胡蜂蜂毒肽對干燥綜合征大鼠的作用探究

謝琳峰， 陳雅凝， 朱 靖， 林仁貴， 黃慧鐘

( 1. 莆田學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 福建 莆田 351100；2. 莆田學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 福建 莆田 351100；3. 莆田學(xué)院附屬醫(yī)院 急診重癥監(jiān)護(hù)科， 福建 莆田 351100 )

0 引言

干燥綜合征(Sj?gren's syndrome，SS) 是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病， 主要累及外分泌腺， 患者臨床表現(xiàn)為口干、 眼干， 常并發(fā)多種器官損害[1]。 一般認(rèn)為干燥綜合征的發(fā)病機(jī)制包括性激素異常、 免疫功能異常以及環(huán)境、 遺傳或病毒感染等[2]。 有一些研究結(jié)果表明， 腎上腺皮質(zhì)激素分泌不足導(dǎo)致干燥綜合征的發(fā)生[3]。另外有研究通過對干燥綜合征患者與正常人群的血清及唾液代謝組學(xué)比較分析發(fā)現(xiàn)， 干燥綜合征患者存在血清酪氨酸水平降低的情況[4-5]。

目前對于干燥綜合征， 可使用人工唾液或人工淚液改善口干、 眼干癥狀， 尚無特異性治療干燥綜合征的藥物， 一般采用糖皮質(zhì)激素來調(diào)節(jié)患者的全身免疫狀態(tài)[6]。 然而長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素具有許多不良反應(yīng)， 因此需要探索是否有一些天然藥物可以替代激素來治療干燥綜合征。

有研究表明蜂毒具有一定的抗炎作用[7]，100 μg·mL-1胡蜂毒的抗炎效果是地塞米松的10倍[8]。 蜂毒肽(melittin，MEL)作為蜂毒的最主要成分， 大約占蜂毒的50%[9]， 是蜂毒主要的藥理作用及生物活性來源， 有抗腫瘤、 抗菌、 抗炎、 抗輻射、 抗癌等藥理作用[10]。 研究表明用蜂毒配合中醫(yī)療法， 對干燥綜合征具有一定的干預(yù)效果[11]， 同時蜂毒肽可以促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素的釋放， 從而調(diào)節(jié)干燥綜合征患者體內(nèi)的免疫功能[12]。

本研究通過抗原誘導(dǎo)法建立干燥綜合征大鼠模型， 用肌肉注射胡蜂蜂毒肽的方法進(jìn)行干預(yù)，并用氫化可的松作為陽性對照， 期間對大鼠唾液分泌量、 淚液分泌量及血清中酪氨酸含量進(jìn)行測定， 以評估胡蜂蜂毒肽對干燥綜合征大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

健康的、 無眼部疾病的6～7 周的雄性Wistar大鼠(由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)有限責(zé)任公司提供，清潔級)， 質(zhì)量約為200 g； 胡蜂蜂毒肽(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，M119008)， 純度≥97% (高效液相色譜法)； 氫化可的松(上海滕準(zhǔn)生物科技有限公司，H811182)； 弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、 生理鹽水及BCA 微量蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)； 淚液檢測濾紙條(衡水格領(lǐng)商貿(mào)有限公司，YN-LZ-1)。

1.2 頜下腺蛋白的制備和濃度的測定

采用脫位法處死Wistar 大鼠。 切除頜下腺，切除頜下腺上的包膜和結(jié)締組織[13]。 頜下腺組織用生理鹽水清洗， 置于4℃生理鹽水中， 研磨成勻漿， 并保持 4 h。 用離心機(jī) 2 000 r·min-1離心10 min， 收集上清液。 BCA 試劑盒檢測頜下腺蛋白濃度， 為 16.252 mg·mL-1。

1.3 干燥綜合征大鼠模型建立

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。 隨機(jī)挑選18 只雄性的清潔級Wistar 大鼠分為: A 組， 正常組； B組， 陰性對照組； C 組， 陽性對照組(糖皮質(zhì)激素組)， 糖皮質(zhì)激素采用氫化可的松； D 組， 蜂毒肽高劑量組； E 組， 蜂毒肽中劑量組； F 組，蜂毒肽低劑量組。 每組3 只大鼠。

A 組Wistar 大鼠不進(jìn)行造模。 對其他各組大鼠， 在第1 d 和第4 d 在腹腔內(nèi)進(jìn)行皮下注射頜下腺蛋白和弗氏完全佐劑乳化液(各0.1 mL，頜下腺蛋白的最終濃度為0.325 mg·mL-1)的實(shí)驗(yàn)[14]。 第8 d， 再次在腹部皮下注射頜下腺蛋白和弗氏不完全佐劑乳化液(各0.1 mL，頜下腺蛋白的最終濃度為0.163 mg·mL-1)[15]。

1.4 給藥

各組實(shí)驗(yàn)大鼠在造模后1 d 開始用藥(肌肉注射，每組大鼠每天注射一次，連續(xù)給藥3 d): A組和B 組每只大鼠按0.1 mL·kg-1·d-1注射生理鹽水； C 組， 每只大鼠注射氫化可的松 15 mg·kg-1·d-1； D 組， 每只大鼠注射蜂毒肽0.437 5 mg·kg-1·d-1； E 組每只大鼠注射蜂毒肽 0.262 5 mg·kg-1·d-1； F 組， 每只大鼠注射蜂毒肽 0.087 5 mg·kg-1·d-1。[16]

1.5 各項(xiàng)指標(biāo)的測定

治療開始 0、 1、 2、 3 d 分別檢測唾液分泌量和淚液分泌量。 唾液分泌量: 在測量前對處理過的干燥的脫脂棉球進(jìn)行稱重， 后將稱重后的棉球塞至各大鼠口內(nèi)， 待3 min 后， 稱取棉球濕重。

唾液分泌量(g)＝棉球濕重-棉球干重

淚液分泌量: 采用淚液分泌實(shí)驗(yàn)， 將淚液檢測濾紙條對半折疊并切割。 需要注意是大鼠的下眼瞼比人類的淺， 應(yīng)將濾紙條前端剪短， 并修剪成圓弧彎曲， 將前端彎曲后置于大鼠下眼瞼中，待5 min 后， 測量濾紙條的濕潤長度。

血清中酪氨酸表達(dá)水平檢測: 用熒光分光光度法檢測大鼠血清中酪氨酸的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSSPRO 統(tǒng)計(jì)軟件處理， 計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)， 若滿足正態(tài)分布和方差齊性， 則采用方差分析“”進(jìn)行多組比較。 采用效應(yīng)量化分析法對前后數(shù)據(jù)差異性進(jìn)行比較。 方差不齊者， 進(jìn)行多獨(dú)立樣本克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis 檢驗(yàn))。P＜0.05， 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模前后大鼠狀態(tài)對比

造模前后大鼠體重、 唾液分泌量、 淚液分泌量對比見表1， 結(jié)果表明每組大鼠在造模后的唾液分泌量均明顯低于造模前的唾液分泌量， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)， 而造模前后大鼠的體重和淚液分泌量都無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

表1 造模前后大鼠體重、 唾液分泌量、 淚液分泌量對比

2.2 治療前后唾液分泌量檢測結(jié)果

治療前后各組大鼠唾液分泌量變化情況見表2。 Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)結(jié)果顯示， 治療 3 d 后，與 B 組、 F 組相比， C 組、 D 組、 E 組的唾液分泌量顯著增多， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，與A 組的唾液分泌量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

表2 治療前后各組大鼠唾液分泌量變化情況(，n＝3)g

表2 治療前后各組大鼠唾液分泌量變化情況(，n＝3)g

images/BZ_43_472_2320_2014_2378.pngA 組 0.050±0.020 0.090±0.036 0.120±0.035 0.100±0.020 B 組 0.040±0.020 0.057±0.025 0.097±0.023 0.083±0.015 C 組 0.043±0.032 0.110±0.053 0.080±0.026 0.113±0.006 D 組 0.043±0.035 0.090±0.010 0.100±0.046 0.120±0.044 E 組 0.057±0.006 0.110±0.044 0.133±0.021 0.110±0.035 F 組 0.037±0.029 0.093±0.071 0.067±0.015 0.083±0.029

2.3 治療前后淚液分泌量檢測結(jié)果

治療前后各組大鼠左眼淚液分泌量變化情況見表 3。 C 組、 D 組、 E 組治療后左眼淚液分泌量顯著升高， 組內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0. 05)； A 組、 B 組、 F 組左眼淚液分泌量治療前后無明顯變化， 組內(nèi)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0. 05)。 Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)結(jié)果顯示， 治療 3 d 后， D 組、 E 組左眼淚液分泌量顯著高于 A 組、 B 組、 C 組、 F 組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠左眼淚液分泌量變化情況(，n＝3)mm

表3 各組大鼠左眼淚液分泌量變化情況(，n＝3)mm

images/BZ_43_472_2803_2014_2861.pngA 組 6.667±4.163 2.500±2.784 6.167±1.756 4.333±1.528 B 組 4.667±3.512 6.833±4.646 6.400±6.023 3.667±2.517 C 組 2.667±4.619 1.000±1.528 3.500±3.014 3.000±2.517 D 組 4.333±3.786 4.167±4.368 6.067±2.759 7.000±3.606 E 組 4.000±4.000 6.133±2.419 3.900±2.081 8.333±4.726 F 組 6.000±3.786 0.500±3.905 1.000±1.155 3.000±2.255

治療前后各組大鼠右眼淚液分泌量變化情況見表 4。 A 組、 C 組、 E 組、 F 組治療后右眼淚液分泌量顯著升高， 組內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)； B 組、 D 組治療前后右眼淚液分泌量無明顯變化， 組內(nèi)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)結(jié)果顯示， 治療 3 d 后， A 組、E 組、 F 組右眼淚液分泌量顯著高于 B 組、 C 組、D 組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

表4 各組大鼠右眼淚液分泌量變化情況(，n＝3)mm

表4 各組大鼠右眼淚液分泌量變化情況(，n＝3)mm

images/BZ_44_472_799_2014_857.pngA 組 4.000±3.000 3.000±1.528 7.400±2.793 12.000±3.786 B 組 4.000±3.000 7.000±1.732 10.167±2.255 5.000±2.000 C 組 1.000±4.359 1.000±0.866 3.000±1.000 3.500±3.014 D 組 3.000±4.359 1.000±6.500 6.000±5.000 4.000±4.726 E 組 2.000±2.000 3.800±6.087 3.000±2.646 9.500±5.766 F 組 4.000±1.323 1.000±1.212 4.000±2.754 8.000±2.466

2.4 血清檢測結(jié)果

在治療結(jié)束之后， 大鼠血清中酪氨酸檢測結(jié)果分別為: A 組， 0.142±0.006 mg·mL-1； B 組，0.101± 0.052 mg·mL-1； C 組， 0.165± 0.024 mg·mL-1； D 組， 0.155 ± 0.009 mg·mL-1； E組， 0.156 ± 0.025 mg · mL-1； F 組， 0.115 ±0.006 mg·mL-1。 Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，與B 組相比， C 組、 D 組及E 組的血清酪氨酸水平顯著增高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)； 與A 組相比， C 組、 D 組及 E 組的血清酪氨酸水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

在多種因素作用下， 機(jī)體的體液免疫系統(tǒng)異常， 導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的浸潤， 使得唾液腺、 淚腺等腺體發(fā)生損害， 從而引發(fā)干燥綜合征[17]。 干燥綜合征常有口干、 眼干、 唾液腺腫大等臨床表現(xiàn)， 初期癥狀不易察覺， 容易誤診。 糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑可緩解干燥綜合征引起的癥狀并降低組織器官損害， 但是病情易反復(fù)， 有局限性[18]。 在中醫(yī)學(xué)里， 干燥綜合征屬于 “燥證”“頑痹” “燥毒證” 或 “虛勞” 的范疇[19]。 蜂毒療法屬于中醫(yī)治療的一種， 可以使患者血?dú)馔〞常?對痹癥一類有良好的治療效果， 且就治療效果而言， 胡蜂蜂毒相比于蜜蜂蜂毒更加顯著。 胡蜂毒素提取物常被用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[20]?！吨腥A人民共和國藥典》 2015 版將胡蜂酒作為民族藥收載， 并注明胡蜂酒具有祛風(fēng)除濕的作用[21]。 前期的文獻(xiàn)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)， 胡蜂蜂毒肽具有抗炎、 鎮(zhèn)痛、 調(diào)節(jié)免疫功能等作用， 可用于風(fēng)濕免疫病的治療[22]， 有著良好的應(yīng)用前景。

干燥綜合征的造模方法有很多， 如蛋白抗原誘導(dǎo)的SS 模型、 多肽抗原誘導(dǎo)的SS 模型、 去勢誘導(dǎo)的干眼癥模型、 基因誘導(dǎo)的 SS 模型等[23-25]， 本實(shí)驗(yàn)用蛋白抗原誘導(dǎo)法造模。 通過唾液或淚液分泌量檢測判斷是否造模成功。 由表1可知， 雖然造模前后淚液分泌量變化不顯著， 但是唾液分泌量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)， 可以看到經(jīng)過蛋白抗原誘導(dǎo)的大鼠唾液分泌量明顯降低， 說明蛋白抗原誘導(dǎo)法造模成功。 從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果看， 蛋白抗原誘導(dǎo)法對大鼠的唾液腺影響更大， 短期對淚腺的影響并不顯著。

由表2 可知， 中劑量、 高劑量的蜂毒肽與糖皮質(zhì)激素對改善口干癥狀的治療效果相當(dāng)， 且與B 組以及低劑量組的唾液分泌量相比都有所改善。 但是從短期來看， 改善效果不穩(wěn)定， 可能是因?yàn)橹委煏r間過短， 治療效果還未完全顯現(xiàn)， 或與治療組的大鼠體內(nèi)藥物代謝速度有關(guān)。

由表3、 表4 可知， E 組的左眼和右眼淚液分泌量在治療3 d 后均顯著高于 B 組、 C 組， 也高于D 組、 F 組， 說明中等劑量的蜂毒肽對眼干癥狀改善效果最明顯。 B 組在沒有治療的情況下， 雖然3 d 的淚液分泌功能有減退的趨勢， 但仍比C 組更好， 可能是由于造模方法對大鼠淚液腺的影響更小， 也可能與大鼠每天淚液分泌情況本就不穩(wěn)定有關(guān)， 因此需要長期觀察， 才能得到更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

由大鼠血清中酪氨酸檢測結(jié)果可知， 通過糖皮質(zhì)激素與中等劑量蜂毒肽治療后大鼠的血清酪氨酸水平顯著高于B 組， 說明血清中酪氨酸水平可能影響干燥綜合征的干燥癥狀。 雖然蜂毒肽低劑量組對提高血清酪氨酸水平并不明顯， 但是隨著劑量的增加， 蜂毒肽的治療效果逐漸增強(qiáng)，可與氫化可的松的治療效果等同， 但在達(dá)到某種劑量后， 蜂毒肽對血清酪氨酸水平影響不會因劑量的增大而升高。

本實(shí)驗(yàn)的局限性是未能長期觀察大鼠的治療效果， 而且由于條件的限制， 未能檢測治療前大鼠血清酪氨酸水平， 包括 TNF-α、 血清 lgG、 5-羥色胺等標(biāo)志物[26]， 需要改進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、 提高檢測能力來進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用同種鼠頜下腺蛋白抗原誘導(dǎo)大鼠干燥綜合征造模， 同時分組進(jìn)行不同劑量胡蜂蜂毒肽的干預(yù)， 并與陰性、 陽性對照組比較， 推測中等劑量的胡蜂蜂毒肽可能通過上調(diào)血清中的酪氨酸水平來改善干燥綜合征大鼠的口干癥狀。 但本實(shí)驗(yàn)樣本量偏少， 因此需要更多的樣本量來進(jìn)一步驗(yàn)證。