CMTM6表達與肝細胞癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險相關(guān)性的研究

魏敬軍 王 之 戴沛軍 魏崇莉

原發(fā)性肝癌是中國發(fā)病率第4位的惡性腫瘤，也是第2位腫瘤致死病因。肝細胞癌（HCC）占原發(fā)性肝癌的85%～90%，手術(shù)切除是治療HCC的首選方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高是影響HCC患者預(yù)后的主要因素。近年來，免疫療法[特別是免疫檢查點抑制劑（ICI）的研發(fā)]在HCC治療中取得了較大進展。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，程序性細胞死亡蛋白-1抑制劑（抗PD-1單克隆抗體）和程序性細胞死亡蛋白-配體1抑制劑（抗PD-L1單克隆抗體）免疫療法在許多情況下比傳統(tǒng)療法更有效，具有持久的臨床反應(yīng)且不良反應(yīng)較溫和[1-2]。然而，很多患者對這類療法具有天然的抵抗力。研究表明，PD-1/PD-L1的表達與多種腫瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)[3]。近年來的研究顯示，腫瘤細胞表面表達的跨膜結(jié)構(gòu)域的趨化素樣因子6（CMTM6）蛋白可與PD-L1結(jié)合抑制免疫應(yīng)答，CMTM6可調(diào)控PD-L1的表達以保護PD-L1免受溶酶體介導(dǎo)的降解，還可增強腫瘤抑制免疫應(yīng)答的能力[4]。目前國內(nèi)尚未見CMTM6表達水平與HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的關(guān)系的相關(guān)研究報道，本研究就此進行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究選擇2019年4月至2020年7月中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院收治并行肝切除術(shù)的82例HCC患者，年齡40～65歲，平均年齡為（51.22±7.25）歲。納入標準：（1）符合《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標準》[5]中HCC的診斷標準；（2）HCC臨床分期為Ⅰb～Ⅲa期，經(jīng)單純手術(shù)或手術(shù)后接受放射治療、化學(xué)治療后獲得臨床完全緩解；（3）臨床資料完整；（4）肝功能Child-Pugh A～B級；（5）能夠配合隨訪；（6）簽署知情同意書。排除標準：（1）合并其他系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤者；（2）腫瘤復(fù)發(fā)再次手術(shù)者；（3）合并嚴重的心、肺、腎功能障礙無法耐受手術(shù)者。本研究獲得了醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)方法 所有患者均嚴格按照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2017年版）》[6]中肝癌切除術(shù)的治療規(guī)范進行手術(shù)治療；術(shù)前全面評估患者身體狀況和肝功能情況，嚴格把握肝癌切除術(shù)的適應(yīng)證；術(shù)后給予保肝、營養(yǎng)支持等治療，根據(jù)患者的術(shù)后病理結(jié)果酌情給予放射治療和（或）化學(xué)治療。

1.2.2 臨床資料收集 收集患者的臨床資料，包括性別、年齡、BMI、TNM分期、是否存在肝硬化、甲胎蛋白（AFP）水平、肝功能Child-Pugh分級、腫瘤最大直徑、癌結(jié)節(jié)數(shù)目、腫瘤包膜是否完整、手術(shù)切緣寬度、白蛋白（ALB）水平及腫瘤病理分化程度等。

1.2.3CMTM6 mRNA相對表達量檢測 采用熒光定量PCR法檢測CMTM6 mRNA的相對表達量。取腫瘤組織加入RIPA試劑裂解，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離單個核細胞（PBMC），分裝至200 μL EP管中，保存于-70 ℃冰箱。PBMC應(yīng)用胰蛋白酶消化后，使用TRIzol試劑盒（瑞士Roche公司）提取外周血PBMC的總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用PCR儀（美國BioRad公司）和SYBR Green Master Mix試劑盒[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系10 μL：100 ng/μL 的 cDNA 0.5 μL，SYBR Green Master Mix 5 μL，10 μmol/L 的正、反向引物各 0.4 μL，RNase-Free H2O 3.7 μL。PCR 反應(yīng)條件 ：95 ℃ 2 min ；95 ℃15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共 40 個循環(huán)。采用 2-△△Ct法計算CMTM6 mRNA的相對表達量。實驗重復(fù)3次取均值。以β-actin為內(nèi)參，引物均由天根生化科技（北京）有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 隨訪

術(shù)后隨訪1年，隨訪截止時間為2021年7月31日。術(shù)后每3個月復(fù)查CT或MRI，參照《實體瘤反應(yīng)評價標準、歐洲肝病學(xué)會和改良實體瘤反應(yīng)評價標準評價原發(fā)性肝癌化療栓塞效果一致性的比較》[7]中的相關(guān)療效標準判定腫瘤是否復(fù)發(fā)，將腫瘤相關(guān)死亡患者也歸為復(fù)發(fā)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用R（version 4.0.5）軟件和GraphPad Prism 9軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用卡方檢驗；等級資料采用秩和檢驗。應(yīng)用ggsurvplot程序包繪制生存曲線，分析不同CMTM6 mRNA表達水平的患者術(shù)后的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險。采用多因素logistic回歸模型分析HCC患者術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)的獨立危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隨訪結(jié)果及2組患者臨床病理特征的比較

截至2021年7月31日，所有患者均完成隨訪，有34例（41.46%）患者復(fù)發(fā)，據(jù)此將患者分為復(fù)發(fā)組（34例）和未復(fù)發(fā)組（48例）。比較復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組的臨床病理特征，結(jié)果顯示復(fù)發(fā)組中AFP＞400 ng/mL患者占比、肝硬化患者占比、腫瘤低分化患者占比、ALB＜35 g/L患者占比均高于未復(fù)發(fā)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 兩組的臨床病理特征比較

2.2 2組患者腫瘤組織中CMTM6 mRNA的相對表達量比較

如圖1所示，復(fù)發(fā)組患者的腫瘤組織中CMTM6 mRNA的相對表達量（1.88±0.24）高于未復(fù)發(fā)組（1.42±0.26），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝ 6.162，P＜0.001）。

圖1 2組患者腫瘤組織中CMTM6 mRNA的相對表達量比較

2.3 不同CMTM6 mRNA表達水平的患者的術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險比較

以CMTM6 mRNA相對表達量的中位數(shù)（1.64）作為最佳截斷值，高表達組41例，其中22例（53.66%）復(fù)發(fā)，低表達組41例，其中12例復(fù)發(fā)（29.27%），2組的復(fù)發(fā)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝5.024，P＝0.025）。繪制生存曲線，分析結(jié)果顯示，高表達組的術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險明顯高于低表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（log-rankχ2＝5.782，P＝0.016）。見圖2。

圖2 不同CMTM6 mRNA表達水平的患者的術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險比較

2.4 HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素分析

將存在差異的因素賦值（表3）后帶入多因素logistic回歸模型，結(jié)果顯示AFP＞400 ng/mL（OR＝65.263）、肝硬化（OR＝3.166）、腫瘤低分化（OR＝21.005）、ALB＜35 g/L（OR＝14.995）、CMTM6 mRNA高表達（OR＝89.751）均是HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表4。

表3 相關(guān)因素賦值

表4 HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素的logistic回歸模型分析

3 討論

HCC起病隱匿且較易發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者確診時多為中晚期，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。HCC在全球腫瘤相關(guān)死亡原因中居第4位[8]。近年來在HCC治療領(lǐng)域的新進展層出不窮，其中免疫抑制劑引人矚目。然而，有研究報道，有相當(dāng)一部分患者在使用免疫抑制劑時存在免疫不應(yīng)答現(xiàn)象，原因可能包括機體免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的識別不充分，免疫效應(yīng)細胞在腫瘤微環(huán)境浸潤不足等[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，CMTM6作為一種跨膜蛋白，在多種腫瘤細胞表面均有表達[4]?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，CMTM6表達水平下降可使PD-L1表達下調(diào)，進而導(dǎo)致腫瘤免疫抑制能力降低[10]。由此可見，研究CMTM6在HCC組織中的表達水平對于預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)具有重要意義。

本研究共納入82例HCC患者，均接受肝切除手術(shù)，術(shù)后均隨訪1年，共有34例患者復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)組中AFP＞400 ng/mL患者占比、肝硬化患者占比、腫瘤低分化患者占比、ALB＜35 g/L患者占比，以及腫瘤組織中CMTM6 mRNA的相對表達量均高于未復(fù)發(fā)組。多因素logistic回歸模型分析結(jié)果顯示，AFP＞400 ng/mL、肝硬化、腫瘤低分化、ALB＜35 g/L、CMTM6 mRNA高表達均是HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險因素。腫瘤分化程度可反映腫瘤的生物學(xué)特性，且其與腫瘤細胞的侵襲性密切相關(guān)，腫瘤細胞分化程度越低則侵襲性越強，雖然切除了腫瘤組織，但由于腫瘤細胞增殖能力較強，易突破包膜向周圍組織浸潤，故在疾病早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移。血清AFP水平升高在臨床上被視為術(shù)后早期復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因素[11]，AFP在抑制和促進腫瘤細胞生長的過程中均發(fā)揮著重要作用，其可通過改變CD4+、CD8+T細胞亞群的比例誘導(dǎo)T細胞凋亡，進而抑制機體的免疫功能。ALB是反映機體營養(yǎng)狀態(tài)、肝臟合成功能的一項重要指標，ALB水平較低提示患者肝臟有不可逆的損傷，術(shù)后易復(fù)發(fā)。肝硬化患者的肝臟合成代謝功能較差，對于免疫抑制劑的反應(yīng)較差，使患者術(shù)后較易復(fù)發(fā)[12]。

研究表明，不同的腫瘤組織中CMTM6的表達水平存在差異，其在胰腺癌、尿路上皮癌和卵巢癌組織中呈高表達，而在膠質(zhì)瘤、肺癌、黑色素瘤組織中呈低表達[13-14]。CMTM6可通過多種方式參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，其可正向調(diào)控部分抑制T細胞的信號通路，還可負向調(diào)控細胞毒性T細胞的分化及其殺傷腫瘤細胞的作用[15]。本研究結(jié)果顯示，CMTM6 mRNA高表達是HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險因素，高表達患者術(shù)后1年內(nèi)的復(fù)發(fā)風(fēng)險較低表達患者高。動物實驗表明，移植沉默CMTM6基因的黑色素細胞瘤的小鼠的生存期明顯長于移植野生型CMTM6基因的黑色素瘤的小鼠，表明CMTM6基因的缺失抑制了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，CMTM6可通過保護PD-L1進而使腫瘤細胞實現(xiàn)免疫逃逸[16]。在HCC與CMTM6的關(guān)系方面，有研究報道HCC組織中CMTM6的表達水平高于癌旁組織，且CMTM6與肝細胞增殖標志物CK8、CK18共同表達[17]。此外，關(guān)于CMTM6與PD-L1的關(guān)系方面，有研究報道CMTM6 耗竭可改善PD-L1介導(dǎo)的T細胞抑制，表明PD-L1因依賴CMTM6而有效發(fā)揮其抑制 T 細胞的功能，這為阻斷該通路提供了一種新的潛在靶點[18-19]。

綜上所述，CMTM6高表達與HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)有顯著相關(guān)性，CMTM6可能是潛在的HCC患者的預(yù)后預(yù)測指標和治療靶點。本研究的樣本量較小且隨訪時間較短，存在一定的局限性，今后需增大樣本量，延長隨訪時間以進一步驗證本研究結(jié)論。此外，CMTM6在分子水平的具體作用機制尚需進一步探討。