人細胞內Ca2+對CD4+T細胞免疫功能調控作用的研究進展

麻芯茹，徐闖綜述，楊威，張冰冰審校

1.黑龍江八一農墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319

CD4+T淋巴細胞是人體免疫系統(tǒng)中重要的免疫細胞之一，該細胞在清除癌變組織和癌細胞過程中具有重要意義。研究表明，單純輸注CD4+T淋巴細胞可使接種血液或實體腫瘤細胞后的動物免于發(fā)??；該研究就CD8+T和CD4+T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷效果進行了比較，結果發(fā)現(xiàn)，CD4+T淋巴細胞具有更強的殺傷效果［1］。另外，CD4+T淋巴細胞還可激活巨噬細胞分泌IFNγ或NK細胞殺傷MHCⅡ類抗原陰性腫瘤細胞［2］。CD4+T淋巴細胞的功能取決于T細胞受體（T cell receptor，TCR），TCR的激活觸發(fā)了鈣從內質網釋放，進而影響其細胞周期進展和增殖［3］。

1 CD4+T淋巴細胞的分化及免疫功能

CD4+T淋巴細胞可被不同刺激因子激活，并分化成相應的T細胞亞群，根據(jù)產生的細胞因子差異，活化的CD4+T淋巴細胞主要分為Th1、Th2、Th17、濾泡輔助T細胞（T follicular helper cell，Tfh）及調節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）。Th1細胞可增強巨噬細胞介導的胞內病原體感染的免疫反應，介導細胞免疫應答；Th2細胞可刺激肥大細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的活化，發(fā)揮體液免疫作用，同時介導蠕蟲的免疫反應；Th17細胞主要針對細胞外細菌的免疫應答，可刺激多種細胞招募中性粒細胞至感染部位；Tfh細胞可刺激生發(fā)中心的B細胞成熟；Treg細胞可抑制免疫反應從而維持免疫穩(wěn)態(tài)。免疫細胞的激活取決于鈣信號，細胞內Ca2+失衡被認為是炎癥誘導劑［4］。Ca2+在免疫細胞的免疫應答反應中發(fā)揮重要作用，參與調控細胞內的信號轉導過程，因此細胞中的Ca2+濃度對維持免疫細胞的正常功能具有重要意義［5］。

2 鈣池引發(fā)的細胞內Ca2+進入

細胞內Ca2+是最重要的第二信使，對真核細胞的多種生物學過程至關重要，如參與肌肉收縮、基因表達、突觸傳遞、激素分泌、基因轉錄及細胞分裂、代謝和凝血等生理過程。機體缺血時，可通過調節(jié)Ca2+內流來影響神經元的凋亡、神經電信號傳導、血小板的生物學功能、激活炎癥小體等，因此，細胞內Ca2+濃度與細胞功能密切相關。正常靜息狀態(tài)下，細胞外Ca2+的濃度為10-3mol／L，細胞內Ca2+濃度為10-7mol／L，內質網Ca2+濃度為10-3mol／L，在細胞外空間和細胞質之間建立了巨大的Ca2+梯度（約20 000倍）。因此，即使在靜止的T細胞中，Ca2+流量的動態(tài)調節(jié)也會不斷發(fā)生，以維持該梯度。當T細胞被激活，細胞內Ca2+濃度持續(xù)增加，這是由內質網內Ca2+存儲庫的排空引起的。內質網的體積小，Ca2+儲量少，細胞內Ca2+減少會導致細胞質Ca2+濃度的升高速度降低，特別是在T細胞中，細胞激活后，儲存在內質網鈣池中的Ca2+被釋放，該過程為Ca2+釋放激活Ca2+通道（Ca2+release acticated Ca2+，CRAC）產生的，CRAC通道由鈣通道蛋白（calicum release activated calcium channel protein，ORAI）組成，這些ORAI具有較高的Ca2+選擇性，形成通道的Ca2+滲透孔。內質網上的基質相互作用分子（stromal interaction molecule，STIM）檢測到TCR刺激后使內質網Ca2+存儲減少，導致其構象變化和低聚，使STIM與ORAI通道并置，從而使Ca2+流入細胞，產生的Ca2+涌入稱為鈣庫操作性Ca2+通道（storeoperated Ca2+entry，SOCE）。因此，SOCE是一個基本過程，以確保連續(xù)獲得細胞外來源的Ca2+［2-7］。

內質網引發(fā)Ca2+通過SOCE調節(jié)免疫細胞，經肌漿／內質網Ca2+ATP酶（sarcoplasmic or endoplasmic reticulum Ca-ATPase，SERCAs）將胞漿Ca2+轉移回內質網，內腔Ca2+負荷傳遞至存儲SOCE的Ca2+傳感器STIM1上。STIM1通過其氨基末端結合Ca2+的內質Hand結構域來檢測Ca2+存儲的消耗，儲存耗竭觸發(fā)了通過EF-SAM區(qū)域在內質網中STIM1寡聚物的形成［8-9］，隨后在內質網-質膜結合處易位至離散的“點狀”，激活質膜內的Ca2+釋放，打開位于質膜上的ORAI1［10-11］。由于SOCE激活對多種細胞反應較重要，必須嚴格控制Ca2+進入方式，防止由于Ca2+大量流入引起的細胞毒性。

STIM蛋白是內質網中的單次跨膜受體（singletransmembrane receptor），在人類中具有2個同源物，即STIM1和STIM2，均有助于維持細胞內Ca2+的濃度，STIM2對Ca2+的親和力低于STIM1。ORAI是質膜上的Ca2+通道蛋白，包括3種類型（ORAI1～3型），在多種細胞中表達。ORAI1是重要的蛋白質之一，其功能喪失突變會導致CRAC通道失活，因此本文主要關注ORAI1蛋白質的結構基礎［12］。ORAI1包含4個跨膜結構域（transmembrane domain，TM），N和C-末端均位于胞質溶膠中。STIM1通過感應到內質網中Ca2+的消耗，導致構象變化，STIM1蛋白締合為二聚體和高階寡聚物，并轉移至內質網-質膜的連接處以激活ORAI1，該連接處被命名為STIM-ORAI激活區(qū)。研究表明，在人類中發(fā)生的ORAI1或STIM1突變、功能喪失或無效突變會導致免疫細胞（T、B和NK細胞）和非免疫細胞的SOCE功能嚴重受損或喪失［13］，從而導致嚴重的聯(lián)合免疫缺陷樣疾病，并伴有慢性感染、自身免疫、肌張力低下和牙齒發(fā)育的缺陷［14］。STIM1：ORAI1復合物的形成允許細胞外Ca2+進入，并促進內質網中Ca2+的再填充；內質網中Ca2+濃度的增加通過Ca2+與N-末端的結合提供了負反饋信號，減少STIM1點和SOCE的失活。

3 Ca2+信號對CD4+T淋巴細胞活化及增殖的調控作用

T細胞活化是指原始T細胞在接觸抗原后轉化為效應T細胞的過程。第1個關鍵步驟是通過抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）處理抗原，使抗原-MHC復合物在細胞表面表達，這些復合物與TCR的結合啟動了復雜的活化過程，使幼稚T細胞轉化為針對特定抗原的活化T細胞。STIM1是T細胞激活的關鍵早期效應蛋白，通過影響Ca2+的水平來調節(jié)免疫細胞的活化［15］。幼稚CD4+T淋巴細胞表達ORAI1、2和3，效應子淋巴細胞則主要表達ORAI1，研究顯示，敲除小鼠T細胞或人T細胞中的ORAI1基因會減弱細胞中的Ca2+內流，并嚴重阻礙小鼠或人的適應性免疫應答［16］。在T細胞的陽性選擇期間，細胞內Ca2+濃度有較大變化［17］，在T細胞陰性選擇時，細胞內會有大量Ca2+流入，若抑制細胞外Ca2+的內流則T細胞陰性選擇受阻［18］。有研究顯示，CRAC通道介導的Ca2+內流可調控T細胞內炎癥因子和趨化因子的表達［19］。

在CD4+T淋巴細胞中，抗原通過識別TCR誘導許多信號級聯(lián)反應和T細胞內的分子重新排列共同控制免疫反應，CRAC通道在TCR反應后被激活，從而激活磷脂酶C，磷脂酶C再介導肌醇1，4，5-三磷酸（InsP3）的生成。InsP3在胞質內迅速擴散，并與位于內質網的InsP3受體結合，該受體作為Ca2+通道，允許存儲在內質網腔內的Ca2+耗盡。從內質網中排空的Ca2+通過緩慢激活存儲操作的Ca2+通道，觸發(fā)外部Ca2+進入細胞。否則內質網內Ca2+的釋放不足以維持細胞內Ca2+的水平、細胞因子的產生及T細胞的活化［20］。TCR誘導的Ca2+升高激活了鈣調磷酸酶，磷酸酶將磷酸化轉錄因子NFAT磷酸化，進入細胞核內，使其發(fā)生易位與其靶基因結合。ORAI1或STIM1無效突變患者T細胞缺乏SOCE和IL-2的產生。IL-2為T細胞自分泌和旁分泌生長因子，可促進T細胞分化為明確的效應T細胞亞群［21］。

另外，鈣信號轉導還參與SOCE控制T細胞增殖和細胞周期，SOCE和鈣調神經磷酸酶通過代謝重編控制TCR誘導T細胞增殖。Ca2+和鈣調神經磷酸酶通過控制IL-2的產生或促進細胞周期的進展來調節(jié)T細胞增殖。

4 Ca2+信號對Th17／Treg細胞免疫功能的調控作用

近年研究證實，炎癥與人類肥胖、高血壓、血脂紊亂等多種代謝綜合征密切相關，其中Th17／Treg細胞及其相關細胞因子在代謝綜合征所致炎癥中作用機制成為研究熱點。Th17和Treg細胞在炎性疾病發(fā)展中有相反作用，兩者的平衡對免疫穩(wěn)態(tài)至關重要。在分化方面，IL-6與TGF-β可協(xié)同誘導Th17／Treg細胞的分化［22］，正常情況下TGF-β誘導初始CD4+T細胞叉頭樣轉錄因子3（forkhead transcription factor p 3，F(xiàn)oxp3）表達，進而分化為Treg細胞；IL-6則抑制Foxp3表達，介導信號傳導與活化轉錄因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）磷酸化，進而誘導維甲酸相關孤核受體γt（retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt）的表達和Th17分化，從而誘導以Th17為主的慢性炎性應答。另外，IL-21也可抑制TGF-β誘導Foxp3的表達，并與TGF-β共同在初始CD4+T細胞誘導分化Th17中發(fā)揮重要作用?；罨腡h17細胞通過STAT3信號分泌促炎因子IL-17、IL-6、IL-21及TNF-α等，可促進中性粒細胞、樹突狀細胞的增殖、成熟及趨化過程，誘導炎癥反應及自身免疫性疾病發(fā)生。Th17細胞還具有屏障保護作用，尤其在腸道中，Th17細胞可調節(jié)宿主對微生物群的反應并維持腸道穩(wěn)態(tài)［23］。Th17細胞參與了多種炎性疾病，如多發(fā)性硬化癥、炎性腸病、類風濕性關節(jié)炎和牛皮癬的致病機制［24］。過量的Th17細胞會引發(fā)嚴重的自體免疫疾病，鈣信號傳導通過調節(jié)線粒體功能來控制致病性Th17細胞介導的炎癥［25］。Treg可產生TGF-β和表達轉錄因子Foxp3，Treg細胞通過與細胞接觸和分泌抑制細胞因子如IL-10、TGF-β，IL-10與TGF-β 抑制炎癥因子的合成與釋放，從而起到抗炎的作用，表現(xiàn)出免疫抑制和自身免疫耐受功能［26］，在維持機體免疫平衡和自身耐受中發(fā)揮重要作用。Treg細胞負責調節(jié)免疫系統(tǒng)，保持對自身抗原的耐受性，預防自身免疫性疾病，Treg細胞可通過多種機制抑制效應T細胞增殖和細胞因子的產生，從而在限制免疫介導的炎癥反應中發(fā)揮重要作用［27］。Treg細胞參與了自身或非自身抗原引起的免疫反應負調控，如腫瘤免疫、器官移植、過敏和微生物免疫等［28］。

RORγt及FoxP3分別為Th17和Treg細胞的特異性轉錄因子，高濃度的TGF-β在幼稚CD4+T細胞中可誘導FoxP3表達，促使其分化為Treg細胞［16］。相反，TGF-β和IL-6增加STAT3-RORγt的信號轉導，從而促進Th17細胞分化［29］。STAT3對Th17的發(fā)育具有重要作用，已證明其可抑制Foxp3的表達，而Foxp3能夠結合Th17細胞中重要轉錄因子R ORγt，并抑制其轉錄活性，從而抑制初始T淋巴細胞向Th17細胞方向分化［30］。具有促炎作用的Th17細胞和具有免疫抑制作用的Treg細胞在功能上相互制約并存在動態(tài)平衡［31］，該平衡與肝炎、肺炎、腫瘤、移植等密切相關［32-35］。Ca2+內流導致腫瘤來源的外來體（tumor derived exosome，TEXE）選擇性激活人Treg細胞［36］，SOCE可激活多種Ca2+依賴性酶和轉錄因子，包括磷酸酶鈣調神經磷酸酶活化T細胞的核因子（nuclear factor of the activated T cell，NFAT），NFAT可調節(jié)許多細胞因子基因的轉錄，包括IL-17A、IL-21、IL-22和IFNg［37］。通過抑制STIM1減弱Th17細胞內Ca2+流入可顯著降低活化Th17細胞的STAT3表達，從而顯著降低其致炎性，但NFAT和STAT3在Th17細胞中的直接調控機制尚未明確。另外，抑制STIM1可導致Th17細胞中線粒體功能受損、降低氧化磷酸化相關基因的表達［38］及提高細胞內活性氧（reactive oxygen stke，ROS）水平，表明Ca2+內流是Th17細胞介導的多器官炎癥中線粒體功能和氧化應激的關鍵調節(jié) 劑［39-40］。有報道指出，SOCE介導的細胞內Ca2+升高還可活化NADPH氧化酶，促進線粒體脂肪酸氧化［41-42］。

5 小結

Ca2+作為細胞內重要的第二信使，在細胞的各種生理及病理活動中發(fā)揮著重要作用，與CD4+T細胞活化、增殖和免疫功能密切相關。目前已明確CD4+T淋巴細胞與脂肪肝、肝脂沉積、肝炎、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關，深入研究細胞內Ca2+對CD4+T免疫功能調控機制，將對多項臨床疾病新治療方案的深入研究起到關鍵作用。