設(shè)施連作枯萎病黃瓜根際亞硝酸鹽氧化細(xì)菌群落特征*

鄭晨萌,劉 星**,張 影,任秀娟,陳碧華,王 菲,申長(zhǎng)衛(wèi),吳大付

(1.河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院/河南省生物藥肥研發(fā)與協(xié)同應(yīng)用工程研究中心 新鄉(xiāng) 453003;2.河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院 新鄉(xiāng) 453003)

中國(guó)是全世界最大的設(shè)施蔬菜生產(chǎn)國(guó),設(shè)施蔬菜栽培是農(nóng)民增收的主渠道之一,確保設(shè)施蔬菜行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展對(duì)于促進(jìn)農(nóng)戶持續(xù)增收和實(shí)現(xiàn)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略目標(biāo)具有重要意義。然而,隨著設(shè)施蔬菜生產(chǎn)區(qū)域集中化和種植規(guī)模擴(kuò)大,長(zhǎng)期集約化連作種植帶來(lái)的土傳病害問題已成為限制行業(yè)健康發(fā)展的重要瓶頸[1-2]。土壤是土傳致病菌棲居的大本營(yíng),病原菌在條件適宜時(shí)以土壤為媒介浸染作物根系導(dǎo)致病害發(fā)生。闡明發(fā)病土壤理化、生化和生物學(xué)性質(zhì)與健康土壤的差異是切斷病害發(fā)生鏈條和實(shí)現(xiàn)障礙土壤修復(fù)改良的前提。

根際是作物-土壤-微生物互作的熱區(qū),這里既是土傳病害發(fā)生發(fā)展的主要場(chǎng)所,也是作物抵御土傳病原菌侵襲的關(guān)鍵防線[3]。連作條件下作物根際微生物組退化被認(rèn)為是土傳病害發(fā)生的重要原因[4-5]。大量研究證實(shí),與健康植株相比,病株根際土壤微生物多樣性更低、群落結(jié)構(gòu)失衡,有益(生防)微生物比例減少而土傳致病菌比例增加,且微生物種間互作強(qiáng)度和群落穩(wěn)定性(抵抗力)變差,這些都利于致病菌的入侵[6-11]。然而,已有研究多是圍繞根際土壤總的微生物群落(即細(xì)菌和真菌)變化展開,對(duì)功能微生物(組)關(guān)注較少。土壤微生物具有高度的功能多樣性,不同的土壤生物學(xué)過程(生態(tài)功能)常常由專一或少數(shù)的功能(組)微生物驅(qū)動(dòng),目前尚不清楚發(fā)病植株根際土壤一些關(guān)鍵的功能微生物群落的多樣性和結(jié)構(gòu)是否也與健康植株存在差別。

硝化過程是土壤氮循環(huán)的核心環(huán)節(jié),決定著土壤氮素有效性,對(duì)氮素高效利用和作物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)至關(guān)重要[12-13]。硝化過程經(jīng)由兩步完成:NH3首先經(jīng)氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea,AOA)氧化為NO2—,而后亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(nitrite-oxidizing bacteria,NOB)將NO2

—氧化為NO3—[14]。我們前期發(fā)現(xiàn),設(shè)施連作枯萎病黃瓜根際土壤氨氧化能力顯著低于健株,這是由于病株根際AOB 群落中Nitrosospira briensisClade 相對(duì)豐度降低導(dǎo)致[15-16]。但病株根際土壤亞硝酸鹽氧化能力和NOB 群落特征仍不明確,這限制了對(duì)病害土壤硝化過程通路和相關(guān)微生物生態(tài)學(xué)機(jī)制的理解。目前已知的NOB 隸屬于7 個(gè)細(xì)菌屬,其硝化桿菌屬(Nitrobacter)和硝化螺菌屬(Nitrospira)在土壤亞硝酸鹽氧化中起著主導(dǎo)作用[17-19]。鑒于此,我們以設(shè)施連作枯萎病黃瓜(Cucumis sativus)為研究對(duì)象,以同一地塊的健康植株為對(duì)照,結(jié)合熒光定量PCR 和高通量擴(kuò)增子測(cè)序方法,評(píng)估病株和健株間根際土壤Nitrobacter和Nitrospira豐度和群落多樣性及結(jié)構(gòu)差異,旨在增加對(duì)連作發(fā)病土壤關(guān)鍵生物學(xué)功能及其微生態(tài)過程的認(rèn)識(shí),為障礙土壤修復(fù)改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

研究區(qū)域位于河南省新鄉(xiāng)市牧野區(qū)牧野鎮(zhèn)(35°21′12″N,113°55′2″E,平均海拔約56 m)。供試土壤為壤質(zhì)潮土。牧野鎮(zhèn)是河南省設(shè)施蔬菜種植面積最大的鄉(xiāng)鎮(zhèn),也是豫北地區(qū)重要的設(shè)施蔬菜種植基地,主要栽培黃瓜、番茄(Lycopersicum esculentum)、辣椒(Capsicum annuum)和茄子(Solanum melongena)等作物,種植結(jié)構(gòu)相對(duì)單一,且大多處于長(zhǎng)期連續(xù)種植狀態(tài),連作障礙問題突出,枯萎病、黃萎病和青枯病等土傳病害較為普遍。該區(qū)地處黃河中下游,水資源豐富,土層深厚,土壤肥沃,屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候,四季分明。年平均降雨量約573.4 mm,多集中在7、8月,平均氣溫約14.1 ℃,全年無(wú)霜期約220 d,年均日照時(shí)數(shù)約2400 h。

1.2 樣品采集

在試驗(yàn)區(qū)隨機(jī)選取一個(gè)具有代表性的設(shè)施黃瓜種植地塊,該地塊在2011年以前的種植制度為冬小麥(Triticum aestivum)和夏玉米(Zea mays)輪作,此后轉(zhuǎn)換為設(shè)施黃瓜栽培并延續(xù)至今,已出現(xiàn)明顯的連作障礙問題,枯萎病發(fā)病嚴(yán)重且感病植株在大棚內(nèi)表現(xiàn)出典型的斑塊性分布特征。隨機(jī)選擇了4 個(gè)枯萎病發(fā)病嚴(yán)重的斑塊(樣方),在每個(gè)斑塊內(nèi)隨機(jī)選取6 株枯萎病黃瓜植株,用鐵鍬將根部挖出,抖土法采集根際土壤樣品,每株獲得土樣約30 g,6 株病株的根際土壤去除雜物、混合均勻作為一個(gè)混合土樣;另外,在每個(gè)發(fā)病斑塊周圍隨機(jī)選取6 株黃瓜健株利用同樣方法采集根際土樣,并制作混合土壤樣品。最終,本試驗(yàn)獲得同一地塊內(nèi)的病株和健株根際混合土壤樣品各4 個(gè),分別代表4 次重復(fù)。樣品采集時(shí)間為2019年4月20日(春茬黃瓜),此時(shí)正處在黃瓜結(jié)果期,是植株養(yǎng)分積累和產(chǎn)量形成的關(guān)鍵時(shí)期,也是當(dāng)?shù)乜菸≈饕l(fā)生時(shí)期。區(qū)內(nèi)黃瓜每年種植兩茬(春茬和秋茬),詳細(xì)的栽培、管理和施肥細(xì)節(jié)見本課題組早前報(bào)道[16]。每個(gè)新鮮的混合土壤樣品置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室后過1 mm 篩,等分成3 份:一份保存在—80 ℃冰箱用于后續(xù)的分子生物學(xué)分析,一份置于室內(nèi)風(fēng)干用于測(cè)定土壤理化性質(zhì),一份立即用于測(cè)定土壤礦質(zhì)氮含量和生化性質(zhì)。部分土壤理化和生化性質(zhì)數(shù)據(jù)已在他刊發(fā)表[15],為避免數(shù)據(jù)重復(fù)使用,本文不再單獨(dú)展示和敘述,僅用于相關(guān)性分析。

1.3 土壤亞硝態(tài)氮含量和亞硝酸鹽氧化能力測(cè)定

土壤亞硝態(tài)氮采用2 mol·L—1KCl 溶液浸提(水土比5∶1),連續(xù)流動(dòng)注射分析儀測(cè)定含量。土壤亞硝酸鹽氧化潛勢(shì)(potential nitrite oxidation rate,PNOR)測(cè)定參考Han 等[20]的方法并略有改進(jìn):將6 g 的新鮮土樣加入到50 mL 含1 mmol·L—1NaNO2的磷酸鹽緩沖液(Na2HPO40.2 g·L—1,NaH2PO40.2 g·L—1,pH 為7.4),而后于25 ℃下在震蕩培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24 h,轉(zhuǎn)速為180 r·min—1。在培養(yǎng)0 h、6 h、12 h、18 h 和24 h 分別取2 mL 土壤懸液,離心(2000 r·min—1)后以N-(1-萘基)-乙二胺作顯色劑,在520 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定NO2—-N濃度。擬合培養(yǎng)液中NO2—-N 消耗量和培養(yǎng)時(shí)間的線性關(guān)系,土壤PNOR 采用擬合得到的線性方程斜率表示。

1.4 土壤DNA 提取和熒光定量PCR

稱取0.50 g 混勻土壤,采用MOBIO PowerSoil DNA 分離試劑盒,按照產(chǎn)品說明書上的步驟,提取土壤微生物總DNA。DNA 提取質(zhì)量和純度采用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法檢測(cè)。提取的微生物總DNA 溶解在50 μL 洗脫緩沖液中并保存于—20 ℃冰箱備用。

采用熒光定量PCR 方法測(cè)定土壤中Nitrobacter和Nitrospira的豐度,二者的擴(kuò)增靶標(biāo)分別為nxrA(編碼亞硝酸鹽氧化還原酶蛋白A 亞基)和nxrB(編碼亞硝酸鹽氧化還原酶蛋白B 亞基)基因,相應(yīng)的引物對(duì)分別為F1norA/R2norA[21]和nxrB169F/nxrB-638R[22]。實(shí)時(shí)定量采用ABI 7500 儀器進(jìn)行,每個(gè)土樣重復(fù)3 次。PCR 擴(kuò)增體系(20 μL)如下:16.4 μL ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix,正、反引物各0.8 μL(5 μmol·L—1),2 μL DNA 模板。擴(kuò)增條件如下:預(yù)變性95 ℃ 3 min,95 ℃ 5 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物專一性驗(yàn)證和標(biāo)準(zhǔn)曲線制備參考Liu 等[18]的方法。nxrA和nxrB基因的擴(kuò)增效率分別為95.81%和96.68%,標(biāo)準(zhǔn)曲線R2分別為0.9994和0.9998。Nitrobacter和Nitrospira的豐度分別采用每克干土中nxrA和nxrB基因拷貝數(shù)表示。

1.5 高通量擴(kuò)增子測(cè)序和生物信息學(xué)分析

采用高通量擴(kuò)增子測(cè)序方法評(píng)估黃瓜根際土壤Nitrobacter和Nitrospira的群落結(jié)構(gòu)(Illumina Miseq PE300 平臺(tái))。以土壤微生物總DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增靶標(biāo)分別為nxrA和nxrB基因,所用引物對(duì)與熒光定量PCR 相同。采用隨機(jī)選取的DNA 模板和不含DNA 模板的陰性對(duì)照進(jìn)行初步試驗(yàn)以探索最佳的PCR 擴(kuò)增條件。正式試驗(yàn)時(shí)PCR擴(kuò)增體系(20 μL)為:4 μL FastPfu Buffer(5×),2 μL dNTPs(2.5 mmol·L—1),0.4 μL TransStart FastPfu DNA Polymerase,0.2 μL Bovine serum albumin,引物各 0.8 μL(5 μmol·L—1),10 ng 模板DNA 和11.2 μL ddH2O。PCR 擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性3 min,95 ℃ 30 s,55 ℃30 s,72 ℃ 45 s,37 個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min,10 ℃保溫。每個(gè)樣本均擴(kuò)增3 次,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后將3 次的擴(kuò)增產(chǎn)物均勻混合,采用Agarose Gel DNA 試劑盒純化,并使用NanoDrop2000 進(jìn)行定量,最后將各樣本等量的PCR 產(chǎn)物編碼并送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序獲得的原始序列已全部上傳至NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)PRJNA557592)。

參照Lu 等[23]的方法,對(duì)高通量測(cè)序下機(jī)原始序列進(jìn)行質(zhì)控過濾和雙端拼接,而后采用QIIME 軟件的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行生物信息學(xué)分析[24]。本研究共獲得183 794 條nxrA基因高質(zhì)量序列和154 226 條nxrB基因高質(zhì)量序列,平均到每個(gè)土壤樣本分別為22 974和19 278 條序列,序列平均長(zhǎng)度分別為283 bp 和453 bp。對(duì)獲得的這些高質(zhì)量序列按照97%的相似度進(jìn)行可操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTU)聚類,每個(gè)OTU 中數(shù)量最多的序列被挑選為代表性序列。利用MEGA 6.0 軟件,將各OTU 代表性序列和早前文獻(xiàn)已報(bào)道的參考序列按照最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(Bootstrap 重復(fù)抽樣1000 次),根據(jù)進(jìn)化樹分枝(即基因序列不同的聚類)確定群落組成。nxrA基因參考序列和群落成員命名參照Wertz 等[25]、Poly 等[26]和Attard 等[21]的報(bào)道;nxrB基因參考序列和群落成員命名參照Pester 等[22]和Luo 等[27]的報(bào)道。所有高質(zhì)量序列按最小樣本序列數(shù)抽平后進(jìn)行α 多樣性和β 多樣性分析。應(yīng)用MOTHUR 軟件計(jì)算群落α 多樣性指數(shù);利用Bray-Curtis 距離主坐標(biāo)分析(PCoA)比較病株和健株間微生物群落結(jié)構(gòu)差異;通過相似度分析(ANOSIM)檢驗(yàn)處理間微生物群落結(jié)構(gòu)差異的顯著性;采用CANOCO 5.0 軟件對(duì)土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系進(jìn)行冗余分析(RDA),各理化因子的顯著性采用Monte Carlo 檢驗(yàn)[15]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算和圖表繪制在Microsoft Excel 2016 和Sigmaplot 12.0 軟件上進(jìn)行,處理間差異顯著性比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)(P＜0.05)。圖表中試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示(n=4)。不同數(shù)據(jù)間的相關(guān)性分析采用常見的一元回歸模型進(jìn)行(斯皮爾曼線性相關(guān))。微生物豐度采用常用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤亞硝態(tài)氮含量、亞硝酸鹽氧化潛勢(shì)和亞硝酸鹽氧化微生物豐度

如表1所示,健株和病株根際土壤亞硝態(tài)氮含量無(wú)顯著差別,但病株根際亞硝酸鹽硝化潛勢(shì)較健株高出約1 倍(P＜0.001)。就不同亞硝酸鹽氧化微生物(nitrite-oxidizing bacteria,NOB)的豐度而言,病株根際Nitrobacter豐度顯著高于健株(P=0.020),但二者的Nitrospira豐度無(wú)顯著差異。

表1 黃瓜健康植株(HPR)和感染枯萎病植株(DPR)根際土壤亞硝態(tài)氮含量、亞硝酸鹽氧化潛勢(shì)和亞硝酸鹽氧化微生物(NOB)豐度Table 1 Soil NO2—-N contents,potential nitrite-oxidizing rates and nitrite-oxidizing bacteria(NOB)abundances in rhizosphere soil of healthy plants(HPR)and Fusarium wilt-diseased plants(DPR)of cucumber

2.2 土壤Nitrobacter 的群落多樣性和組成結(jié)構(gòu)

如表2所示,健株和病株根際間Nitrobacter群落α多樣性無(wú)顯著差異。然而,健株和病株Nitrobacter群落組成差異明顯,各有39 個(gè)非共享OTU(圖1a)。PCoA 分析和ANOSIM 測(cè)試進(jìn)一步證明,二者間Nitrobacter群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)顯著差異(P＜0.05)(圖1c)。

圖1 黃瓜健康植株(HPR)和感染枯萎病植株(DPR)根際土壤硝化桿菌(Nitrobacter)群落組成(a)和結(jié)構(gòu)(c)以及硝化螺菌(Nitrospira)群落組成(b)和結(jié)構(gòu)(d)Fig.1 Community composition(a)and structure(c)of Nitrobacter as well as community composition(b)and structure(d)of Nitrospira in rhizosphere soil of healthy plants(HPR)and Fusarium wilt-diseased plants(DPR)of cucumber

表2 黃瓜健康植株(HPR)和感染枯萎病植株(DPR)根際土壤硝化桿菌(Nitrobacter)和硝化螺菌(Nitrospira)群落α 多樣性指數(shù)Table 2 The α diversity indexes of Nitrobacter and Nitrospira communities in rhizosphere soil of healthy plants(HPR)and Fusarium wilt-diseased plants(DPR)of cucumber

通過序列聚類,Nitrobacter群落中共獲得185 個(gè)OTU,其中有34 個(gè)OTU 的平均相對(duì)豐度超過1%,這34 個(gè)OTU 共占據(jù)約95%的總回收序列。將這些優(yōu)勢(shì)OTU 的代表性序列和前人已驗(yàn)證報(bào)道的Nitrobacter nxrA基因參考序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖2),發(fā)現(xiàn)黃瓜根際Nitrobacter群落成員包括

圖2 基于OTU 代表性序列和參考序列的Nitrobacter nxrA 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Nitrobacter nxrA genes based on representatives of OTUs detected in this study and representative sequences of major Clades

NitrobacterCluster 3、NitrobacterCluster 3-like、NitrobacterCluster 2b、NitrobacterCluster 4、NitrobacterCluster 6、NitrobacterCluster 1 和NitrobacterCluster 5。對(duì)這些群落成員統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),Nitrobac- terCluster 2b 平均相對(duì)豐度在健株根際顯著高于病株根際,而NitrobacterCluster 6 和NitrobacterCluster 5 則與之相反(P＜0.05)(圖3a)。

圖3 黃瓜健康植株(HPR)和感染枯萎病植株(DPR)根際土壤硝化桿菌(Nitrobacter,a)和硝化螺菌(Nitrospira,b)群落成員平均相對(duì)豐度比較Fig.3 Comparisons on the relative abundances of phylogenetic Nitrobacter(a)and Nitrospira(b)groups in rhizosphere soil of healthy plants(HPR)and Fusarium wilt-diseased plants(DPR)of cucumber

2.3 土壤Nitrospira 的群落多樣性和組成結(jié)構(gòu)

健株和病株根際間Nitrospira群落α 多樣性無(wú)顯著差異(表2)。然而,病株根際Nitrospira群落中存在更多的特有OTU(圖1b)。PCoA 分析和ANOSIM測(cè)試顯示健株和病株根際間Nitrospira群落結(jié)構(gòu)差異顯著(P＜0.05)(圖1d)。

對(duì)于Nitrospira群落,通過序列聚類共得到147個(gè)OTU,其中33 個(gè)OTU 平均相對(duì)豐度超過1%,合計(jì)占據(jù)總回收序列約95%。這些優(yōu)勢(shì)OTU 的代表性序列和已有的Nitrospira nxrB基因參考序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖4所示,黃瓜根際Nitrospira群落成員包括Namibia soil Cluster 1、Namibia soil Cluster 2、Namibia soil Cluster 3、NitrospiralineageⅠ、NitrospiralineageⅡ和NitrospiralineageⅤ。其中,Namibia soil Cluster 1 和Namibia soil Cluster 2 為優(yōu)勢(shì)群落成員。經(jīng)計(jì)算發(fā)現(xiàn),病株根際Namibia soil Cluster 1的平均相對(duì)豐度顯著超出健株根際約92.19%,但健株根際NitrospiralineageⅡ平均相對(duì)豐度約為病株根際的66 倍(P＜0.05)(圖3b)。

圖4 基于OTU 代表性序列和參考序列的Nitrospira nxrB 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of Nitrospira nxrB genes based on representatives of OTUs detected in the study and representative sequences of major Clades

2.4 冗余分析和相關(guān)分析

冗余分析表明,土壤理化因子共解釋了約84.37%的處理間Nitrobacter群落結(jié)構(gòu)差異,RDA1和RDA2 的解釋量分別為64.85%和19.52%(圖5a)。土壤亞硝態(tài)氮含量是影響Nitrobacter群落結(jié)構(gòu)最重要的理化指標(biāo)(r=0.912,P=0.037),其次是硝態(tài)氮含量(r=0.853,P=0.016),且二者均達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著水平;而其余土壤理化因子對(duì)Nitrobacter群落結(jié)構(gòu)影響不顯著。同時(shí),土壤理化因子共解釋約81.34%的處理間Nitrospira群落結(jié)構(gòu)差異,RDA1 和RDA2 的解釋量分別為65.63%和15.71%(圖5b)。在所有供試的土壤理化因子中,亞硝態(tài)氮含量是影響Nitrospira群落結(jié)構(gòu)的最重要指標(biāo)(r=0.887,P=0.019),其次是pH(r=0.771,P=0.027),且二者均達(dá)統(tǒng)計(jì)顯著水平;而其余土壤理化因子并不能顯著影響Nitrospira群落結(jié)構(gòu)。

圖5 黃瓜健康植株(HPR)和感染枯萎病植株(DPR)根際土壤硝化桿菌(Nitrobacter,a)和硝化螺菌(Nitrospira,b)群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的冗余分析Fig.5 Redundancy analyses between community structures of Nitrobacter(a)and Nitrospira(b)and soil physicochemical properties of healthy plants(HPR)and Fusarium wilt-diseased plants(DPR)of cucumber

線性回歸分析證明,Nitrobacter豐度與土壤硝態(tài)氮含量和亞硝酸鹽氧化潛勢(shì)顯著正相關(guān)(P＜0.05),而與土壤基礎(chǔ)呼吸量顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05);而Nitrospira豐度與所有供試土壤的理化和生化性質(zhì)均無(wú)顯著關(guān)系(圖6)。就Nitrobacter的各群落成員而言,NitrobacterCluster 2b 的平均相對(duì)豐度與土壤硝態(tài)氮含量、亞硝酸鹽氧化潛勢(shì)和全氮含量顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05),而與土壤基礎(chǔ)呼吸量和pH 顯著正相關(guān)(P＜0.05);NitrobacterCluster 6 的平均相對(duì)豐度與土壤硝態(tài)氮含量和亞硝酸鹽氧化潛勢(shì)顯著正相關(guān)(P＜0.05),而與土壤基礎(chǔ)呼吸量顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05);NitrobacterCluster 5 的平均相對(duì)豐度與土壤基礎(chǔ)呼吸量和pH 顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。Nitrospira的各群落成員中,Namibia soil Cluster 1 的平均相對(duì)豐度僅與土壤硝態(tài)氮含量顯著正相關(guān)(P＜0.05);NitrospiralineageⅡ的平均相對(duì)豐度僅與土壤pH 顯著正相關(guān)(P＜0.05)。

3 討論

作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的核心成員,微生物是眾多關(guān)鍵土壤生物學(xué)過程的直接執(zhí)行者,闡明土壤功能微生物組的變化特征有助于預(yù)測(cè)不同管理實(shí)踐下土壤生態(tài)功能(服務(wù))的響應(yīng)模式[28-29]。在作物連作障礙機(jī)理研究中,早前學(xué)者將注意力更多地集中在土壤總的微生物群落特征變化,而功能微生物組的研究常被忽視。傳統(tǒng)的兩步硝化理論認(rèn)為氨氧化過程是土壤氮素轉(zhuǎn)換的限速步驟,但越來(lái)越多的研究已經(jīng)證實(shí),在土壤氮素周轉(zhuǎn)過程中亞硝酸鹽氧化與氨氧化具有同等功能重要性[30-32]。在前期研究的基礎(chǔ)上[15-16],本研究聚焦于Nitrobacter和Nitrospira這兩種陸地生態(tài)系統(tǒng)中主導(dǎo)型NOB,結(jié)合設(shè)施連作生產(chǎn)系統(tǒng)土傳病害滋生這一熱點(diǎn)問題,比較了病株和健株根際間兩種NOB 豐度和群落多樣性及結(jié)構(gòu)差異。功能評(píng)估顯示,病株根際具有更高的亞硝酸鹽氧化潛勢(shì),這應(yīng)歸因于更高的Nitrobacter豐度(表1)。我們也確實(shí)發(fā)現(xiàn),亞硝酸鹽氧化潛勢(shì)與Nitrobacter而非Nitrospira的豐度具有顯著的正相關(guān)關(guān)系(圖6),說明Nitrobacter是土壤亞硝酸鹽氧化的主要功能執(zhí)行者。前人研究[33-34]揭示Nitrobacter和Nitrospira具有典型的生態(tài)位分異和截然不同的生活史對(duì)策,Nitrobacter是r-對(duì)策者,偏好富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境和高碳、氮供應(yīng),對(duì)底物的親和力相對(duì)較低;而Nitrospira為k-對(duì)策者,底物親和力較高,在寡營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中扮演更強(qiáng)的功能角色。集約化設(shè)施連作生產(chǎn)系統(tǒng)中,長(zhǎng)期高氮肥投入可能驅(qū)使Nitrobacter功能性支配著亞硝酸鹽氧化過程[35]。此外,病株較健株根際富集更多Nitrobacter的原因可能是發(fā)病植株生長(zhǎng)受阻,對(duì)養(yǎng)分的吸收能力變差,根際范圍累積更多的養(yǎng)分,形成了局部的富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境[8,36],有利于Nitrobacter的生長(zhǎng),也帶來(lái)了更高的亞硝酸鹽氧化潛勢(shì)。

Nitrobacter和Nitrospira的群落結(jié)構(gòu)在病株和健株根際土壤間存在顯著差異(表1 和圖1),說明NOB的群落結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)著土壤亞硝酸鹽氧化性能。微生物群落內(nèi)部常常具有功能冗余,單一或特定條件下功能的發(fā)揮更多依賴于少數(shù)的群落內(nèi)部成員,即活性群落成員[29],對(duì)亞硝酸鹽氧化細(xì)菌而言同樣如此[37]。對(duì)于Nitrobacter群落,NitrobacterCluster 6 和NitrobacterCluster 5 的平均相對(duì)豐度在病株根際均顯著高于健株根際,特別是NitrobacterCluster 6 的相對(duì)豐度與土壤亞硝酸氧化潛勢(shì)表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系(圖6),預(yù)示其為潛在的功能活性成員。由于迄今為止對(duì)NitrobacterCluster 6 這一Nitrobacter nxrA基因聚類尚無(wú)任何經(jīng)富集、純化得到的代表性菌株,因此依然限制了對(duì)其環(huán)境關(guān)聯(lián)性和行為特征的認(rèn)識(shí)。在Nitrospira群落中,盡管Namibia soil Cluster 1 的平均相對(duì)豐度在病株根際更高,但并未觀察到其與亞硝酸鹽氧化潛勢(shì)具有顯著相關(guān)性,這一定程度上支持了早前學(xué)者的報(bào)道,即Namibia soil Cluster 1 在旱地土壤亞硝酸鹽氧化過程中可能并非是一個(gè)關(guān)鍵的功能執(zhí)行者[18]。此外,健株根際中NitrospiralineageⅡ平均相對(duì)豐度較病株根際大幅度降低,可能與病株根際具有更低的pH 有關(guān)(圖6)[15]。Zhang 等[30]報(bào)道證明NitrospiralineageⅡ的代表性菌株Nitrospira mo-scoviensis的相對(duì)豐度與土壤pH 呈顯著正相關(guān)關(guān)系,暗示偏酸環(huán)境不利于NitrospiralineageⅡ的生長(zhǎng)。

圖6 土壤硝化桿菌(Nitrobacter)和硝化螺菌(Nitrospira)及其群落成員相對(duì)豐度與土壤性質(zhì)的相關(guān)分析Fig.6 Correlations between the abundances of Nitrobacter and Nitrospira and average relative abundances of their community members and soil properties

冗余分析證實(shí),土壤亞硝態(tài)氮含量是影響Nitrobacter和Nitrospira群落結(jié)構(gòu)最重要的土壤因子(圖5)。這也符合我們的預(yù)期,因?yàn)閬喯鯌B(tài)氮是亞硝酸鹽氧化微生物功能執(zhí)行的底物(通過氧化亞硝態(tài)氮獲取能量),而不同的群落成員由于自身的生理和代謝差別對(duì)底物有效性存在不同的適應(yīng)性和功能差異[18]。本研究中,盡管病株和健株根際亞硝態(tài)氮含量并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.113),但病株根際亞硝態(tài)氮含量確實(shí)相對(duì)高于健株根際(表1)。結(jié)合前期研究結(jié)果,有兩點(diǎn)必須要指出的是:1)病株和健株根際土壤微生物氨氧化能力和亞硝酸鹽氧化能力表現(xiàn)出“倒掛”現(xiàn)象,即病株根際具有低的氨氧化潛勢(shì),但有高的亞硝酸鹽氧化潛勢(shì),而健株恰好與之相反,這種現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。相較于經(jīng)典的兩步硝化理論,已有學(xué)者報(bào)道[38-39]了全程氨氧化細(xì)菌(complete ammonia-oxidizing bacteria,CAOB)的存在,此類細(xì)菌可以同時(shí)執(zhí)行氨氧化和亞硝酸鹽氧化兩個(gè)步驟。由于目前已知的CAOB 均隸屬于NitrospiralineageⅡ[40-41],特別是本研究中我們也觀察到NitrospiralineageⅡ的平均相對(duì)豐度在處理間存在顯著差異(圖3),因此需要探索CAOB 在設(shè)施連作土壤硝化過程中的功能角色。2)Wei 等[42]研究發(fā)現(xiàn),隨著土傳致病菌青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)的入侵,盆栽番茄根際細(xì)菌群落發(fā)生明顯改變,其中與土壤硝化過程相關(guān)的微生物(Nitrospirae)相對(duì)豐度也發(fā)生變化。相似的現(xiàn)象在露地和設(shè)施番茄種植中也被發(fā)現(xiàn)[7]。組合前期數(shù)據(jù)[15]和本研究相關(guān)測(cè)定結(jié)果,同樣觀察到黃瓜根際尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和Nitrobacter豐度存在極顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.905,P=0.002,n=8)。這些結(jié)果暗示土傳病原菌富集可能通過改變相關(guān)功能微生物群落影響了作物根際土壤硝化過程和強(qiáng)度,但其內(nèi)在機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

設(shè)施連作枯萎病黃瓜植株和健康植株在根際亞硝酸鹽氧化微生物(Nitrobacter和Nitrospira)豐度和群落結(jié)構(gòu)上存在顯著差異,這直接導(dǎo)致了病株和健株根際土壤亞硝酸鹽氧化能力的不同,表明集約化設(shè)施蔬菜連作生產(chǎn)中病害土壤的功能屬性變化,其微生物生態(tài)學(xué)機(jī)制須予以更多關(guān)注。