轉(zhuǎn)基因玉米培育及其檢測技術(shù)應(yīng)用研究

李 晶 尹祥佳 王雅琳

（蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

玉米是全球及我國第一大糧食作物，也是草食畜牧業(yè)和飼料行業(yè)的重要作物，其作為雜種優(yōu)勢研究和應(yīng)用非常廣泛，對穩(wěn)定我國糧食生產(chǎn)安全，調(diào)整農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)，增加農(nóng)民收入等都具有重要的貢獻(xiàn)。根據(jù)國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，我國2020 年玉米播種面積為 4126.4 萬hm2，玉米產(chǎn)量約2.6 億t。預(yù)計到2030 年，我國玉米生產(chǎn)的需求量將達(dá)到3.03 億t[1-2]。為保障玉米種植業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展，需要加大玉米新種質(zhì)的選育，常規(guī)的玉米品種選育是通過選擇育種、雜交育種、回交選育、誘變育種、群體改良等育種方法的集成育種，但選育周期較長，材料自主創(chuàng)新難度較大，再加上玉米種子品種的市場化程度較高，為了獲取更多的效益，往往導(dǎo)致玉米種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)狹窄，市場上的品種同質(zhì)化趨勢加大，都會對玉米的生產(chǎn)帶來一定的難度。隨著基因工程技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為代表的生物技術(shù)在玉米品種選育過程中的應(yīng)用作用日益凸顯，尤其是通過育種設(shè)計，將生物技術(shù)育種與常規(guī)育種技術(shù)的結(jié)合，成為了重要的玉米新品種選育途徑。

1 玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)也稱之為基因工程技術(shù)，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛，包括玉米轉(zhuǎn)基因研發(fā)在內(nèi)的糧食作物品種的選育和改良成為了重要的農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)方向。1983 年世界上首次報道了轉(zhuǎn)基因煙草的研發(fā)成功，帶動了我國轉(zhuǎn)基因作物育種。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用加速玉米種質(zhì)資源的創(chuàng)新，在玉米種質(zhì)改良過程中發(fā)揮著重要的作用[3]。1986 年我國啟動了國家高技術(shù)研究發(fā)展規(guī)劃，也就是“863”計劃，將轉(zhuǎn)基因植物在內(nèi)的生物技術(shù)研發(fā)作為重點支持研究領(lǐng)域，隨著研究的深入開展和積累，我國培育了自主知識產(chǎn)權(quán)的抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花，并投入商業(yè)化生產(chǎn)。此外，國家重大基礎(chǔ)研究計劃（“973”計劃）也將轉(zhuǎn)基因育種列為重要的支持研究領(lǐng)域，特別是2008 年我國開始實施的轉(zhuǎn)基因生物新品種培育國家科技重大專項，有效實現(xiàn)了包括玉米在內(nèi)的五大作物的轉(zhuǎn)基因育種和常規(guī)育種的深度結(jié)合，研發(fā)出了一批重要的新品種和新材料。由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所和北京奧瑞金公司聯(lián)合研發(fā)并于2009 年獲得了原農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米自交系的安全證書，成為了我國轉(zhuǎn)基因玉米研究的重要創(chuàng)始之作[4]，2015 年轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米再次獲得安全證書。2019 年北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司的DBN9936 和杭州瑞豐生物科技有限公司的雙抗12-5 獲得安全證書。2020 年北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司研發(fā)的耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技教育司頒發(fā)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因安全證書，有效期為5 年。2021 年中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家玉米改良中心培育的抗蟲玉米ND207 獲得生物安全證書，杭州瑞豐研發(fā)的浙大瑞豐8 抗蟲和耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米、北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司研發(fā)的DBN3601T 雙價抗蟲和耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米獲得轉(zhuǎn)基因玉米安全證書。2022 年杭州瑞豐耐除草劑玉米和中國種子集團(tuán)有限公司的3 個轉(zhuǎn)基因玉米獲得轉(zhuǎn)基因安全證書。轉(zhuǎn)基因玉米研發(fā)的常用轉(zhuǎn)基因技術(shù)有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法和花粉管通道法。

1.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法農(nóng)桿菌是自然界存在的，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法是最常用，也是最有效的玉米轉(zhuǎn)化方法。在試驗操作層面是將待轉(zhuǎn)化的外源目的基因整合到經(jīng)過改造的遺傳轉(zhuǎn)化的T-DNA 區(qū)，借助農(nóng)桿菌侵染植物的細(xì)胞，實現(xiàn)外源基因與植物基因組的轉(zhuǎn)移與融合[5]，再利用植物組織培養(yǎng)再生體系，培育出轉(zhuǎn)化再生的植物植株，再進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的檢測確定以及后代轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定性分子和植物生理學(xué)鑒定，得到穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。謝超等[6]采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法將提高玉米籽粒類胡蘿卜素基因chyb基因和耐草甘膦bar基因轉(zhuǎn)入玉米品種7922 中，獲得品質(zhì)改良和抗除草劑的玉米育種材料。王陽等[7]對抗蟲基因cry1Ab進(jìn)行改造后獲得新的基因cryFLIa，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化HiII 玉米幼胚，通過轉(zhuǎn)基因檢測抗性和轉(zhuǎn)化后代的抗病鑒定試驗得到了抗亞洲玉米螟的玉米材料。農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)化方法主要的轉(zhuǎn)化受體為玉米幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織、玉米幼胚、玉米黃化苗的莖尖，農(nóng)桿菌的菌株主要有EHA105、C58 和LBA4404。

1.2 基因槍法基因槍法是一種物理的轉(zhuǎn)化方法，又稱為粒子槍法，是采用高速的金屬微粒表面的外源DNA 分子隨機整合到植物受體細(xì)胞中[8]。李志亮等[9]選用玉米自交系京501 誘導(dǎo)的愈傷組織，采用基因槍法轉(zhuǎn)化P5C5基因獲得轉(zhuǎn)基因材料，并進(jìn)行了抗旱性鑒定，結(jié)果顯示P5C5基因能夠在干旱脅迫下通過基因的表達(dá)提高脯氨酸含量、降低丙二醛含量來提高轉(zhuǎn)基因玉米的抗旱性。韓平安等[10]用基因槍對玉米自交系A(chǔ)188 誘導(dǎo)的幼胚愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化cp4EPSPS基因，獲得抗草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米材料?；驑尫ㄞD(zhuǎn)化玉米的主要受體材料有幼胚、愈傷組織和莖端分生組織[11]。

1.3 花粉管通道法花粉管通道法最早應(yīng)用在煙草的轉(zhuǎn)化當(dāng)中，我國學(xué)者周光宇于20 世紀(jì)80 年代創(chuàng)立了花粉管通道轉(zhuǎn)化技術(shù)，主要是采集植物花粉進(jìn)行處理，然后利用天然花粉管通道將外源DNA 目的基因攜帶進(jìn)入胚囊實現(xiàn)外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化[12]。韓猛等[13]選用玉米自交系京24，將BADH基因通過花粉管通道法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并對T2轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了耐鹽性生理指標(biāo)的鑒定，得到了耐鹽性自交系材料。陳麗娟等[14]選用玉米自交系京517、京501 和吉444，構(gòu)建了bar基因為篩選標(biāo)記基因和CspB為目的基因的雙價植物表達(dá)載體，通過花粉管通道法實現(xiàn)了轉(zhuǎn)化受體材料的耐旱性和耐除草劑等性狀改良?；ǚ酃芡ǖ婪ㄒ蚴艿酵饨绛h(huán)境的影響較大，所以最好選擇晴天進(jìn)行試驗，這樣可以減少花粉質(zhì)量對轉(zhuǎn)化效率的負(fù)面影響。除此之外，外源DNA 片段的大小、濃度、純度，田間導(dǎo)入量和導(dǎo)入時間也是影響轉(zhuǎn)化效率的因素。近些年，采用超聲波輔助花粉介導(dǎo)的方法能夠有效提高轉(zhuǎn)化效率，不受實驗室植物組織培養(yǎng)的限制。

2 轉(zhuǎn)基因玉米培育

目前，轉(zhuǎn)基因玉米培育的目標(biāo)性狀主要是在抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米、耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米、耐干旱和品質(zhì)改良轉(zhuǎn)基因玉米等方面[15]。

2.1 抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米在玉米種植過程中，蟲害導(dǎo)致的玉米減產(chǎn)較為普遍，主要為棉鈴蟲、亞洲玉米螟和黏蟲的危害。為了減少化學(xué)防治帶來的環(huán)境問題，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米品種，保障玉米生產(chǎn)安全是一項重要的路徑[16]。陳沼汀等[17]選用玉米自交系H99 幼胚為轉(zhuǎn)化試驗材料，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將抗蟲基因cry1Ab13導(dǎo)入到玉米基因組中，通過分子檢測和田間抗蟲鑒定，對玉米螟的抗性顯著提高。王建軍等[18]以鄭58 和昌7-2 玉米自交系為試驗材料，用花粉介導(dǎo)法將cry1Ac基因?qū)胗衩谆蚪M中，然后進(jìn)行多代 PCR 檢測和Southern雜交分析，獲得純合的轉(zhuǎn)基因株系。在抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米培育過程中，抗蟲的評價試驗是非常重要的環(huán)節(jié)，尤其是轉(zhuǎn)Bt玉米對于玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲有一定的抗性，能夠抑制黏蟲生長發(fā)育[19]。同時還要根據(jù)不同玉米種植區(qū)害蟲發(fā)生情況實行分區(qū)域布局，研究進(jìn)行管控的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米種植應(yīng)對策略[20]。

2.2 耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米玉米在種植生產(chǎn)過程中與各種田間雜草爭奪水分和營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致其生長過程中的營養(yǎng)成分積累和產(chǎn)量受到抑制，因此，作為一種廣譜內(nèi)吸傳導(dǎo)性除草劑，草甘膦是目前使用量最大的除草劑品種之一，而耐除草劑草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米研究和應(yīng)用是重要的轉(zhuǎn)基因玉米材料培育的方向[21]。耐草甘膦基因通常作為表達(dá)載體構(gòu)建中的篩選標(biāo)記基因，與其他目的基因同時實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，能夠獲得復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因玉米材料。余桂容等[22]以玉米自交系18599 和綜31 幼胚為轉(zhuǎn)化受體，通過篩選、檢測，獲得了耐除草劑和抗蟲的雙抗玉米親本育種材料。劉苗苗等[23]選用玉米Hi-Ⅱ為轉(zhuǎn)化受體材料，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將耐草甘膦基因G10ev導(dǎo)入受體材料基因組中并進(jìn)行了抗性鑒定，培育出了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的耐草甘膦玉米轉(zhuǎn)化系A(chǔ)G16。

2.3 耐旱轉(zhuǎn)基因玉米由于水資源的短缺，加之農(nóng)業(yè)灌溉用水條件的不同，旱作農(nóng)業(yè)的發(fā)展急需耐旱轉(zhuǎn)基因玉米品種的培育。相關(guān)研究表明，干旱每年導(dǎo)致作物減產(chǎn)達(dá)50%以上，隨著我國耐旱轉(zhuǎn)基因玉米的研究發(fā)展，耐旱基因主要分為轉(zhuǎn)錄因子、酶類和其他抗旱相關(guān)蛋白基因[24]。鄭成忠等[25]以T4轉(zhuǎn)BADH基因玉米自交系丹988 為材料，經(jīng)過加代對T5和T6轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行基因表達(dá)穩(wěn)定性、生理生化指標(biāo)測定、田間耐旱性分析，培育了耐旱玉米新種質(zhì)資源。冷益豐等[26]研究了轉(zhuǎn)入抗旱基因TsDREB2A、CBF4和PIS的13 份玉米自交系種子材料的萌發(fā)期抗旱性。因此，耐旱基因的挖掘以及轉(zhuǎn)化玉米材料評價是培育耐旱玉米品種的有效途徑。

除此之外，品質(zhì)改良轉(zhuǎn)基因玉米品種主要與抗蟲、耐除草劑的多基因聚合轉(zhuǎn)化，獲取復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因玉米新材料。鄒俊杰等[27]研究了含有Cry3Bb、Cry1Ab、cp4epsps、ZmTMT和ZmHPT5個基因聚合的轉(zhuǎn)基因材料，具有抗蟲、耐除草劑和提高維生素E 含量等性狀的遺傳穩(wěn)定性表達(dá)。將多基因聚合轉(zhuǎn)化和常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，培育多種符合性狀的轉(zhuǎn)基因玉米材料具有重要的研究價值和廣泛的應(yīng)用前景。

3 轉(zhuǎn)基因玉米檢測技術(shù)

轉(zhuǎn)基因玉米檢測技術(shù)主要有兩類，一是以核酸為檢測對象的PCR 法，包含普通PCR 檢測、多重PCR 檢測和實時熒光定量PCR 檢測；二是以蛋白質(zhì)為檢測對象的檢測法，常用的有試紙條轉(zhuǎn)基因檢測。核酸檢測方法是應(yīng)用PCR 技術(shù)開展轉(zhuǎn)基因玉米成分的檢測方法。陽麗等[28]根據(jù)常見的玉米內(nèi)源基因CaMV35S啟動子和NOS終止子，轉(zhuǎn)化的外源目的基因設(shè)計檢測引物，通過優(yōu)化檢測體系，建立PCR 初步的篩選檢測方法。尹全等[29]研究了轉(zhuǎn)基因玉米篩查的多重PCR 檢測方法，構(gòu)建了進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米基因元件P-CaMV35S、P-ract1、T-NOS、pat、bar和PMI等元件的組合篩選檢測體系，對我國進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行快速和有效的檢測。袁磊等[30]設(shè)計特異性引物和Taqman 探針，通過實時熒光PCR 技術(shù)建立玉米MON88017 特異性檢測方法，檢測結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確性都比較高，可以滿足國際上關(guān)于轉(zhuǎn)基因的1%檢測底限要求。作為蛋白質(zhì)檢測方法的試紙條分為樣品墊、襯板、吸收墊、結(jié)合墊、NC 膜、檢測帶和控制帶，已經(jīng)成為了商品化的試紙。檢測時將樣品研磨，溶解后獲取蛋白質(zhì)溶液，再用試紙檢測讀取結(jié)果，轉(zhuǎn)基因檢測試紙在玉米轉(zhuǎn)基因檢測中應(yīng)用非常方便，能夠顯著提高檢測效率。