真空冷凍干燥乳酸菌的研究進展

黃 剛，金 剛

（1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏銀川 750021）

乳酸菌經(jīng)過增殖培養(yǎng)、濃縮分離后，與適量的保護劑進行混合制成菌懸液，再經(jīng)干燥處理可制成乳酸菌發(fā)酵劑。目前，常用的干燥方法有烘干、噴霧干燥、真空冷凍干燥等。其中，真空冷凍干燥是目前對菌體保藏效果最好、保藏時間最長的一種乳酸菌發(fā)酵劑制備技術(shù)，該技術(shù)可以保持菌體的生理生化特性和生物活性。然而，真空冷凍干燥過程中也會導(dǎo)致乳酸菌活力下降甚至死亡。國內(nèi)外學(xué)者針對有關(guān)乳酸菌在真空冷凍干燥過程中的損傷機制做了大量研究，發(fā)現(xiàn)乳酸菌在真空冷凍干燥后造成菌體存活率以及發(fā)酵活力降低的主要原因包括冷凍干燥過程造成細(xì)胞膜通透性改變、細(xì)胞完整性被破壞、細(xì)胞酶及相關(guān)蛋白變性和核糖核酸結(jié)構(gòu)發(fā)生變化等[1]。

為了進一步提高乳酸菌在真空冷凍干燥后的存活率和儲藏期，本文對真空冷凍干燥原理以及影響乳酸菌凍干存活率的關(guān)鍵因素進行了討論，以期為制備高活性和耐儲藏的乳酸菌發(fā)酵劑提供參考。

1 乳酸菌發(fā)酵劑概況

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，1988 年丹麥漢森中心實驗室成功研制了直投式乳酸菌發(fā)酵劑，在此之前液體發(fā)酵劑使用了數(shù)十年。與液體發(fā)酵劑相比，直投式乳酸菌發(fā)酵劑具有活菌數(shù)高（109～1012CFU/g）、保質(zhì)期長、接種量少和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等特點，且不需要進行活化、擴培等處理，可直接應(yīng)用于生產(chǎn)，大大提高了勞動生產(chǎn)力與產(chǎn)品質(zhì)量。

目前，我國對真空冷凍干燥的工藝應(yīng)用日漸成熟，但是由于菌種間的差異以及所使用凍干機的不同，還沒有一種通用的凍干方法來適應(yīng)于所有菌種。

2 真空冷凍干燥原理

乳酸菌菌液中水分是以自由水和結(jié)合水兩種方式存在，結(jié)合水以化學(xué)結(jié)合方式存在于菌液中。真空冷凍干燥采用了低溫低壓下的熱傳導(dǎo)機理，當(dāng)壓強低于610.5 Pa 時，不管溫度如何變化，只有固態(tài)和氣態(tài)，所以在此條件下升高溫度或者降低壓強都可以打破兩相平衡，使整個系統(tǒng)朝著冰轉(zhuǎn)換成水蒸氣的方向發(fā)展，即將菌液中的固態(tài)冰直接轉(zhuǎn)換為水蒸氣的干燥過程。

整個真空冷凍干燥過程主要分3 個階段完成，預(yù)凍→升華干燥（一次干燥）→解析干燥（二次干燥）[2]。

3 真空冷凍干燥對菌體造成的損傷

真空冷凍干燥主要分為冷凍和干燥兩個過程，冷凍對菌體造成的傷害主要表現(xiàn)為細(xì)胞的滲透失水和冰晶的形成，干燥對菌體的傷害主要表現(xiàn)在細(xì)胞的過度失水。在真空冷凍干燥過程中對乳酸菌的細(xì)胞損傷主要表現(xiàn)在以下幾個方面。

3.1 機械損傷

在真空冷凍干燥過程中，由于快速降溫，細(xì)胞內(nèi)外形成結(jié)晶，產(chǎn)生機械力，從而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)機械損傷。一般結(jié)晶形成的冰晶越大，細(xì)胞膜越容易破裂，從而造成細(xì)胞的死亡；冰晶越小對細(xì)胞的損傷也就越小。通常認(rèn)為降溫速率的大小影響著冰晶的大小，從而影響著細(xì)胞是否會受到損傷。許多研究者認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶是在快速降溫時產(chǎn)生細(xì)胞損傷的主要原因[3]。

3.2 溶質(zhì)損傷

在真空冷凍干燥過程中，由于細(xì)胞內(nèi)所含水分的凍結(jié)使細(xì)胞間隙間的溶液逐漸濃縮，從而使電解質(zhì)的濃度顯著增加。細(xì)胞內(nèi)外由于滲透壓的存在導(dǎo)致細(xì)胞脫水，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)對高濃度的電解質(zhì)極為敏感，容易造成蛋白質(zhì)的變性，進而使其喪失應(yīng)有的功能，增加了細(xì)胞的死亡率。

3.3 細(xì)胞膜損傷

細(xì)胞膜的損傷被認(rèn)為是菌體在真空冷凍干燥過程中失活的主要表現(xiàn)，另有研究表明細(xì)胞膜的損傷主要發(fā)生在干燥階段[4]。微生物的干燥損傷很大程度上是由于膜脂性質(zhì)、結(jié)構(gòu)的變化使膜的流動性或完整性改變，導(dǎo)致細(xì)胞膜的功能失調(diào)，從而影響微生物的生命活動。

3.4 胞內(nèi)酶失活

乳酸菌在真空冷凍干燥過程中，一些細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵酶會發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而使整個細(xì)胞代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。例如，乳酸脫氫酶、三磷酸腺苷酶、β-半乳糖苷酶在真空冷凍干燥時會發(fā)生結(jié)構(gòu)與功能的改變[5]。

3.5 DNA 損傷

DNA 損傷也是凍干過程中造成菌體損傷的主要原因之一。有學(xué)者在真空冷凍干燥瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）時發(fā)現(xiàn)了DNA 和RNA 的改變。DNA 一旦產(chǎn)生損傷，在其修復(fù)過程中就會容易產(chǎn)生錯誤，導(dǎo)致突變體的增加[6]。

4 影響乳酸菌冷凍干燥存活率的因素

4.1 菌體的收集時期

在乳酸菌生長過程中，培養(yǎng)基的環(huán)境會發(fā)生改變，如pH 降低、代謝物的產(chǎn)生、營養(yǎng)物質(zhì)的消耗等，為了獲得更高的活菌數(shù)，必須及時將菌體從培養(yǎng)基中離心收集，從生理狀態(tài)上來講有利于提高凍干后菌體的存活率和初始菌體的活菌數(shù)，而收集過程中直接影響菌體活性的則是菌體的菌齡。ZHANG 等[7]對酒類酒球菌（Oenococcus oeni）SD-2a 冷凍干燥后發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定期早期收集菌體比對數(shù)中期的存活率更高。

4.2 乳酸菌的應(yīng)激反應(yīng)

李寶坤[8]在羅伊氏乳酸桿菌（Lactobacillus reuteri）CICC6226 真空冷凍干燥過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過冷應(yīng)激和熱應(yīng)激都提高了L. reuteriCICC6226 凍干后的存活率。以上研究表明，在真空冷凍干燥前對乳酸菌進行一定的應(yīng)激處理可以提高乳酸菌在凍干后的存活率和耐儲存性，例如冷應(yīng)激、熱應(yīng)激、酸應(yīng)激，這些應(yīng)激反應(yīng)可以使細(xì)胞對不利條件提前做出反應(yīng)，產(chǎn)生應(yīng)激蛋白、改變細(xì)胞膜脂肪酸的組成以及相容溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運或合成，從而提高乳酸菌對不利條件的抵抗力[9]。

4.3 凍干保護劑及其保護機理

在真空冷凍干燥過程中，難以避免乳酸菌的損傷，可以通過外源添加保護劑的方式來提高乳酸菌凍干后的存活率和儲藏時間[10]。乳酸菌的凍干保護劑按照能否進入細(xì)胞可以分為滲透型和非滲透型兩類。滲透型保護劑因為能夠進入細(xì)胞與溶液中的水分子結(jié)合，從而發(fā)生水合作用，使細(xì)胞黏稠性增加，在凍干過程中溫度降低，溶液中冰晶的形成速率因此減慢，一定程度上降低了水轉(zhuǎn)換為冰晶的比例，從而減少了細(xì)胞外溶質(zhì)濃度升高所造成的細(xì)胞損傷；非滲透型保護劑不能透過細(xì)胞膜，常常包裹在細(xì)胞表面，降低了溶液形成冰晶的速率，在特定的溫度下可以降低細(xì)胞外溶質(zhì)的濃度，從而避免了在凍干過程中由于鹽類濃縮，使細(xì)胞失水而導(dǎo)致的菌體滲透性休克、細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的塌陷、蛋白質(zhì)變性等不良問題。

4.4 凍干后乳酸菌含水量對其存活率及儲藏期的影響

脫水程度的增加會造成乳酸菌蛋白質(zhì)損傷和存活率下降，所以應(yīng)該保留一部分水分來維持細(xì)胞的休眠狀態(tài)。目前有研究表明，乳酸菌冷凍干燥過程中，殘余的水分質(zhì)量在2%～3%對于維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)大分子穩(wěn)定性是必要的，菌體的相對存活率較高、儲藏期較長[11]。

5 討論與展望

影響乳酸菌真空冷凍干燥后存活率的因素是多方面的。①菌種的自身因素，因種、屬的差異而不同，如鏈球菌屬抗冷凍干燥能力較強，而明串菌屬對冷凍干燥的抵抗力較差；嗜冷微生物要比嗜熱微生物更加抗凍。②合理的凍干程序設(shè)定也非常重要，在真空冷凍干燥過程中存在兩個最大冰晶的生成帶，即-3.7 ～0 ℃和-37.4 ～-30.0 ℃，快速通過冰晶生成帶可以減少菌體的冷凍損傷[12]。為了提高乳酸菌凍干后的存活率，常常使用保護劑，保護劑可以維持乳酸菌凍干后的生物活性和生理狀態(tài)，通常復(fù)配使用效果更好。

綜上分析，要提高乳酸菌的凍干存活率和儲藏期，需要從兩個方面進行深入研究：①根據(jù)菌種特性以及真空冷凍干燥損傷機制設(shè)置合理的凍干程序；②篩選高效合理的凍干保護劑和復(fù)水溶劑，既要保證菌體的存活率和活性，也要降低成本。