食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測方法的探討

張慧珍

（譜尼測試集團(tuán)股份有限公司，北京 100194）

李斯特氏菌屬隸屬革蘭氏陽性細(xì)菌中厚壁菌門，李斯特氏菌屬可劃分為6個(gè)菌種，即單核增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、英諾克李斯特氏菌（L. innocua）、斯氏李斯特氏菌（L. seeligeri）、威爾斯特氏菌（L. welshimeri）、伊氏李斯特菌（L. ivanovii）和格氏李斯特菌（L. grayi）[1]。在這6個(gè)菌種中只有單核增生李斯特和伊氏李斯特氏菌可以引起動物發(fā)病，其中通常只有單核增生李斯特氏菌和人類的李斯特氏菌癥相關(guān)。單核細(xì)胞增生李斯特菌是一種人畜共患病的病原菌，能引起人畜的李氏桿菌病，人畜感染后主要表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥和單細(xì)胞增多，尤以妊娠期婦女，新生兒及免疫功能低下的病人更易感染。因此，李斯特氏菌中最具檢測意義的是單核增生李斯特氏菌。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌廣泛分布于自然界，如土壤、屠宰場、食品生產(chǎn)加工器具和多種食品中，動物或人體也帶有此菌。食品中存在的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌對人類的身體健康極具危害，該菌在 4 ℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。

當(dāng)前對單核細(xì)胞增生李斯特氏的檢測方法主要有傳統(tǒng)檢測方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）[2]、以聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)等[3-4]。隨著科技不斷發(fā)展，針對食源性致病菌的檢測技術(shù)也越來越多，新興的檢測方法具有檢測周期短、成本高等特點(diǎn)，而大多數(shù)食品生產(chǎn)、食品流通企業(yè)仍會選擇低成本的傳統(tǒng)的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。想要得到精準(zhǔn)的檢測結(jié)果，新興的檢測方法依賴于試驗(yàn)設(shè)備，而傳統(tǒng)的檢測方法更依賴于人員的經(jīng)驗(yàn)，因此采用傳統(tǒng)的方法檢測單增李斯特氏菌對試驗(yàn)員提出了更高的要求。

1 目的和意義

本文主要從試劑準(zhǔn)備、增菌、劃線分離及生化鑒定等方面闡述了對單核細(xì)胞增生李斯特檢測的一些理解，以期為檢測人員依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.30—2016）進(jìn)行食品中單增李斯特氏菌檢測提供參考，減少人為因素造成的漏判或漏檢。

2 國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法GB 4789.30—2016的探討

食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測需進(jìn)行増菌、分離、初篩和鑒定4個(gè)連續(xù)過程。

2.1 增菌

食品經(jīng)常同時(shí)受到多種致病菌污染，為提高對應(yīng)致病菌的檢出率，樣品檢測前需先進(jìn)行抑菌和增菌過程。例如，將檢驗(yàn)樣品25 g（mL）加入到含有 225 mL LB1增菌液中，均質(zhì)，（30±1）℃培養(yǎng)24 h，移取0.1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL LB2增菌液內(nèi)，于（30±1）℃培養(yǎng)18～24 h。此過程中，增菌液中的萘啶酮酸和吖啶黃通過抑制細(xì)菌脫氧核苷酸的合成機(jī)理對革蘭氏陰性菌和鏈球菌起到了抑制作用，同時(shí)由于單增李斯特具有耐冷特性，通過低溫培養(yǎng)使其快速繁殖生長，便于檢出[5]。在進(jìn)行增菌操作步驟時(shí)，應(yīng)該注意以下問題。

（1）在配制LB1、LB2基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)先將李氏增菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基按照配制比例加熱溶解，再進(jìn)行高溫高壓滅菌，以防培養(yǎng)基受熱不均勻，破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分。

（2）配制好的LB1、LB2使用前再按要求量加入萘啶酮酸和吖啶黃素。萘啶酮酸對光較敏感，因此要注意避光保存且LB1、LB2最好現(xiàn)用現(xiàn)添加。吖啶黃素有一定的致癌性，在使用過程中要注意打開安瓿瓶時(shí)動作要輕柔，必要時(shí)可以用砂輪多摩擦幾次瓶頸處，然后再輕輕掰開，以免液體濺出接觸到試驗(yàn)人員。

（3）從培養(yǎng)后的LB1中移取0.1 mL轉(zhuǎn)接到10 mL LB2中，因轉(zhuǎn)接量較小、增菌液不均等原因，容易造成漏檢，應(yīng)先將LB1充分混合均勻。在混勻過程中，避免產(chǎn)生大量對人體有害的氣溶膠，通過眼鼻黏膜或者吸入方式感染試驗(yàn)人員或污染環(huán)境，在整個(gè)檢測過程中應(yīng)嚴(yán)格注意無菌操作、動作輕柔及生物安全，并做好人員防護(hù)。

2.2 分離

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)方法，為從增菌液中分離出獨(dú)立的目標(biāo)菌，取LB2二次增菌液劃線接種于PALCAM瓊脂平板和李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上，于（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h，觀察各個(gè)平板上生長的菌落。典型菌落在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。典型菌落在柯瑪嘉顯示培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍(lán)色菌落，有白色暈環(huán)。

李斯特顯色培養(yǎng)基增補(bǔ)劑的添加及注意事項(xiàng)有以下幾點(diǎn)。①增補(bǔ)劑需在基礎(chǔ)培養(yǎng)基滅菌后，倒平皿前根據(jù)每次基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制量添加，在添加前無滅菌過程，所以在稱取及配制過程中一定要非常注意無菌操作，以免造成增補(bǔ)劑的污染，致使培養(yǎng)基的大量浪費(fèi)，稱取后嚴(yán)格按照無菌要求密封增補(bǔ)劑以便后期使用。②單增李斯特和其他的李斯特菌有相似的生長特性，它們在傳統(tǒng)的培養(yǎng)基上不易被區(qū)分，而李斯特顯色培養(yǎng)基上可以通過白色暈環(huán)來區(qū)分，因此白色暈環(huán)對于區(qū)分單增李斯特和其他李斯特菌具有指導(dǎo)意義。但有時(shí)單增李斯特在李顯培養(yǎng)基上無白色暈環(huán)，通過陽性菌對照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)如果增補(bǔ)劑不夠均勻或配制好的平皿保存不當(dāng)均可能出現(xiàn)無白色暈環(huán)問題。所以增補(bǔ)劑在配制過程中一定要攪拌均勻，使其完全溶解，最終成為奶油狀的均質(zhì)溶液，避免在顯色培養(yǎng)基中出現(xiàn)很多絮狀凝塊，造成應(yīng)有的白色暈環(huán)不明顯，甚至不出現(xiàn)，故在試驗(yàn)過程中采用陽性對照菌株驗(yàn)證培養(yǎng)基尤為 重要。

2.3 初篩

自選擇性瓊脂平板上分別挑取5個(gè)以上典型或可疑菌落，分別接種在木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h；同時(shí)在TSA-YE平板上劃線純化，于（30±1）℃培養(yǎng)24～48 h。選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。關(guān)于初篩過程選菌問題有以下幾點(diǎn)建議。

（1）從不同角度觀察平皿上的菌落。因GB 4789.30— 2016中規(guī)定選擇兩種選擇性培養(yǎng)基，在大量的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，李斯特顯色培養(yǎng)基的區(qū)分度很高，首先選擇在李顯上呈現(xiàn)藍(lán)色菌落，帶白色暈圈的菌做初篩，這樣可減少部分試驗(yàn)室工作。在選菌時(shí)，一定注意要從不同角度觀察平皿上的菌落，避免因?yàn)楣饩€角度或者菌落生長狀態(tài)問題，而未發(fā)現(xiàn)帶有白色暈圈的菌落。同時(shí)李顯的培養(yǎng)時(shí)間也很重要，有些菌株在培養(yǎng)24 h時(shí)呈現(xiàn)藍(lán)色菌落，但無白色暈圈，隨著培養(yǎng)時(shí)間的加長，白色暈圈才會出現(xiàn)，48 h時(shí)會很明顯。因此，李斯特顯色培養(yǎng)基需培養(yǎng)24～48 h。若培養(yǎng)48 h后李顯培養(yǎng)基上無帶暈圈菌落，則再從PALCAM培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。

（2）選擇較大菌落。初次篩選從一個(gè)菌落上既接生化，又進(jìn)行劃線純化確實(shí)存在困難，初篩最好選擇較大菌落?？紤]到單增李斯特氏菌菌體較小，培養(yǎng)24～48 h后可達(dá)到1～2 mm，建議先將可疑菌落做平板劃線純化，然后再進(jìn)行生化鑒定。為節(jié)約檢測時(shí)間，李顯培養(yǎng)基上的典型菌落可將純化平皿和其他鑒定試驗(yàn)一起進(jìn)行。

2.4 鑒定

在單增李斯特氏菌國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法中鑒定包括鏡檢、動力試驗(yàn)、生化鑒定、溶血試驗(yàn)和協(xié)同溶血試驗(yàn)。這些鑒定方式在單增檢測中溶血試驗(yàn)和協(xié)調(diào)溶血試驗(yàn)既是關(guān)鍵試驗(yàn)也是難點(diǎn)。

（1）鏡檢、生化試驗(yàn)。一般無論是PALCAM還是李斯特顯色培養(yǎng)基出現(xiàn)可疑菌落，鏡檢時(shí)菌體大都符合李斯特菌特點(diǎn)，李斯特氏菌呈小的、類似球形的革蘭氏陽性桿菌，呈短鏈，在營養(yǎng)不良培養(yǎng)基中可形成絲狀[6]。若在PALCAM或李斯特顯色培養(yǎng)基上未呈現(xiàn)可疑菌落，不能進(jìn)行初篩，一般可進(jìn)一步通過生化試驗(yàn)，如過氧化氫酶試驗(yàn)、MR-VP試驗(yàn)等，進(jìn)行排除。若菌落呈陽性反應(yīng)，則為李斯特 氏菌。

（2）溶血試驗(yàn)。將羊血瓊脂平板底面劃分為20～25個(gè)小格，挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落刺種到血平板上，每格刺種一個(gè)菌落，并刺種陽性對照菌(單增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和陰性對照菌(英諾克李斯特氏菌)，穿刺時(shí)盡量接近底部，但不要觸到底面，同時(shí)避免瓊脂破裂，（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h，于明亮處觀察，單增李斯特氏菌呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的溶血圈，斯氏李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周圍產(chǎn)生弱的透明溶血圈，英諾克李斯特氏菌無溶血圈，伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的β-溶血區(qū)域。若結(jié)果不明顯，可置于 4 ℃冰箱24～48 h后再觀察。在實(shí)際工作中，由于單增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌產(chǎn)生的狹小的β溶血環(huán)很難觀察，經(jīng)大量穿刺不同厚度的血平板試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在瓊脂厚度1～1.5 mm的血平板上穿刺更有利于觀察溶血現(xiàn)象，且僅需培養(yǎng)24 h。通過調(diào)整血平板厚度，極大方便了試驗(yàn)員的觀察。血平板中培養(yǎng)基較薄，穿刺時(shí)會觸及底面，但這并不影響觀察狹小的β溶血，因?yàn)槿艟w無溶血，被接種針穿透處會被菌體填滿，狹小的β溶血會在原穿透位置四周部分溶血，而伊氏李斯特氏菌則會出現(xiàn)較大的溶血環(huán)。

（3）協(xié)同溶血試驗(yàn)。此試驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)是金黃色葡萄球菌的菌株類型，并不是所有金黃色葡萄球菌都能參與此試驗(yàn)。GB 4789.30—2016中明確規(guī)定所用金黃色葡萄球菌菌株編號為ATCC 25923，試驗(yàn)嘗試用ATCC 6538代替ATCC 25923，最終沒有出現(xiàn)協(xié)同溶血現(xiàn)象。另外，協(xié)同溶血試驗(yàn)所用菌株，最好選用相應(yīng)選擇性平板上的單個(gè)菌落，不要選擇新鮮培養(yǎng)的菌懸液，這樣既能保證菌株未被污染，也能防止菌懸液非肉眼可見的散落對試驗(yàn)現(xiàn)象的干擾。在此協(xié)同溶血試驗(yàn)中，對于血平板的薄厚要求不高，血平板略薄，培養(yǎng)不足24 h即可觀察到協(xié)同溶血 現(xiàn)象。

（4）溶血試驗(yàn)。溶血試驗(yàn)中血液一定要新鮮，尤其是單增李斯特菌的狹小的β溶血試驗(yàn)，如果血液不新鮮，觀察不到狹小的β溶血，容易造成誤判斷。建議血平板現(xiàn)配現(xiàn)用，并且最好不要放入電熱恒溫培養(yǎng)箱中除水汽，這樣對紅血球有一定的破壞性，致使后續(xù)溶血試驗(yàn)現(xiàn)象不能出現(xiàn)應(yīng)有的試驗(yàn)現(xiàn)象，觀察結(jié)果出現(xiàn)偏差，造成錯判或者漏判。

（5）動力試驗(yàn)。穿刺半固體或者SIM動力培養(yǎng)基，培養(yǎng)基容器應(yīng)為小的玻璃試管，培養(yǎng)基的量應(yīng)在試管1/3處較合適，培養(yǎng)基試驗(yàn)前最好放入培養(yǎng)箱適當(dāng)去除水分，以免接種時(shí)有水汽，影響試驗(yàn)現(xiàn)象的觀察。穿刺時(shí)所用接種針要比較平直，穿刺過程中手部動作要保持平穩(wěn)，不要出現(xiàn)抖動，可以在穿刺時(shí)將接種針的接種桿貼著試管壁，以保證穿刺的 平穩(wěn)。

2.5 結(jié)果報(bào)告

結(jié)合生化試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告25 g（mL）樣品中檢出或未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。

3 結(jié)語

本文均是對GB 4789.30—2016檢測方法的一些理解和日常檢測經(jīng)驗(yàn)的概述，旨在通過對每個(gè)檢測步驟關(guān)鍵點(diǎn)的分析，避免人為因素引起的錯判和漏判。同時(shí)，希望能夠給試驗(yàn)人員提供比較詳細(xì)的檢測經(jīng)驗(yàn)，以便更高效地判斷試驗(yàn)現(xiàn)象與試驗(yàn)結(jié)果，保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。