高溫脅迫下不同耐熱性水稻品種的差異表達(dá)基因分析

周佳，彭艷，陳信波*

高溫脅迫下不同耐熱性水稻品種的差異表達(dá)基因分析

周佳1,2，彭艷2，陳信波1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

以耐熱水稻品種996和熱敏感水稻品種4628為材料，提取2個(gè)水稻品種在40 ℃高溫處理0、10、20、60 min和2 h的5～6期幼穗中的RNA進(jìn)行微陣列分析。結(jié)果表明：高溫脅迫下2個(gè)不同耐熱性品種的差異表達(dá)基因顯著富集在苯丙烷生物合成、熱休克蛋白、四肽重復(fù)以及一些與非生物脅迫相關(guān)的過程；耐熱型水稻品種996的差異表達(dá)基因還顯著富集于細(xì)胞色素P450，而熱敏感水稻品種4628的差異表達(dá)基因顯著富集到五肽重復(fù)；對(duì)高溫脅迫下具有品種特異性表達(dá)的基因進(jìn)行分析，推測(cè)可能是細(xì)胞色素P450家族基因的差異表達(dá)提高了耐熱水稻996的耐熱能力，基因的存在影響了熱敏感水稻4628的抗逆性。

水稻；高溫脅迫；耐熱；熱敏感；差異表達(dá)基因

高溫(超過35 ℃以上)是影響水稻產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素，對(duì)水稻生殖生長(zhǎng)影響顯著[1]。據(jù)國(guó)際水稻所研究，在水稻生長(zhǎng)的環(huán)境敏感期和敏感溫度范圍，溫度每升高1 ℃，產(chǎn)量損失10%以上[2]。長(zhǎng)江中下游地區(qū)水稻常常在抽穗開花前后一段時(shí)期內(nèi)遭遇持續(xù)高溫，導(dǎo)致水稻花器官發(fā)育不良、授粉行為障礙、籽粒灌漿不飽滿、結(jié)實(shí)率下降、水稻大幅度減產(chǎn)[3]。此外，高溫還會(huì)引起淀粉糊化特性(糊化溫度、峰值黏度、保持黏度、最終黏度等)發(fā)生改變，導(dǎo)致稻米品質(zhì)變劣[4–5]。

隨著工業(yè)進(jìn)程化的加快以及溫室效應(yīng)的加劇，高溫?zé)岷σ呀?jīng)成為水稻生產(chǎn)的主要非生物脅迫之一。本研究中，以耐熱水稻品種996和熱敏感品種4628為材料，研究40 ℃高溫處理對(duì)水稻幼穗基因表達(dá)的影響，并對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行功能富集分析，旨在為耐熱相關(guān)基因的篩選、鑒定以及耐熱機(jī)理的研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　供試水稻材料

耐熱型水稻品種996、熱敏感品種4628由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所提供。

1.2　方法

1.2.1 高溫脅迫處理

2個(gè)水稻品種在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田生長(zhǎng)至孕穗期后，將生長(zhǎng)基本一致的水稻移至實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)箱中，在溫度為32 ℃/28 ℃(白天/夜晚)、相對(duì)濕度80%、光照強(qiáng)度為600 μmol/(m2·s)的培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)1 d，然后在40 ℃、相對(duì)濕度80%、光照強(qiáng)度600 μmol/(m2·s)的條件下處理10、20、60 min和2 h，取經(jīng)高溫處理的發(fā)育至5～6期的主穗中部的小花，混合后液氮速凍，–80 ℃保存，以備微陣列分析。

1.2.2基因芯片試驗(yàn)

試驗(yàn)材料為–80 ℃保存的經(jīng)高溫脅迫處理的幼穗，以未經(jīng)高溫處理的材料為對(duì)照。所用基因芯片為4×44 k 安捷倫寡核苷酸水稻芯片。試驗(yàn)在上海生物芯片有限公司進(jìn)行。試驗(yàn)過程包括總RNA抽提、質(zhì)量檢測(cè)和定量、逆轉(zhuǎn)錄、標(biāo)記、芯片雜交、洗脫、掃描以及對(duì)雜交信號(hào)值進(jìn)行扣本底、標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.3差異表達(dá)基因分析

采用GEO2R軟件比較分析2個(gè)水稻品種未處理組(對(duì)照組)數(shù)據(jù)和高溫處理(實(shí)驗(yàn)組)數(shù)據(jù)，篩選差異表達(dá)基因。將4個(gè)時(shí)間點(diǎn)中有2個(gè)或2個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)高溫處理表達(dá)變化滿足倍數(shù)變化(fold change, FC)大于2或小于0.5的基因定義為差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)。

1.2.4基因的功能富集分析

為分析差異表達(dá)基因的功能，運(yùn)用生物信息學(xué)工具Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) v6.8(https://david. ncifcrf.gov/)進(jìn)行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析、INTERPRO蛋白結(jié)構(gòu)域富集分析等。選取錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)小于0.05的術(shù)語(terms)用于基因的功能分析。

1.2.5維恩分析

采用在線工具venny 2.1 (https://bioinfogp.cnb. csic.es/tools/venny/) 編制Venn圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　高溫脅迫下2個(gè)水稻品種的基因表達(dá)

高溫脅迫下，從耐熱品種996中鑒定出3113個(gè)DEGs，從熱敏感品種4628中鑒定出7297個(gè)DEGs(圖1)。高溫脅迫下，熱敏感品種差異表達(dá)基因比耐熱品種多，可能是因?yàn)闊崦舾衅贩N對(duì)高溫更敏感，進(jìn)而觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，致使更多基因差異表達(dá)。

“↑”和“↓”分別表示高溫脅迫下基因表達(dá)上調(diào)和下調(diào)。

2.2　高溫脅迫下2個(gè)水稻品種DEGs的功能富集分析

2.2.1DEGs的GO富集分析

從圖2可以看出，高溫脅迫下，耐熱品種996的DEGs主要富集到22個(gè)GO terms，包括6個(gè)生物過程(biological process，BP)，4個(gè)細(xì)胞組分(cellular component，CC)及12個(gè)分子功能(molecular function，MF)。GO富集分析表明，這6個(gè)生物過程為熱響應(yīng)、次生代謝產(chǎn)物生物合成、碳水化合物代謝、幾丁質(zhì)分解代謝、毒素分解代謝、草酸代謝；在細(xì)胞組分中，質(zhì)外體、胞外區(qū)、膜和細(xì)胞壁的DEGs最為顯著；分子功能中，富集基因較多的為血紅素結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性的序列特異性DNA結(jié)合、鐵離子結(jié)合，各有104、94、77個(gè)差異表達(dá)基因。高溫脅迫下，熱敏感品種4628的DEGs主要富集到5個(gè)GO terms，包括2個(gè)生物過程和3個(gè)細(xì)胞組分，沒有顯著富集的分子功能。

圖2　高溫脅迫下耐熱型、熱敏感型水稻DEGs的GO terms

2.2.2DEGs的KEGG通路富集分析

從表1可以看出，耐熱品種996的DEGs主要富集在4條KEGG通路，富集基因最多的是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工，為62個(gè)。熱敏感品種4628的DEGs主要富集在7條KEGG通路，其中代謝途徑富集的基因最多，為504個(gè)。2個(gè)品種的DEGs都顯著富集到苯丙烷生物合成。

表1　高溫脅迫下2個(gè)不同耐熱性水稻品種DEGs富集的KEGG通路

2.2.3DEGs的INTERPRO蛋白結(jié)構(gòu)域分析

為了識(shí)別品種996與品種4628 DEGs蛋白結(jié)構(gòu)域的特征，采用DAVID在線工具進(jìn)行INTERPRO蛋白結(jié)構(gòu)域的富集分析。結(jié)果(圖3)表明，品種996 DEGs主要富集到20個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。富集基因排在前5的蛋白結(jié)構(gòu)域有細(xì)胞色素P450、細(xì)胞色素P450的E類I組、細(xì)胞色素P450的保守位點(diǎn)、糖苷水解酶超家族、糖苷水解酶的催化結(jié)構(gòu)域，分別為69、64、62、62、56個(gè)。品種4628 DEGs主要富集到類HSP20分子伴侶、α–晶體蛋白/Hsp20結(jié)構(gòu)域、五肽重復(fù)、糖苷水解酶超家族、糖苷水解酶的催化結(jié)構(gòu)域等5個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

圖3 高溫脅迫下2個(gè)水稻品種DEGs的INTERPRO蛋白結(jié)構(gòu)域富集分析結(jié)果

2.3　高溫脅迫下2個(gè)水稻品種中差異表達(dá)一致基因的功能富集分析

選取2個(gè)品種在高溫處理差異表達(dá)一致的基因(314個(gè))進(jìn)行富集分析。GO富集分析結(jié)果(圖4)表明，2個(gè)品種差異表達(dá)一致的基因主要富集到5個(gè)基本生物學(xué)過程，沒有顯著富集的細(xì)胞組分和分子功能。在KEGG富集分析中發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下2個(gè)品種差異表達(dá)一致的基因主要富集在1條通路，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工。INTERPRO蛋白結(jié)構(gòu)域富集分析結(jié)果(圖4)表明，2個(gè)品種差異表達(dá)一致的基因富集到8個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，主要為熱休克蛋白和四肽重復(fù)相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)域。

圖4　高溫脅迫下2個(gè)水稻品種差異表達(dá)一致基因的功能富集分析結(jié)果

2.4　高溫脅迫下2個(gè)水稻品種中差異表達(dá)相反的基因功能富集分析

選取了2個(gè)品種在高溫處理差異表達(dá)相反的基因(在品種4628表達(dá)上調(diào)而在品種996表達(dá)下調(diào)的429個(gè)；在品種996表達(dá)上調(diào)而在品種4628表達(dá)下調(diào)的149個(gè))進(jìn)行富集分析。GO富集分析結(jié)果(圖5)表明，在品種4628表達(dá)上調(diào)而在品種996表達(dá)下調(diào)的基因主要富集到6個(gè)GO terms，包括1個(gè)生物過程、1個(gè)細(xì)胞組分及4個(gè)分子功能；在品種996表達(dá)上調(diào)而在品種4628表達(dá)下調(diào)的基因沒有顯著富集到生物過程、細(xì)胞組分及分子功能。在本GO富集分析中，所富集到的基因在草酸鹽代謝過程、草酸脫羧酶活性部分和錳離子結(jié)合部分完全一致，均為基因。

在KEGG通路富集分析(圖5)中發(fā)現(xiàn)，在品種4628表達(dá)上調(diào)而在品種996表達(dá)下調(diào)的基因主要富集在4條KEGG通路，富集基因最多的是代謝途徑，為53個(gè)。對(duì)在品種4628表達(dá)下調(diào)而在品種996表達(dá)上調(diào)的基因進(jìn)行富集分析后，發(fā)現(xiàn)只有1條KEGG通路，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工。

INTERPRO蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果(圖5)表明，在品種4628表達(dá)上調(diào)而在品種996表達(dá)下調(diào)的基因主要富集到6個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，前2位顯著富集的蛋白結(jié)構(gòu)域?yàn)樘擒账饷傅某易搴吞擒账饷傅拇呋Y(jié)構(gòu)域，這2個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域富集的基因數(shù)量較多，分別為20和17。在品種996表達(dá)上調(diào)而在品種4628表達(dá)下調(diào)的基因沒有顯著富集到INTERPRO蛋白結(jié)構(gòu)域。在本INTERPRO蛋白結(jié)構(gòu)域富集分析中，萌發(fā)素的錳結(jié)合位點(diǎn)、萌發(fā)素以及Cupin超家族蛋白所富集的基因一致，均為基因。

“↑”和“↓”分別表示高溫脅迫下基因表達(dá)上調(diào)和下調(diào)。

2.5　高溫脅迫下具有品種特異性表達(dá)的基因

對(duì)2個(gè)品種DEGs的功能進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，耐熱型水稻996 DEGs蛋白結(jié)構(gòu)域富集到細(xì)胞色素P450、細(xì)胞色素P450的E類I組、細(xì)胞色素P450保守位點(diǎn)的基因基本一致，包括LOC_Os09g28390 ()、LOC_Os02g36150()、LOC_Os 02g36190()、LOC_Os02g36070()、LOC_Os04g48170()、LOC_Os05g40384 ()等。其中在高溫脅迫下表達(dá)上調(diào)，、、、在高溫脅迫下表達(dá)下調(diào)。熱敏感水稻4628 DEGs顯著富集在五肽重復(fù)，包括LOC_Os09g24680 ()、LOC_Os12g17080()等。其中在高溫脅迫下表達(dá)上調(diào)，在高溫脅迫下表達(dá)下調(diào)。品種4628顯著富集于草酸鹽代謝過程、草酸脫羧酶活性、錳離子結(jié)合、萌發(fā)素的相關(guān)基因在高溫脅迫下特異上調(diào)，這些基因包括LOC_Os08g08980 ()、LOC_Os08g08960 ()、LOC_Os01g18170 ()、LOC_Os08g3576 0()、LOC_Os08g09000 ()、LOC_Os03g589 80()等。

3　結(jié)論與討論

本研究中，通過對(duì)高溫脅迫下2個(gè)水稻品種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)耐熱水稻品種996與熱敏感水稻品種4628的DEGs均顯著富集在一些基本的或者與脅迫密切相關(guān)的生物學(xué)過程、代謝途徑以及蛋白結(jié)構(gòu)域。苯丙烷代謝有多個(gè)分支，可產(chǎn)生包括木質(zhì)素、類黃酮、木脂素、類苯丙酸酯、羥基肉桂酸酰胺和單寧的前體在內(nèi)的代謝物[6]。維管植物需要木質(zhì)素為細(xì)胞壁提供機(jī)械支持，使得植物能夠長(zhǎng)得更高[7]。研究[8–9]發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素有助于植物對(duì)各種非生物脅迫的響應(yīng)；類黃酮可減少由非生物脅迫引起的ROS積累造成的氧化損傷[10]。熱休克蛋白(HSP)通常起分子伴侶的作用，根據(jù)其相對(duì)分子質(zhì)量大小和序列同源性可分為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60和小熱休克蛋白sHsp(如Hsp40、Hsp20)。Hsp90可能對(duì)非生物脅迫具有直接的保護(hù)能力，并在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用[11–14]。Hsp70蛋白可增強(qiáng)植物對(duì)熱和其他非生物脅迫的耐受性[15]。研究[16]表明，線粒體Hsp70可通過調(diào)控ROS含量來抑制水稻原生質(zhì)體中的細(xì)胞編程性死亡。植物中含量最多的一類熱休克蛋白為小熱休克蛋白(sHsp)，它能防止熱誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集，防止蛋白的變性以及不可逆的沉淀，促進(jìn)變性蛋白正確的重折疊[17]。熱休克蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)是對(duì)非生物脅迫的最佳反應(yīng)之一[18–20]。四肽重復(fù)與水稻抗性有關(guān)[21]，且與伴侶蛋白有特定的相互作用。有研究[22]報(bào)道，基因的重復(fù)和基因的啟動(dòng)子區(qū)TFBs (transcription factor binding sites)的后續(xù)變異可能是基因及其啟動(dòng)子對(duì)水稻生物和非生物脅迫耐受性的新功能化的結(jié)果。

耐熱型水稻996 的DEGs顯著富集在細(xì)胞色素P450?；蛟诳刂扑久撀渌崴胶头巧锩{迫中起重要作用[23]。本研究中，在高溫脅迫下表達(dá)上調(diào)，說明其可能是提高水稻耐高溫性的關(guān)鍵基因。CYP87A3蛋白可能是生長(zhǎng)素對(duì)生長(zhǎng)反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子，應(yīng)用生長(zhǎng)素可快速誘導(dǎo)的表達(dá)[24]。本研究中，在高溫脅迫下表達(dá)下調(diào)，說明其可能不利于水稻開花。催化ent–異貝殼杉烯的C2–羥基化，催化ent–卡薩二烯的C2–羥基化[25]。是一種多功能/混雜羥化酶，可催化ent–卡薩–12，15–二烯的C11位羥基化[26](也稱)編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶，該酶作為赤霉素失活酶，催化非13–羥基化GA的16α、17–環(huán)氧化[27]。本研究中，和在高溫脅迫下表達(dá)下調(diào)，說明它們可能在脅迫反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用。的啟動(dòng)子區(qū)域包含多種順式作用元件，其中非生物脅迫響應(yīng)元件包括ABRE(脫落酸響應(yīng)元件)、TGACG–motif (MeJA響應(yīng)元件)、ERE(乙烯響應(yīng)元件)、LTR(低溫響應(yīng)元件)、TATC/GARE(赤霉素響應(yīng)元件)、TCA–Element(水楊酸響應(yīng)元件)、MBS(干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件)、TGA–Element(生長(zhǎng)素響應(yīng)元件)和AuxRR– Core(生長(zhǎng)素響應(yīng)元件)等[28]。推測(cè)耐熱水稻996可能是因?yàn)榧?xì)胞色素P450家族基因的差異表達(dá)提高了其耐熱能力。

熱敏感水稻4628的DEGs顯著富集于五肽重復(fù)(PPR)。PPR蛋白在植物發(fā)育過程以及非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，且基因可能在水稻對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)中發(fā)揮作用[29]。保護(hù)RNA轉(zhuǎn)錄物免受核糖核酸酶降解[30]。本研究中，在高溫脅迫下表達(dá)上調(diào)，說明其可能在水稻非生物脅迫下發(fā)揮重要作用。水稻編碼一種含有DYW基序的五肽重復(fù)蛋白[31]，對(duì)線粒體中的RNA編輯至關(guān)重要。推測(cè)可能是基因在水稻耐熱性上發(fā)揮了特定作用，可見2個(gè)品種的不同耐熱性是由不同基因的差異表達(dá)導(dǎo)致的。

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Analysis of differentially expressed genes in rice varieties with different heat tolerance under high temperature stress

ZHOU Jia1,2，PENG Yan2，CHEN Xinbo1,2*

(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2.Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Changsha, Hunan 410128, China)

In this study, using heat tolerance line 996 and heat sensitive line 4628 as materials, we performed microarray analysis on the RNA extracted from the 5-6 stage young panicles of the two rice varieties treated with 40 ℃ for 0 min, 10 min, 20 min, 60 min and 2 h. The results showed that the differentially expressed genes of the two varieties were significantly enriched in phenylpropane biosynthesis, heat shock protein, tetratricopeptide repeat, and processes related to abiotic stress. In addition, heat tolerance line 996 differentially expressed genes were also significantly enriched in cytochrome P450. The heat sensitive rice 4628 differentially expressed genes were significantly enriched to pentatricopeptide repeat. With the results from this study, we could conclude that heat tolerance rice 996 may improve its own heat tolerance due to the differential expression of cytochrome P450 family genes, and heat sensitive rice 4628 may be due to the existence ofgene to affect its own stress resistance. The differentially expressed genes in the heat tolerance line 996 and heat sensitive line 4628-- provided information for further heat resistant gene identification and clarification of the heat resistant mechanism.

rice; high temperature stress; heat tolerance; heat sensitive; differentially expressed genes

周佳，彭艷，陳信波．高溫脅迫下不同耐熱性水稻品種的差異表達(dá)基因分析[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2022，48(5)：536–542．

ZHOU J，PENG Y，CHEN X B．Analysis of differentially expressed genes in rice varieties with different heat tolerance under high temperature stress[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2022，48(5)：536–542．

http://xb.hunau.edu.cn

S511; Q786

A

1007-1032(2022)05-0536-07

10.13331/j.cnki.jhau.2022.05.005

2021–12–01

2022–09–27

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015JJ-3081)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CX2015B241)

周佳(1996—)，女，湖南邵陽人，碩士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)研究，1010964041@qq.com；*通信作者，陳信波，博士，教授，主要從事植物分子生物學(xué)研究，xinbochen@live.cn

責(zé)任編輯：毛友純

英文編輯：柳正