菌門由26%增加至80%，其中44%屬于α-變形桿菌，36%屬于γ-變形桿菌。而桿菌門（Bacilli）和放線菌門分別由48%和26%降至15%和5%[26]。這些研究均說明樹齡對葡萄微生物菌群結構具有重要影響[23,26]。與多數(shù)耕作土地相同，土壤微生物中變形菌門和擬桿菌門的豐度增加可能更多的與葡萄園的耕作相關[20,27]。但是，也有研究分析土壤管理方法與微生物菌群結構的關系，發(fā)現(xiàn)菌群結構在果實中沒有相應的動態(tài)變化[28]。

葡萄中微生物群落的演替還受到葡萄發(fā)育階段的影響。在不同的葡萄園中，核心微生物菌群結構與葡萄發(fā)育階段相關，且葡萄發(fā)育階段對微生物多樣性的影響大于葡萄園風土對微生物多樣性的影響。在發(fā)育過程中，菌群的多樣性呈下降趨勢，但保留核心微生物群，并且核心菌群能夠來區(qū)分葡萄的發(fā)育階段。例如，鏈格孢屬 （Alternaria）在坐果期、轉色早期以及轉色晚期積累，但是在成熟收獲期減少。鞘氨醇單胞菌在葡萄坐果期、轉色早期以及轉色晚期豐度都很高，并且在轉色早期迅速增長[29]。

綜上所述，葡萄園風土、砧木種類、種植年限、品種以及果實發(fā)育過程中葡萄表皮微生物群落呈現(xiàn)動態(tài)變化，但是始終保留核心微生物菌群。探索微生物菌群的變化，有助于提高葡萄園的管理技術，合理利用葡萄園的生態(tài)功能，減少化學殺菌劑或農藥的使用，保持葡萄園的生態(tài)健康，突出葡萄酒的地域特色[29]。

2 葡萄微生物細菌對非生物脅迫的研究進展

自然界中，植物會受到干旱、低溫、重金屬、鹽堿等不利的非生物環(huán)境因素影響。植物應對不同的非生物脅迫時，存在反應的特異性和交叉性。植物體內，活性氧在信號傳導過程中發(fā)揮著關鍵作用[30-31]。在非生物脅迫時，活性氧作為信號，可以誘導活性氧清除機制，提高抗氧化防御基因的轉錄水平或者增強抗氧化物質含量來抵御氧化脅迫。但是，當植物不能有效調節(jié)活性氧的產生與清除之間的平衡時，造成活性氧積累，引起氧化脅迫[30,32]。另外，植物在非生物脅迫時還可以通過積累和吸收無機離子或者增加小分子化合物在體內的合成和積累，充當胞質滲透劑，降低水勢來協(xié)調細胞與外界的滲透平衡，增加細胞的保水能力[33]，來緩解滲透脅迫。植株接種微生物后可以通過活性氧平衡和滲透平衡等生理生化方面的變化來應對非生物脅迫[10,12-14,34]。

2.1 低溫脅迫下微生物細菌增強葡萄抗逆性

伯克氏菌PsJN（Burkholderia phytofirmans，PsJN）是最先從洋蔥中分離得到的一種常見的根際促生菌。在常溫（26 ℃）和低溫（4 ℃）下，接種伯克氏菌PsJN均能不同程度的增加根質量和植株生長量[12]。電解質滲透率是檢驗植物逆境脅迫后細胞膜透性的參數(shù)，低溫處理后，葡萄葉片的電解質滲透率以及脯氨酸含量明顯升高，表明葡萄受到脅迫。但是，接種伯克氏菌PsJN后可以緩解電解質滲透率的升高，增強植株抗逆性[12]。葡萄幼苗接種PsJN后，通過提高淀粉、可溶性糖（甘露糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等）等滲透調節(jié)物質的含量，從而緩解葡萄幼苗的低溫冷凍脅迫[12-13]。低溫脅迫下，葡萄由于活性氧積累導致葉片膜脂過氧化，致使細胞死亡。接種伯克氏菌PsJN后，葡萄可以迅速增加活性氧產量，激活下游信號通路，提高逆境防御基因轉錄水平[14]。同時，葡萄還可以通過酚類等刺激代謝產物緩解氧化脅迫，來提高葡萄的抗寒性[12-14]。

2.2 重金屬脅迫下微生物細菌增強葡萄抗逆性

重金屬脅迫方面，接種根際促生菌能夠提高葡萄的抗逆性。用耐砷菌株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、滕黃微球菌（Micrococcus luteus）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）接種葡萄，研究重金屬污染下根際促生菌對葡萄的影響。在砷處理后，接種微生物的植株中抗壞血酸過氧化物酶（APX）、氧化氫酶（CAT ）、過氧化物酶（POD）多種抗氧化酶的活性能力明顯提高，能夠快速有效的清除活性氧，緩解重金屬引起的氧化脅迫。因此，在砷脅迫處理下，接種促生菌的植株在根質量、植株生物量以及蛋白含量方面明顯提高[34]。

2.3 滲透脅迫下微生物細菌增強葡萄抗逆性

滲透脅迫下，將‘馬爾貝克’幼苗接種細菌芽孢桿菌Rt4M10和假單孢菌Rt6M10后，葡萄植株高度、根長與葉面積均高于對照組。并且在接種細菌20、30 d，萜類化合物含量逐漸增加。其中，單萜類化合物α蒎烯、異松油烯、桉樹醇和橙花醇，倍半萜類化合物α-佛手柑烯、α-金合歡烯和金合歡醇均有所增加，并且假單孢菌Rt6M10對萜類化合物的誘導作用明顯高于芽孢桿菌Rt4M10。在接種細菌30 d后，葉片中的ABA含量增加且失水率明顯低于對照組，說明細菌可通過誘導萜類等次生代謝產物的生物合成，或者通過提高葉片中ABA的含量來緩解逆境脅迫[10]。

3 葡萄微生物細菌對生物脅迫的影響研究進展

葡萄微生物對生物脅迫主要從兩個方面來影響：（1）通過調控微生物菌群中具有拮抗活性的菌株，抑制病原菌，減少病原菌對葡萄的生物脅迫；（2）通過與植物相互作用，刺激植物產生誘導系統(tǒng)抗性，促使植物調節(jié)活性氧平衡和滲透平衡等，增強葡萄的抗逆性，緩解生物脅迫對植物的影響。

3.1 生物脅迫下微生物拮抗細菌的篩選

通過研究感病葡萄和健康葡萄微生物的群落結構，分析葡萄微生物抵御生物脅迫的機制，并且從中篩選具有拮抗活性的菌株。葡萄枝干病（Grapevine trunk diseases，GTDs）是一類主要引起葡萄枝干木質部壞死、潰瘍和頂梢枯死，嚴重時導致整株死亡的真菌性病害的總稱。目前，國際上已經報道了相關的5種葡萄枝干病害，即葡萄衰枯?。‥scadisease complex）、葡萄黑根?。˙lack foot disease）、葡萄潰瘍?。˙otryosphaeria dieback）、葡萄蔓枯?。―iaporthe dieback）和葡萄頂枯?。‥utypadieback）。研究人員通過分析有枝干病癥狀和健康葡萄的內生菌群落結構發(fā)現(xiàn)，假單胞菌在健康葡萄中的豐度更高（56%或74%），而在感病葡萄中僅占 29%或2%。因此，推測假單胞菌具有生物防治GTD病原體的潛力。進一步驗證發(fā)現(xiàn)，9株假單胞菌對葡萄潰瘍病、3株假單胞菌對頂枯病和2株假單胞菌對葡萄衰枯病病原菌具有拮抗活性[35]。葡萄黃化植原體病是一種世界性的危害性病害，研究人員分析健康、感病以及恢復后的葡萄中微生物菌群結構時發(fā)現(xiàn)，與健康葡萄相比較，感病以及恢復后葡萄的微生物多樣性降低，且高度相似。甚至有些生防菌株只能在恢復的植株中檢測到[36]，表明葡萄可以調控微生物菌群結構，利用生防菌株增強植物的抗逆性[36]。酸腐病也是一種綜合性病害，能夠造成果穗腐爛，嚴重影響葡萄果實品質。通過分析酸腐葡萄的微生物菌群結構以及體外腐敗試驗，鑒定篩選出導致酸腐病的病原菌主要有細菌和真菌葡萄[37]。其中細菌有克羅諾桿菌（Cronobacter）、粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）和梭狀芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis），真菌有葡萄枯萎病菌[38]，并且篩選出具有拮抗活性的芽孢桿菌[38]。

3.2 生物脅迫下微生物細菌抗逆機理

已有研究表明，接種伯克氏菌、假單胞菌等生防菌株可以增強葡萄抵抗灰霉病的能力。與單獨接種灰霉病原菌的相比，葡萄在接種促生菌株后，可以迅速產生活性氧信號[39]，激活下游防御基因通路，一方面通過提高糖代謝相關基因的轉錄水平維持糖代謝平衡提高抗逆性[15]，另一方面通過調控細胞凋亡相關的HSR基因[18]，提高酚類化合物的產量來增強植株抗氧化能力和抗逆性[16-18]。

此外，葡萄可以通過調節(jié)活性氧平衡途徑提高抗逆性。接種從葡萄根際分離的菌株（Microbacterium imperialRz19M10、Kocuria erythromyxaRt5M10、Terribacillus saccharophilusRt17M10、Bacillus licheniformisRt4M10和Pseudomonas fluorescensRt6M10）后，葡萄葉片中活性氧清除系統(tǒng)中α-蒎烯和橙花醇等萜烯類化合物的含量提高，從而提高葉片抗氧化能力[10]，因此葉片具有更好的光保護特性[40]。

4 未來與展望

隨著人們對生活品質的要求，全球對具有多種活性天然產物的漿果以及加工產品的需求量日益增長，對果實品質和栽培方式的提升越來越受到重視。微生物在提升果實品質和綠色栽培中有重要作用，為新型高效綠色農業(yè)的發(fā)展帶來了新機遇。

葡萄作為種植周期較長的植物，研究環(huán)境微生物和生長之間的關系具有重要的應用前景。目前高通量測序表明，葡萄園風土、葡萄樹齡、砧木種類、品種以及發(fā)育階段影響微生物的群落結構，進而影響葡萄的生長以及次級代謝產物的產量。次級代謝產物對果實品質具有重要的作用[9]，研究表明，益生菌能夠提高果實中次級代謝產物的含量[41]。但是，目前在葡萄中的研究結果僅限于微生物可以提高葉片的次級代謝產物[10,16-18]。在葡萄微生物與果實品質的相關性研究方面，微生物如何對果實品質進行調控卻少有例證。另外，鉀和鈣對葡萄果實品質具有重要的作用，微生物可以調控植物對營養(yǎng)元素的吸收和利用[9]，但利用微生物與葡萄離子平衡相關的研究，尚未見報道。

在葡萄生長過程中，植物病害等生物脅迫因素以及干旱、低溫、重金屬、鹽堿等非生物環(huán)境因素嚴重影響葡萄的質量和產量[5]。植物應對不同的脅迫時，存在反應的特異性和交叉性。微生物通過抑菌活性、活性氧平衡、滲透平衡和誘導系統(tǒng)抗性來提高葡萄抗逆性[5]。目前，在抑菌活性實驗方面止步于篩選出具有活性的菌株[10,35,38,40]，缺少高效天然產物的相關研究。合成生物學的出現(xiàn)和發(fā)展為綠色農業(yè)的發(fā)展帶來了新機遇，因此可以利用合成生物學深入研究活性天然產物的結構以及抑菌機理。通過研究微生物與葡萄的特異性定殖，篩選構建針對葡萄的兼具肥藥功能的專用菌株。

因此，充分開發(fā)和利用微生物的生物學潛力，為促進葡萄生長和品質提升的綠色栽培管理方式提供理論和技術依托，進一步挖掘與果實品質相關的微生物資源有重要意義。