葡萄中微生物細(xì)菌研究進(jìn)展

荊曉姝，蘇玲，張倩倩，湯曉宏，張一帆，管雪強(qiáng)

（1. 山東省葡萄研究院/山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術(shù)創(chuàng)新中心，山東濟(jì)南 250100；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 272018）

植物根際、葉際、果實(shí)周圍以及植物的內(nèi)部環(huán)境，為細(xì)菌提供了良好的生態(tài)位，形成了不同的微生物群組合。植物相關(guān)微生物（表面微生物、根際微生物以及內(nèi)生菌）通過與植物互作而影響植物的生長[1]。在生長過程中，植物和微生物交互作用，使微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[2]，進(jìn)而影響植物的抗性（生物脅迫和非生物脅迫）和次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[3]。微生物對植物的促生機(jī)制分為直接促生作用和間接促生作用，直接促生作用包括影響植物體內(nèi)激素含量[4]，改進(jìn)植物根際營養(yǎng)狀況如促進(jìn)難溶性磷、鉀和微量元素的釋放、聯(lián)合固氮等[5-6]，以及刺激植物產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性[1,7]等；間接促生作用包括產(chǎn)生抑制病原菌以及害蟲的抗生素、抗菌蛋白或鐵載體等次級代謝產(chǎn)物[8]，降解農(nóng)藥等生物外源性物。

葡萄由于種植年限較長，其生長發(fā)育與微生物關(guān)系密切。在生長過程中，葡萄大部分內(nèi)生菌株來源于土壤，并通過根內(nèi)層向地上部遷移。因此，土壤和根際菌群結(jié)構(gòu)決定葡萄地上部分的菌落，影響著果實(shí)的風(fēng)土環(huán)境[9]。此外，植物促生菌能夠通過各種途徑提高植物抵抗生物脅迫或非生物脅迫能力。葡萄接種促生菌株后，體內(nèi)植物激素ABA、SA等含量會增加[7,10-11]。植物激素進(jìn)一步誘導(dǎo)多種防御途徑：（1）滲透調(diào)節(jié)途徑：可以調(diào)節(jié)氣孔開度、糖代謝產(chǎn)物或者萜烯類化合物的產(chǎn)量，減少水分流失，增加抗逆性[10,12-14]；（2）活性氧調(diào)節(jié)途徑：通過活性氧信號調(diào)節(jié)抗氧化防御基因的轉(zhuǎn)錄水平，提高抗逆性[10,15-18]。植物通過以上途徑增強(qiáng)植物在生物脅迫以及非生物脅迫下的抗逆性。在葡萄生長過程中，病害嚴(yán)重影響葡萄的質(zhì)量和產(chǎn)量。拮抗微生物是傳統(tǒng)而重要的生物防治，通過產(chǎn)生抑制病原菌以及害蟲的抗生素、抗菌蛋白或鐵載體等次級代謝產(chǎn)物，減少病原菌的傷害，利用拮抗菌株并挖掘其代謝產(chǎn)物，開發(fā)微生物源農(nóng)藥是當(dāng)今新農(nóng)藥研發(fā)的重要來源之一。綜上所述，研究葡萄相關(guān)微生物對于微生物資源開發(fā)，以及利用微生物實(shí)現(xiàn)葡萄的綠色栽培和果實(shí)的品質(zhì)提升是葡萄產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效的重要路徑。

1 葡萄微生物細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展

現(xiàn)有研究表明，影響葡萄微生物細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的因素有葡萄園風(fēng)土、樹齡、砧木種類、葡萄品種及發(fā)育階段等，其中葡萄園風(fēng)土是由管理方式、葡萄園位置、土壤質(zhì)地、氣候等綜合決定的。

在葡萄園中，土壤、樹皮、葉片和果實(shí)上的細(xì)菌群落大小和結(jié)構(gòu)既有生態(tài)系統(tǒng)特異性，又有交互作用。由于生態(tài)環(huán)境的營養(yǎng)程度不同，細(xì)菌豐度以及多樣性在不同的生態(tài)位中有差異，表現(xiàn)為土壤和樹皮中較高，葉片和果實(shí)稍低[19]。尤其是果實(shí)早期階段，與土壤和樹皮相比較，果實(shí)中細(xì)菌的豐度和多樣性更少。在不同的生態(tài)位中，核心微生物菌群放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria） 均有存在，但是數(shù)量不同[19]。并且，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也具有相似性：土壤和樹皮的群落結(jié)構(gòu)相似，樹葉和果實(shí)的群落結(jié)構(gòu)相似。土壤中的微生物菌群結(jié)構(gòu)與土壤pH以及質(zhì)地相關(guān)[20]，主要為放線菌門、變形菌門（以β-變形菌門為主）。此外，擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門、梭菌門（Clostridia）、厚壁菌門和酸菌門 （Acidobacteria）的豐度有顯著地域差異[19-20]。樹皮中主要是放線菌門、梭菌門和多種變形菌門（α-、ε-、γ-變形菌門）。葉片和漿果中主要是變形菌門，且以α-和γ-變形菌門為主[19]。種群結(jié)構(gòu)分析表明，葡萄果實(shí)表面的核心微生物菌群結(jié)構(gòu)大致相同[21]。從門的水平來講，優(yōu)勢菌門為變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門。從屬的水平上來講，優(yōu)勢菌屬為假單胞菌 （Pseudomonas）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、芽孢桿菌（Bacillus）、短小桿菌（Curtobacterium）、甲基桿菌（Methylobaxterium）[21-23]，這些屬種的細(xì)菌占整個(gè)細(xì)菌總量的1/3[21]。

細(xì)菌在不同的生態(tài)位中具有種屬特異性。在土壤和樹皮中，50%的種屬是土壤和樹皮中特有的，在樹葉和葡萄果實(shí)中不存在。同樣，在果實(shí)和葉片中，50%的種屬果實(shí)和葉片特有，在樹干和土壤中不存在[21]。并且，葉片和果實(shí)的微生物菌群種屬具有豐度差異性。與葉片的菌群相比較，有些菌群在果實(shí)中更容易檢測到[21]。假單胞菌在葉片和果實(shí)中具有絕對優(yōu)勢，是微生物核心群中最豐富的屬之一，因此以假單胞菌為例研究菌群的生態(tài)位特異性。通過序列比對將假單胞菌分為兩類：I類假單胞菌和II類假單胞菌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，果實(shí)中主要是I類假單胞菌，葉片中主要是II類假單胞菌以及少量I類假單胞菌[21]。以上結(jié)果說明，細(xì)菌在不同的生態(tài)位中維持平衡和遷移。

嫁接是葡萄生產(chǎn)中最常見和主要的繁殖方式，因此砧木與葡萄微生物菌落的豐度、多樣性以及種群關(guān)系密切，嫁接的砧木種類決定了根內(nèi)層的微生物群，也決定了地上部分的微生物群[9]。

以‘馬克貝爾’和‘赤霞珠’作為研究對象，分析葡萄園風(fēng)土和葡萄品種對土壤微生物群落多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)葡萄園風(fēng)土對葡萄的微生物組成影響大于葡萄品種[20,24]。但是，在特定的地理位置范圍內(nèi)，葡萄品種在微生物群落中起著重要作用。由于不同葡萄品種的果實(shí)在大小、形狀以及生長特性上具有差異，微生物的生物多樣性以及豐度也不同[24]，因此，可以根據(jù)關(guān)鍵細(xì)菌和真菌類群的豐度區(qū)分葡萄品種。

在相同的葡萄園內(nèi)，與葡萄品種相比較，樹齡對微生物菌群的影響更大[23]。對同一葡萄園內(nèi)不同樹齡的土壤微生物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隨著樹齡的增加，土壤微生物的群落多樣性先逐漸降低，然后再逐漸升高。并且，老齡園的細(xì)菌降幅明顯高于新齡園[25]。長期種植葡萄后，土壤細(xì)菌中變形菌門、擬桿菌門、疣微菌門（Verrucomicrobia）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）的豐度明顯增加，芽單胞菌門、酸桿菌門、放線菌門等的豐度顯著降低[26]。同樣，地上部分葡萄果實(shí)和葉片上的細(xì)菌也呈現(xiàn)相同的趨勢[23,26]。隨著樹齡的增長，葡萄內(nèi)生菌中的變形菌門由26%增加至80%，其中44%屬于α-變形桿菌，36%屬于γ-變形桿菌。而桿菌門（Bacilli）和放線菌門分別由48%和26%降至15%和5%[26]。這些研究均說明樹齡對葡萄微生物菌群結(jié)構(gòu)具有重要影響[23,26]。與多數(shù)耕作土地相同，土壤微生物中變形菌門和擬桿菌門的豐度增加可能更多的與葡萄園的耕作相關(guān)[20,27]。但是，也有研究分析土壤管理方法與微生物菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)菌群結(jié)構(gòu)在果實(shí)中沒有相應(yīng)的動態(tài)變化[28]。

葡萄中微生物群落的演替還受到葡萄發(fā)育階段的影響。在不同的葡萄園中，核心微生物菌群結(jié)構(gòu)與葡萄發(fā)育階段相關(guān)，且葡萄發(fā)育階段對微生物多樣性的影響大于葡萄園風(fēng)土對微生物多樣性的影響。在發(fā)育過程中，菌群的多樣性呈下降趨勢，但保留核心微生物群，并且核心菌群能夠來區(qū)分葡萄的發(fā)育階段。例如，鏈格孢屬 （Alternaria）在坐果期、轉(zhuǎn)色早期以及轉(zhuǎn)色晚期積累，但是在成熟收獲期減少。鞘氨醇單胞菌在葡萄坐果期、轉(zhuǎn)色早期以及轉(zhuǎn)色晚期豐度都很高，并且在轉(zhuǎn)色早期迅速增長[29]。

綜上所述，葡萄園風(fēng)土、砧木種類、種植年限、品種以及果實(shí)發(fā)育過程中葡萄表皮微生物群落呈現(xiàn)動態(tài)變化，但是始終保留核心微生物菌群。探索微生物菌群的變化，有助于提高葡萄園的管理技術(shù)，合理利用葡萄園的生態(tài)功能，減少化學(xué)殺菌劑或農(nóng)藥的使用，保持葡萄園的生態(tài)健康，突出葡萄酒的地域特色[29]。

2 葡萄微生物細(xì)菌對非生物脅迫的研究進(jìn)展

自然界中，植物會受到干旱、低溫、重金屬、鹽堿等不利的非生物環(huán)境因素影響。植物應(yīng)對不同的非生物脅迫時(shí)，存在反應(yīng)的特異性和交叉性。植物體內(nèi)，活性氧在信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[30-31]。在非生物脅迫時(shí)，活性氧作為信號，可以誘導(dǎo)活性氧清除機(jī)制，提高抗氧化防御基因的轉(zhuǎn)錄水平或者增強(qiáng)抗氧化物質(zhì)含量來抵御氧化脅迫。但是，當(dāng)植物不能有效調(diào)節(jié)活性氧的產(chǎn)生與清除之間的平衡時(shí)，造成活性氧積累，引起氧化脅迫[30,32]。另外，植物在非生物脅迫時(shí)還可以通過積累和吸收無機(jī)離子或者增加小分子化合物在體內(nèi)的合成和積累，充當(dāng)胞質(zhì)滲透劑，降低水勢來協(xié)調(diào)細(xì)胞與外界的滲透平衡，增加細(xì)胞的保水能力[33]，來緩解滲透脅迫。植株接種微生物后可以通過活性氧平衡和滲透平衡等生理生化方面的變化來應(yīng)對非生物脅迫[10,12-14,34]。

2.1 低溫脅迫下微生物細(xì)菌增強(qiáng)葡萄抗逆性

伯克氏菌PsJN（Burkholderia phytofirmans，PsJN）是最先從洋蔥中分離得到的一種常見的根際促生菌。在常溫（26 ℃）和低溫（4 ℃）下，接種伯克氏菌PsJN均能不同程度的增加根質(zhì)量和植株生長量[12]。電解質(zhì)滲透率是檢驗(yàn)植物逆境脅迫后細(xì)胞膜透性的參數(shù)，低溫處理后，葡萄葉片的電解質(zhì)滲透率以及脯氨酸含量明顯升高，表明葡萄受到脅迫。但是，接種伯克氏菌PsJN后可以緩解電解質(zhì)滲透率的升高，增強(qiáng)植株抗逆性[12]。葡萄幼苗接種PsJN后，通過提高淀粉、可溶性糖（甘露糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等）等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，從而緩解葡萄幼苗的低溫冷凍脅迫[12-13]。低溫脅迫下，葡萄由于活性氧積累導(dǎo)致葉片膜脂過氧化，致使細(xì)胞死亡。接種伯克氏菌PsJN后，葡萄可以迅速增加活性氧產(chǎn)量，激活下游信號通路，提高逆境防御基因轉(zhuǎn)錄水平[14]。同時(shí)，葡萄還可以通過酚類等刺激代謝產(chǎn)物緩解氧化脅迫，來提高葡萄的抗寒性[12-14]。

2.2 重金屬脅迫下微生物細(xì)菌增強(qiáng)葡萄抗逆性

重金屬脅迫方面，接種根際促生菌能夠提高葡萄的抗逆性。用耐砷菌株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、滕黃微球菌（Micrococcus luteus）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）接種葡萄，研究重金屬污染下根際促生菌對葡萄的影響。在砷處理后，接種微生物的植株中抗壞血酸過氧化物酶（APX）、氧化氫酶（CAT ）、過氧化物酶（POD）多種抗氧化酶的活性能力明顯提高，能夠快速有效的清除活性氧，緩解重金屬引起的氧化脅迫。因此，在砷脅迫處理下，接種促生菌的植株在根質(zhì)量、植株生物量以及蛋白含量方面明顯提高[34]。

2.3 滲透脅迫下微生物細(xì)菌增強(qiáng)葡萄抗逆性

滲透脅迫下，將‘馬爾貝克’幼苗接種細(xì)菌芽孢桿菌Rt4M10和假單孢菌Rt6M10后，葡萄植株高度、根長與葉面積均高于對照組。并且在接種細(xì)菌20、30 d，萜類化合物含量逐漸增加。其中，單萜類化合物α蒎烯、異松油烯、桉樹醇和橙花醇，倍半萜類化合物α-佛手柑烯、α-金合歡烯和金合歡醇均有所增加，并且假單孢菌Rt6M10對萜類化合物的誘導(dǎo)作用明顯高于芽孢桿菌Rt4M10。在接種細(xì)菌30 d后，葉片中的ABA含量增加且失水率明顯低于對照組，說明細(xì)菌可通過誘導(dǎo)萜類等次生代謝產(chǎn)物的生物合成，或者通過提高葉片中ABA的含量來緩解逆境脅迫[10]。

3 葡萄微生物細(xì)菌對生物脅迫的影響研究進(jìn)展

葡萄微生物對生物脅迫主要從兩個(gè)方面來影響：（1）通過調(diào)控微生物菌群中具有拮抗活性的菌株，抑制病原菌，減少病原菌對葡萄的生物脅迫；（2）通過與植物相互作用，刺激植物產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性，促使植物調(diào)節(jié)活性氧平衡和滲透平衡等，增強(qiáng)葡萄的抗逆性，緩解生物脅迫對植物的影響。

3.1 生物脅迫下微生物拮抗細(xì)菌的篩選

通過研究感病葡萄和健康葡萄微生物的群落結(jié)構(gòu)，分析葡萄微生物抵御生物脅迫的機(jī)制，并且從中篩選具有拮抗活性的菌株。葡萄枝干?。℅rapevine trunk diseases，GTDs）是一類主要引起葡萄枝干木質(zhì)部壞死、潰瘍和頂梢枯死，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致整株死亡的真菌性病害的總稱。目前，國際上已經(jīng)報(bào)道了相關(guān)的5種葡萄枝干病害，即葡萄衰枯?。‥scadisease complex）、葡萄黑根?。˙lack foot disease）、葡萄潰瘍?。˙otryosphaeria dieback）、葡萄蔓枯?。―iaporthe dieback）和葡萄頂枯?。‥utypadieback）。研究人員通過分析有枝干病癥狀和健康葡萄的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，假單胞菌在健康葡萄中的豐度更高（56%或74%），而在感病葡萄中僅占 29%或2%。因此，推測假單胞菌具有生物防治GTD病原體的潛力。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，9株假單胞菌對葡萄潰瘍病、3株假單胞菌對頂枯病和2株假單胞菌對葡萄衰枯病病原菌具有拮抗活性[35]。葡萄黃化植原體病是一種世界性的危害性病害，研究人員分析健康、感病以及恢復(fù)后的葡萄中微生物菌群結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，與健康葡萄相比較，感病以及恢復(fù)后葡萄的微生物多樣性降低，且高度相似。甚至有些生防菌株只能在恢復(fù)的植株中檢測到[36]，表明葡萄可以調(diào)控微生物菌群結(jié)構(gòu)，利用生防菌株增強(qiáng)植物的抗逆性[36]。酸腐病也是一種綜合性病害，能夠造成果穗腐爛，嚴(yán)重影響葡萄果實(shí)品質(zhì)。通過分析酸腐葡萄的微生物菌群結(jié)構(gòu)以及體外腐敗試驗(yàn)，鑒定篩選出導(dǎo)致酸腐病的病原菌主要有細(xì)菌和真菌葡萄[37]。其中細(xì)菌有克羅諾桿菌（Cronobacter）、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）和梭狀芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis），真菌有葡萄枯萎病菌[38]，并且篩選出具有拮抗活性的芽孢桿菌[38]。

3.2 生物脅迫下微生物細(xì)菌抗逆機(jī)理

已有研究表明，接種伯克氏菌、假單胞菌等生防菌株可以增強(qiáng)葡萄抵抗灰霉病的能力。與單獨(dú)接種灰霉病原菌的相比，葡萄在接種促生菌株后，可以迅速產(chǎn)生活性氧信號[39]，激活下游防御基因通路，一方面通過提高糖代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平維持糖代謝平衡提高抗逆性[15]，另一方面通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)的HSR基因[18]，提高酚類化合物的產(chǎn)量來增強(qiáng)植株抗氧化能力和抗逆性[16-18]。

此外，葡萄可以通過調(diào)節(jié)活性氧平衡途徑提高抗逆性。接種從葡萄根際分離的菌株（Microbacterium imperialRz19M10、Kocuria erythromyxaRt5M10、Terribacillus saccharophilusRt17M10、Bacillus licheniformisRt4M10和Pseudomonas fluorescensRt6M10）后，葡萄葉片中活性氧清除系統(tǒng)中α-蒎烯和橙花醇等萜烯類化合物的含量提高，從而提高葉片抗氧化能力[10]，因此葉片具有更好的光保護(hù)特性[40]。

4 未來與展望

隨著人們對生活品質(zhì)的要求，全球?qū)哂卸喾N活性天然產(chǎn)物的漿果以及加工產(chǎn)品的需求量日益增長，對果實(shí)品質(zhì)和栽培方式的提升越來越受到重視。微生物在提升果實(shí)品質(zhì)和綠色栽培中有重要作用，為新型高效綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展帶來了新機(jī)遇。

葡萄作為種植周期較長的植物，研究環(huán)境微生物和生長之間的關(guān)系具有重要的應(yīng)用前景。目前高通量測序表明，葡萄園風(fēng)土、葡萄樹齡、砧木種類、品種以及發(fā)育階段影響微生物的群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響葡萄的生長以及次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。次級代謝產(chǎn)物對果實(shí)品質(zhì)具有重要的作用[9]，研究表明，益生菌能夠提高果實(shí)中次級代謝產(chǎn)物的含量[41]。但是，目前在葡萄中的研究結(jié)果僅限于微生物可以提高葉片的次級代謝產(chǎn)物[10,16-18]。在葡萄微生物與果實(shí)品質(zhì)的相關(guān)性研究方面，微生物如何對果實(shí)品質(zhì)進(jìn)行調(diào)控卻少有例證。另外，鉀和鈣對葡萄果實(shí)品質(zhì)具有重要的作用，微生物可以調(diào)控植物對營養(yǎng)元素的吸收和利用[9]，但利用微生物與葡萄離子平衡相關(guān)的研究，尚未見報(bào)道。

在葡萄生長過程中，植物病害等生物脅迫因素以及干旱、低溫、重金屬、鹽堿等非生物環(huán)境因素嚴(yán)重影響葡萄的質(zhì)量和產(chǎn)量[5]。植物應(yīng)對不同的脅迫時(shí)，存在反應(yīng)的特異性和交叉性。微生物通過抑菌活性、活性氧平衡、滲透平衡和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性來提高葡萄抗逆性[5]。目前，在抑菌活性實(shí)驗(yàn)方面止步于篩選出具有活性的菌株[10,35,38,40]，缺少高效天然產(chǎn)物的相關(guān)研究。合成生物學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展為綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展帶來了新機(jī)遇，因此可以利用合成生物學(xué)深入研究活性天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)以及抑菌機(jī)理。通過研究微生物與葡萄的特異性定殖，篩選構(gòu)建針對葡萄的兼具肥藥功能的專用菌株。

因此，充分開發(fā)和利用微生物的生物學(xué)潛力，為促進(jìn)葡萄生長和品質(zhì)提升的綠色栽培管理方式提供理論和技術(shù)依托，進(jìn)一步挖掘與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的微生物資源有重要意義。