結腸癌組織中HIF-1α和FoxM1的表達及其與臨床病理特征和預后關系的研究

萬 里 程如煥 鄒紹靜 邱 振 王昌成

結腸癌是一種臨床上常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均較高，給患者的生命安全帶來巨大威脅[1]。結腸癌起病隱匿，缺乏典型的早期癥狀，多數(shù)患者確診時已為晚期。目前臨床上主要采用姑息性手術、放射治療和化學治療等方式治療腫瘤轉(zhuǎn)移患者，但其5年生存率仍然＜10%[2]。探究與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關的指標，有助于臨床擬定治療方案并改善預后。缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）是一種適應性調(diào)節(jié)因子，可在缺氧狀態(tài)下產(chǎn)生，與結腸癌的臨床病理特征密切相關[3]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1（FoxM1）主要通過調(diào)節(jié)紡錘體的形成和細胞周期在細胞增殖過程中發(fā)揮作用。研究表明，F(xiàn)oxM1可通過逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制結腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[4]。目前關于結腸癌組織中HIF-1α和FoxM1的表達與預后關系的報道較少。本文探究了80例結腸癌患者組織中HIF-1α和FoxM1的表達水平及其與臨床病理特征和預后的關系，以期為改善患者的預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月至2021年3月徐州醫(yī)科大學附屬淮安醫(yī)院及洪澤區(qū)人民醫(yī)院收治的80例行手術切除治療的結腸癌患者作為研究對象，術中采集患者的結腸癌組織和癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞5 cm的正常組織）。80例患者中男51例，女29例；年齡21～82歲，平均年齡為（52.73±10.25）歲。納入標準：（1）符合《結腸癌規(guī)范化診療指南（試行）》[5]中結腸癌的診斷標準，且經(jīng)病理檢查確診；（2）均行結腸癌切除術治療；（3）術前未進行放射治療或化學治療；（4）均簽署知情同意書。排除標準：（1）合并結締組織??；（2）合并其他惡性腫瘤；（3）妊娠期或哺乳期孕婦；（4）合并自身免疫?。唬?）伴有精神疾病、凝血功能障礙；（6）術前發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移者；（7）合并心、肝、腎等重要器官功能障礙。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批件號 20171225）。

1.2 HIF-1α和FoxM1表達水平的檢測

采用免疫組織化學法檢測HIF-1α和FoxM1的表達水平。收集80例患者的結腸癌組織和癌旁組織標本，使用4%甲醛溶液固定，隨后脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片（厚度約4 μm）、微波修復，隨后實施血清封閉。30 min后加入兔抗人HIF-1α、FoxM1單克隆抗體（購自美國Abcam公司）與鏈霉素親和素-生物素復合物，4 ℃孵育過夜，使用磷酸緩沖鹽溶液沖洗，滴加二氨基聯(lián)苯顯色液，蘇木精復染，脫水、透明、封片。免疫組織化學試劑盒購自上海羽哚生物科技有限公司。陽性細胞判斷標準：以細胞核、細胞膜或細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕褐色、棕黃色或黃色記為陽性。HIF-1α主要位于細胞核，F(xiàn)oxM1主要位于細胞漿。根據(jù)染色強度和陽性細胞數(shù)量評估陽性表達情況。染色強度評分標準：無色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。陽性細胞數(shù)量評分標準：＞50%記3分，25%～50%記2分，5%～25%記1分，＜5%記0分?？偡郑饺旧珡姸仍u分×陽性細胞數(shù)量評分，0～1分為陰性，≥2分為陽性。所有患者均由2名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師采用雙盲法獨立閱片，意見不同時協(xié)商一致。

1.3 臨床資料收集

收集患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、TNM分期、分化程度、有無淋巴結轉(zhuǎn)移、有無神經(jīng)侵襲、腫瘤直徑及有無脈管癌栓等。

1.4 觀察指標

（1）免疫組織化學染色結果；（2）比較結腸癌組織與癌旁組織中HIF-1α和FoxM1的表達水平；（3）分析結腸癌組織中HIF-1α和FoxM1的表達水平與臨床病理特征的關系；（4）分析結腸癌組織中HIF-1α與FoxM1表達水平的相關性。

1.5 隨訪

在術后即刻開始為期1年的隨訪，隨訪截止時間為2022年3月31日，每月隨訪1次。采用門診復查的方式進行隨訪，記錄患者的無進展生存情況，以腫瘤復發(fā)或轉(zhuǎn)移、患者死亡及隨訪時間截止作為終點事件。

1.6 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman等級相關檢驗分析結腸癌組織中HIF-1α與FoxM1表達水平的相關性，rs值越大表示相關性越強。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rankχ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌組織和癌旁組織中HIF-1α和FoxM1的表達水平比較

由表1可知，結腸癌組織中HIF-1α和FoxM1的陽性表達率均高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。免疫組織化學染色結果顯示，HIF-1α在結腸癌組織中呈局部高表達，在癌旁組織中呈局部低表達或不表達；FoxM1在結腸癌組織中表現(xiàn)為細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色，少量位于細胞核，大量位于細胞漿，而其在癌旁組織中表現(xiàn)為局部低表達或不表達。見圖1。

圖1 結腸癌組織和癌旁組織中HIF-1 和FoxM1表達病理圖 免疫組織化學染色法 ×100 A 結腸癌組織中FoxM1高表達 B 癌旁組織中FoxM1低表達 C 結腸癌組織中HIF-1 高表達 D 癌旁組織中HIF-1 低表達

表1 結腸癌組織和癌旁組織中HIF-1 和FoxM1的表達水平比較/例（%）

2.2 結腸癌組織中HIF-1α和FoxM1的表達水平與臨床病理特征的關系

由表2可知，不同年齡、性別、腫瘤直徑，以及有無脈管癌栓的結腸癌患者組織中HIF-1α和FoxM1的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結轉(zhuǎn)移、無神經(jīng)侵襲、浸潤深度為T3～T4的結腸癌患者組織中HIF-1α和FoxM1的陽性表達率分別高于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、無淋巴結轉(zhuǎn)移、有神經(jīng)侵襲、浸潤深度為T1～T2的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

表2 結腸癌組織中HIF-1 和FoxM1的表達水平與臨床病理特征的關系/例（%）

2.3 結腸癌組織中HIF-1α與FoxM1表達的相關性

Spearman等級相關檢驗分析結果顯示，結腸癌組織中HIF-1α與FoxM1的表達水平呈正相關（rs＝0.756，P＝0.002），見表 3。

表3 結腸癌組織中HIF-1 與FoxM1表達的相關性

2.4 結腸癌組織中HIF-1α和FoxM1的表達水平與患者預后的關系

80例患者隨訪1年，其中有4例失訪。HIF-1α陽性患者的中位無進展生存期為7.65個月（95%CI：3.73～8.56），低于 HIF-1α陰性患者[8.79個月（95%CI：4.35～9.87）]，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝21.933，P＜0.001），見圖 2。FoxM1 陽性患者的中位無進展生存期為7.81個月（95%CI：3.82～8.43）， 低 于 FoxM1陰 性 患 者 [8.92個 月（95%CI：5.13～10.96）]，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝31.829，P＜0.001），見圖3。

圖2 HIF-1 陽性和陰性患者的無進展生存情況

圖3 FoxM1陽性和陰性患者的無進展生存情況

3 討論

流行病學調(diào)查結果顯示，結腸癌的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，嚴重威脅人們的生命安全[6]。目前結腸癌的發(fā)病機制尚未明確，可能與生活環(huán)境、遺傳、腸道微生態(tài)、生活習慣等多種因素相關[7]。結腸癌的發(fā)病通常需經(jīng)歷腸化生、不典型增生、腺癌、原癌、進展期癌等階段，且不同階段特異性分子事件的發(fā)生情況不同。因此，深入分析結腸癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制有助于該疾病的預防和診治。

本研究結果顯示，結腸癌組織中HIF-1α和FoxM1的陽性表達率均高于癌旁組織，這提示HIF-1α和FoxM1在結腸癌發(fā)生過程中起促癌作用。研究表明，在正常氧濃度下，HIF-1α快速降解，而在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α水平快速升高，HIF-1α過表達會促進誘導型一氧化氮合酶、促紅細胞生成素、血管生長因子、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白等大量低氧反應基團結合，并有助于這些蛋白和基團的轉(zhuǎn)錄，促使腫瘤細胞在缺氧狀態(tài)下迅速增殖，并促進腫瘤的轉(zhuǎn)移及新生血管的生成[8-9]。另有報道指出，HIF-1α可通過激活人鞘氨醇激酶-1/1-磷酸鞘氨醇（SphK1/S1P）信號通路和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路介導瘤體內(nèi)生成新生血管，并可增強腫瘤細胞的活性，從而導致腫瘤惡變[10]。FoxM1是一種細胞增殖特異性的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控細胞周期蛋白D1、25A/25B等，參與調(diào)節(jié)細胞代謝、增殖、分化等多種生理過程，已成為治療惡性腫瘤的新靶點[11]。研究表明，F(xiàn)oxM1表達上調(diào)可引起腫瘤細胞中紡錘體缺陷，導致細胞周期停滯，進而誘導細胞死亡[12]。另有報道指出，F(xiàn)oxM1在卵巢癌、結直腸癌、乳腺癌、胰腺癌等惡性腫瘤中高表達，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成顯著相關[13-16]。本研究結果顯示，結腸癌組織中HIF-1α和FoxM1的表達水平與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、有無脈管癌栓無關，而與TNM分期、分化程度、有無淋巴結轉(zhuǎn)移、有無神經(jīng)侵襲及浸潤深度密切相關，這提示HIF-1α和FoxM1可能參與了結腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。有研究表明，結腸癌組織中HIF-1α的表達水平與腫瘤分化程度、腫瘤直徑、遠處轉(zhuǎn)移、臨床分期等病理特征密切相關[17]。另有研究表明，結腸癌組織中FoxM1的表達水平與臨床分期、腫瘤直徑及有無淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關，且FoxM1的陽性表達率高可能提示預后不良的風險較高[18]。本研究結果顯示，結腸癌組織中HIF-1α與FoxM1的表達水平呈正相關；此外，HIF-1α陽性患者的中位無進展生存期低于HIF-1α陰性患者，且FoxM1陽性患者的中位無進展生存期低于FoxM1陰性患者，這提示HIF-1α陰性和FoxM1陰性患者的預后較好。

綜上所述，結腸癌患者組織中HIF-1α和FoxM1的陽性表達率與TNM分期、分化程度、有無淋巴結轉(zhuǎn)移、有無神經(jīng)侵襲及浸潤深度密切相關，且與患者的預后有關。本研究納入的樣本量偏小，可能使研究結果存在偏倚，今后需擴大樣本量并深入進行基礎研究，分析HIF-1α和FoxM1的表達水平影響結腸癌患者預后的具體作用機制。