卷丹百合遠緣雜交及雜種后代的鑒定

舒珂，李建紅，陳璐，傅海燕，蔡維，劉李晨，李玉帆,4*

卷丹百合遠緣雜交及雜種后代的鑒定

舒珂1,2，李建紅3，陳璐1,4，傅海燕1，蔡維1，劉李晨1，李玉帆1,2,4*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，湖南 長沙 410128；2.湖南省中亞熱帶優(yōu)質(zhì)花木繁育與利用工程研究中心，湖南 長沙 410128；3.江西省崇義縣林業(yè)局陽明山省級自然保護區(qū)管理站，江西 崇義 341300；4.園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育教育部工程研究中心，湖南 長沙 410128)

為培育抗性強、觀賞性優(yōu)良的卷丹百合新種質(zhì)，采用液體培養(yǎng)基懸滴法測定3個觀賞百合品種‘Black stone’‘Tresor’‘Sorbonne’ 的花粉生活力；用蕾期授粉、正常授粉、延遲授粉、切割柱頭授粉方式分別與母本卷丹百合進行雜交，對獲得的雜交后代進行胚珠培養(yǎng)及增殖擴繁，采用SSR分子標記的方法鑒定雜種的真實性。結(jié)果表明：‘Sorbonne’的花粉萌發(fā)率總體高于‘Black stone’和‘Tresor’；蕾期授粉的結(jié)實率最高，為14.44%；卷丹בBlack stone’ 組合獲得蒴果數(shù)量最多，共得到了17個蒴果；對雜交蒴果進行胚珠培養(yǎng)，得到9株F1代雜種苗；篩選雜種苗增殖擴繁的較適培養(yǎng)基為MS+30 g/L蔗糖+0. 1 mg/L NAA+1 mg/L 6–BA+8 g/L瓊脂；鱗莖膨大生根較適培養(yǎng)基為MS+80 g/L蔗糖+0.1 mg/L NAA+ 0. 05 mg/L 6–BA+0.75 g/L活性炭+6.5 g/L瓊脂，最適培養(yǎng)環(huán)境為黑暗培養(yǎng)；通過4對引物鑒定證實卷丹בTresor’的2個雜種株系為真實雜種。

卷丹百合；遠緣雜交；胚珠培養(yǎng)；增殖培養(yǎng)；微衛(wèi)星分子標記

卷丹百合(Thunb.)別名虎皮百合、宜興百合、天蓋百合，廣泛分布于江蘇、浙江、安徽、江西、湖南、湖北等地[1]，兼具藥用、食用和觀賞多種功能[2]，具有較高的開發(fā)價值。

卷丹百合作為一種原生百合，對土傳病害枯萎病的抗性極弱，從而造成嚴重的連作障礙，面臨品種退化、品質(zhì)下降等問題[3]。而大部分觀賞百合栽培品種尤其是亞洲百合雜種系品種的抗性都較強，對尖孢鐮刀菌引起的枯萎病的抗性極強[4]。百合種間的遠緣雜交有受精前障礙和受精后胚的發(fā)育不良等障礙[5]?？朔芫罢系K主要采用切割柱頭、花粉蒙導、化學處理、柱頭嫁接等方法；受精后障礙主要通過胚拯救來克服。羅建讓等[6]、樊金平等[7]以卷丹百合為親本，與野百合、宜昌百合和東北百合進行雜交育種，未能獲得有胚種子；雷家軍等[8]以野生百合及亞洲百合為父本，采用5種授粉方法與卷丹百合雜交，篩選卷丹百合雜交種后代胚珠培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方，獲得卷丹雜交后代，但并沒有進行雜種后代的培育及鑒定。筆者采用蕾期授粉、正常授粉、延遲授粉、切割柱頭授粉等4種授粉方法，將食用卷丹百合與‘Black stone’ ‘Tresor’ ‘Sorbonne’這3種抗性強、觀賞性狀優(yōu)良的亞洲百合雜種系及東方百合雜種系品種進行雜交，篩選適于克服卷丹百合遠緣雜交障礙的方法，建立雜種后代增殖擴繁培育體系，以期為培育觀賞兼食用百合新品種提供支持及材料。

1　材料與方法

1.1　材料

供試百合母本為卷丹百合，父本分別為 ‘Black stone’ ‘Tresor’‘Sorbonne’，如圖1所示。供試親本與雜種后代均種植于湖南農(nóng)業(yè)大學花卉基地。

1　卷丹百合；2　‘Black stone’；3　‘Tresor’；4　‘Sorbonne’。

1.2　方法

1.2.1百合父本花粉生活力測定及雜交授粉方式的選擇

采用三因素三水平正交試驗設(shè)計，配制了9組百合花粉萌發(fā)液體培養(yǎng)基[9]，其配方列于表1，運用液體培養(yǎng)基懸滴法檢測百合父本花粉的萌發(fā)情況，計算花粉萌發(fā)率。

表1　百合花粉萌發(fā)液體培養(yǎng)基配方

采用蕾期授粉(開花前2～3 d，花蕾顯色期)、正常授粉(開花1～2 d)、延遲授粉(開花后4～5 d，花瓣萎蔫狀態(tài))和切割柱頭授粉(開花1～2 d)4種方式，每個組合、每種處理各雜交30朵。為避免自交的影響，對蕾期百合花朵去雄后套袋，雜交前取袋，授粉完成后再次套袋。

1.2.2百合雜種苗增殖與膨大生根培養(yǎng)基的篩選

授粉2個月后，摘取成熟膨大蒴果洗凈，依次用75%乙醇和 2%次氯酸鈉消毒，取胚珠，置于培養(yǎng)基上培養(yǎng)。胚珠培養(yǎng)基為MS+30 g/L蔗糖+0.01 mg/L NAA+6.5 g/L瓊脂，pH 5.7。以培養(yǎng)基MS+30 g/L蔗糖+1 mg/L 6–BA+8 g/L瓊脂，pH 5.8為基礎(chǔ)，分別添加0.01、0.10、0.50 mg/L的NAA，培養(yǎng)卷丹בTresor’雜種苗的外層鱗片。每個處理接種10瓶，每瓶接種5個小鱗莖，重復3次。每周觀察統(tǒng)計出芽情況，為期90 d。

將增殖的百合不定芽接種到鱗莖膨大生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，以不同質(zhì)量濃度的6–BA和是否加活性炭篩選較適培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基配方接種10瓶，每瓶接種4個百合不定芽，30 d后統(tǒng)計觀察小鱗莖的直徑及生根情況。

配方1：MS+80 g/L蔗糖+0.1 mg/L NAA+ 0. 05 mg/L 6–BA+0.75 g/L活性炭+6.5 g/L瓊脂，pH=5.8。

配方2：MS+80 g/L蔗糖+0.1 mg/L NAA +0. 1 mg/L 6–BA +0.75 g/L活性炭+6.5 g/L瓊脂，pH=5.8。

配方3：MS+80 g/L蔗糖+0.1 mg/L NAA +0. 2 mg/L 6–BA +0.75 g/L活性炭+6.5 g/L瓊脂，pH=5.8。

配方4：MS+80 g/L蔗糖+0.1 mg/L NAA + 0. 2 mg/L 6–BA +6.5 g/L瓊脂，pH=5.8。

將雜種苗置于較適鱗莖膨大生根培養(yǎng)基，分別置于光照和黑暗環(huán)境培養(yǎng)，40 d后觀察雜種苗鱗莖膨大生根情況。

1.2.3百合雜種苗的鑒定

取卷丹בTresor’的2個雜種株系、卷丹和‘Tresor’的幼嫩無病蟲害的新鮮葉片提取DNA(北京聚合美生物科技有限公司M5 Hiper Plus多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒)，采用紫外分光光度計測定DNA濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，凝膠成像分析系統(tǒng)檢測電泳條帶。利用前期開發(fā)的23對百合SSR引物對親本進行多態(tài)性分析，篩選出擴增條帶清晰不拖帶、多態(tài)性較好的引物。

采用25 μL反應體系：DNA模板(50 ng/μL)1 μL，2×RapidMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，無菌水9.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，56～63 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。4 ℃保存。

將初步篩選獲得的SSR引物序列的5端添加熒光標記，合成熒光引物，以親本與子代的基因組DNA為模板，進行PCR擴增與毛細管電泳檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1　百合父本花粉的生活力和較優(yōu)授粉方式

3個百合父本花粉的萌發(fā)情況如圖2所示。由表2可知，3個百合父本的花粉均有一定的生活力，其中‘Sorbonne’的萌發(fā)率總體稍高于‘Black stone’和‘Tresor’。3個父本花粉在150 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+125 mg/L氯化鈣萌發(fā)液中的萌發(fā)率最大，‘Sorbonne’的萌發(fā)率顯著高于‘Black stone’ ‘Tresor’，‘Tresor’的萌發(fā)率顯著低于‘Black stone’。3個父本的花粉在9種萌發(fā)液中均可萌發(fā)，說明父本花粉的適應性較好。

1　‘Black stone’花粉；2　‘Tresor’花粉；3　‘Sorbonne’花粉。

表2　百合父本花粉的萌發(fā)率

同列不同字母表示處理間的差異有統(tǒng)計學意義(<0.05)。

3種雜交組合的結(jié)實率差異較大，其中卷丹בBlack stone’結(jié)實率最高，共授粉120朵，獲得17個蒴果，結(jié)實率高達14.167%；卷丹בTresor’，獲得7個蒴果，結(jié)實率為5.833%；卷丹בSorbonne’僅獲得1個蒴果，結(jié)實率最低，為0.833%。由此可見，卷丹百合和亞洲百合(‘Black stone’)的親緣關(guān)系較近，較易獲得雜交果實。

在4種授粉方式中，蕾期授粉所得蒴果數(shù)量最多，共授粉90朵，獲得了13個雜交蒴果，結(jié)實率達到了14.44%；其次為正常授粉，獲得了11個雜交蒴果，結(jié)實率為12.20%；切割柱頭授粉僅獲得1個雜交蒴果，結(jié)實率為1.11%；延遲授粉沒有獲得果實。綜上可知，蕾期授粉是克服卷丹遠緣雜交受精前障礙的較優(yōu)授粉方式。

2.2　雜種苗的增殖和膨大生根較適培養(yǎng)基

胚珠培養(yǎng)30 d后有出芽現(xiàn)象。其中卷丹בBlack stone’獲得雜種苗1株，卷丹בTresor’獲得雜種苗8株，卷丹בSorbonne’沒有獲得雜種后代。

雜種苗小鱗片接入增殖培養(yǎng)基14 d后，鱗片基部開始膨大；在21 d左右鱗片基部開始生長出不定芽，部分接種的小鱗片也可分生出新的小籽球；60 d后，NAA處理雜種苗后代的鱗片生長分化穩(wěn)定(圖3)。對分化出的不定芽和小籽球的數(shù)量進行統(tǒng)計分析，結(jié)果，0.10 mg/L NAA處理的平均增殖系數(shù)最高，為6.42；0.01 mg/L NAA和0.50 mg/L NAA處理的平均增殖系數(shù)分別為4.40和3.98，無顯著差異，0.10 mg/L NAA處理的平均增殖系數(shù)顯著高于0.01 mg/L NAA與0.50 mg/L NAA處理的，說明0.10 mg/L NAA處理對百合小鱗片的增殖效果最好。

1　胚珠培養(yǎng)獲得的雜種苗；2　0. 01 mg/L NAA處理60 d后鱗片分化情況；3　0.10 mg/L NAA處理60 d后鱗片分化情況；4　0.50 mg/L NAA處理60 d后鱗片分化情況。

將增殖培養(yǎng)后的不定芽接種至鱗莖膨大生根培養(yǎng)基中，在配方1中的52個小鱗莖，得到26個生根小鱗莖，11個膨大鱗莖；在配方2中的55個小鱗莖，得到生根小鱗莖26個，膨大鱗莖7個；在配方3中的17個小鱗莖，得到生根的小鱗莖2個，膨大鱗莖僅1個；在配方4中的22個小鱗莖，僅得到2個生根小鱗莖，沒有獲得膨大的小鱗莖。結(jié)果表明，配方1中的小鱗莖膨大率與生根率最高，與配方2、配方3比較，0.05 mg/L 6–BA對百合小鱗莖膨大生根的效果最好；相比配方3及配方4的效果，說明活性炭可促進百合小鱗莖膨大生根。

由圖4可看出，在同種培養(yǎng)基條件下，黑暗培養(yǎng)40 d后的雜種苗鱗莖比光照培養(yǎng)的大，所獲1～2 cm大球的數(shù)量是光照培養(yǎng)的2倍，而且根系更為發(fā)達、粗壯。光照培養(yǎng)的34個小鱗莖中，得到膨大鱗莖8個，生根鱗莖20個；黑暗培養(yǎng)的38個小鱗莖中，得到膨大鱗莖17個，生根鱗莖25個。表明黑暗培養(yǎng)的小鱗莖的生根率和膨大率均高于光照培養(yǎng)的，暗培養(yǎng)環(huán)境更適宜百合雜種苗鱗莖的膨大生根。

1、2　光照培養(yǎng)的鱗莖膨大情況；3、4　黑暗培養(yǎng)的鱗莖膨大情況；5、6　光照培養(yǎng)的鱗莖生根情況；7、8　黑暗培養(yǎng)的鱗莖生根情況。

2.3　百合雜交后代的鑒定結(jié)果

對母本卷丹、父本‘Tresor’以及卷丹בTresor’2個雜種苗株系JA1、JA2各3株提取DNA，利用超微量核酸蛋白測定儀檢測濃度。結(jié)果顯示，其OD260/OD280值為 1.7～2.0；通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，所提取DNA條帶清晰無拖帶，無蛋白質(zhì)和RNA污染。

利用23對SSR引物對父母本進行PCR擴增和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出了其中擴增效果較好、條帶較清晰、穩(wěn)定的引物16對。將篩選出的SSR引物的5端添加熒光標記，合成熒光引物，進行PCR擴增與毛細管電泳檢測與分析。

采用初步篩選出的16對SSR引物對父母本及雜交后代的PCR擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳檢測，獲得數(shù)據(jù)在GeneMarker V2.2.0進行判讀與分析，得出其中4對引物可以有效鑒定雜交后代的真實性(圖5)。由圖5可知，JA1的3個子代在引物JDZJ–11中同時擴增出了父母本的特異性片段，可以確定為真實雜種；而JA2的3個子代在引物JDZJ–13中擴增出了父母本的特異性片段，也可以確定JA2的3個子代均為真實雜種。

圖5　引物JDZJ–11和JDZJ–13的擴增圖譜

3　結(jié)論與討論

將卷丹百合與抗性強、觀賞性狀優(yōu)良的亞洲百合雜種系品種‘Black stone’‘Tresor’及東方百合雜種系品種‘Sorbonne’進行雜交，建立了一套適于克服卷丹百合遠緣雜交障礙的方法以及雜種后代組培快繁體系。

運用4種授粉方式進行雜交，發(fā)現(xiàn)蕾期授粉的結(jié)實率最高，延遲授粉的最低，故在以卷丹為母本的雜交過程中采用蕾期授粉方式，能夠較好地克服遠緣雜交受精前障礙而得到更多膨大的雜交果實。為了克服卷丹遠緣雜交的受精后障礙，還對所獲胚珠進行了胚拯救，但最終只有卷丹בBlack stone’和卷丹בTresor’能夠獲得雜種苗，卷丹בSorbonne’的雜交組合沒有獲得萌發(fā)的雜種苗，這表明卷丹× ‘Sorbonne’遠緣雜交的受精后障礙非常嚴重，雜種存在嚴重的難稔性，極難成活。卷丹和亞洲百合雜種系品種(‘Black stone’ ‘Tresor’)進行遠緣雜交的雜種后代較容易成活，這與雷家軍等[10]研究結(jié)果相一致。

在卷丹雜種苗增殖培養(yǎng)過程中，6–BA的質(zhì)量濃度為1 mg/L時，適宜的NAA質(zhì)量濃度可促進小鱗莖增殖，超過適宜濃度后，隨著NAA濃度的增加，增殖系數(shù)下降，這與張睿婧等[11]、李卓憶[12]的試驗結(jié)果相一致。在雜種苗膨大生根培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，NAA質(zhì)量濃度為0.10 mg/L時，0.05 mg/L 6–BA最能促進小鱗莖膨大生根，而當6–BA質(zhì)量濃度超過0.05 mg/L時，出現(xiàn)抑制作用；對比配方3和配方4培養(yǎng)基可知，適宜的活性炭對卷丹בTresor’雜種苗的膨大生根有一定的促進作用。

由于組織培養(yǎng)過程中操作不當造成組培苗污染死亡，最終只獲得了卷丹和‘Tresor’的2個雜種苗株系JA1、JA2。利用SSR分子標記技術(shù)對JA1、JA2株系的雜種后代進行真實性鑒定，其中從4對SSR引物的擴增結(jié)果中發(fā)現(xiàn)雜交后代中含有父母本雙方或父本的特異性條帶，確定2個株系的雜種后代均為真實性雜種。

百合雜種苗仍處于幼苗生長階段，未能對其與親本進行田間形態(tài)學觀察比較，后續(xù)需對雜種后代的抗性、觀賞性和食用價值等進行進一步評估，為培育出觀賞兼食用百合新品種提供待選材料基礎(chǔ)。

[1] 龍雅宜，張金政，張?zhí)m年．百合球根花卉之王[M]．北京：金盾出版社，1999：1–34．

[2] 雷蒙蒙．卷丹百合的藥理作用研究進展[J]．職業(yè)與健康，2018，34(3)：429–432．

[3] 林立浩，黃世霞，袁藝，等．卷丹百合連作障礙機制及治理措施研究進展[J]．信陽農(nóng)林學院學報，2021，31(1)：107–110．

[4] 楊秀梅，瞿素萍，吳學尉，等．百合種質(zhì)資源對枯萎病的抗性鑒定[J]．西南大學學報(自然科學版)，2010，32(6)：31–34．

[5] TUYL J V，JEU M D．Methods for Overcoming Interspecific Crossing Barriers[M]．Cambridge：Cambridge University Press，1997．

[6] 羅建讓，牛立新，張延龍，等．百合野生種及品種交配親和性的研究[J]．西北農(nóng)業(yè)學報，2006，15(2)：112–116．

[7] 樊金萍，王洪亮，車代弟．百合遠緣雜交胚胎發(fā)育情況的研究[J]．中國林副特產(chǎn)，2005(2)：5–7．

[8] 雷家軍，龐蘭，林翼飛，等．卷丹百合種間雜種胚培養(yǎng)研究[J]．沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2009，40(1)：84–87．

[9] 張銘芳，吳磊磊，賈桂霞．百合不同雜交系品種花粉貯藏特性分析[J]．西北植物學報，2013，33(7)：1465–1472．

[10] 雷家軍，林翼飛．卷丹與亞洲百合和東方百合種間雜交[J]．東北林業(yè)大學學報，2009，37(12)：37–38．

[11] 張睿婧，姜珊，席夢利，等．百合遠緣雜交及其雜種鑒別研究[J]．南京林業(yè)大學學報(自然科學版)，2012，36(3)：23–27．

[12] 李卓憶．觀賞兼食用百合新品種的培育[D]．北京：北京林業(yè)大學，2018．

Distant hybridization ofThunb.and identification of its hybrid progeny

SHU Ke1,2，LI Jianhong3，CHEN Lu1,4，F(xiàn)U Haiyan1，CAI Wei1，LIU Lichen1，LI Yufan1,2,4*

(1.College of Horticulture, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2.Hunan Engineering Research Center for the Breeding and Utilization of High-Quality Flowers and Trees in the Mid-Subtropics of Hunan Province, Changsha, Hunan 410128, China; 3.Yangmingshan Provincial Nature Reserve Management Station of Chongyi County Forestry Bureau of Jiangxi Province, Chongyi, Jiangxi 341300, China; 4.Engineering Research Center of Horticultural Crop Germplasm Innovation and New Variety Breeding Teaching Department, Changsha, Hunan 410128, China)

In order to cultivate new varieties ofwith strong resistance and excellent ornament, the pollen viability of three ornamental lily cultivars ‘Black stone’, ‘Tresor’ and ‘Sorbonne’ was measured by liquid medium hanging drop method, which were respectively used to conduct distant crosses with female parentThunb. using bud stage pollination, normal pollination, delayed pollination, and stigma-cutting pollination. Ovules of the obtained hybrid progeny were cultured and multiplied, and the authenticity of the hybrid was identified by the method of SSR molecular marker. The results showed that the pollen germination rate of ‘Sorbonne’ was generally higher than that of ‘Black stone’ and ‘Tresor’; the seed setting rate with pollination at the bud stage was the highest, which was 14.44%; the hybrid combination with the largest number of capsules isThunb. × ‘Black stone’, with 17 capsules. Ovules of the hybrid capsules were cultured, and 9 F1 generation hybrid seedlings were obtained. The optimum medium formula for hybrid seedling propagation is MS+30 g/L sucrose+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+8 g/L agar. The optimal medium formula for bulb expansion and rooting is MS+80 g/L sucrose+0.1 mg/L NAA+ 0.05 mg/L 6-BA+0.75 g/L activated carbon+6.5 g/L agar, and the optimal culture environment is dark nourish. Finally, the two hybrid lines ofThunb. × ‘Tresor’ were confirmed to be true hybrids through SSR molecular mark identification using four pairs of primers.

Thunb.; distant hybridization; ovule culture; propagation culture; SSR molecular mark

舒珂，李建紅，陳璐，傅海燕，蔡維，劉李晨，李玉帆．卷丹百合遠緣雜交及雜種后代的鑒定[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2022，48(5)：556–562．

SHU K，LI J H，CHEN L，F(xiàn)U H Y，CAI W，LIU L C，LI Y F．Distant hybridization ofThunb. and identification of its hybrid progeny[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2022，48(5)：556–562．

http://xb.hunau.edu.cn

S644.103

A

1007-1032(2022)05-0556-07

10.13331/j.cnki.jhau.2022.05.008

2022–02–25

2022–05–10

湖南省科學技術(shù)廳項目(2021NK1005)；湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金項目(19B262)

舒珂(1999—)，男，湖南懷化人，碩士研究生，主要從事百合遺傳育種研究，443895906@qq.com；*通信作者，李玉帆，博士，講師，主要從事百合遺傳育種研究，liyufan@hunau.edu.cn

責任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維