乙酰左旋肉堿對高鋅誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞凋亡的影響

楊慶穩(wěn),雍 康，張 怡，賀閃閃，楊鈞杰,彭津津，聶青玉，吳有華*

(1.重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶 萬州 404155；2.廣東海洋大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

鋅(zinc，Zn)是生物體必需的微量元素，其參與了機體大部分生理過程，如線粒體呼吸、免疫防御、DNA復(fù)制合成和鐵代謝等[1]。然而，Zn一旦攝入過量可引起動物發(fā)生急慢性中毒[2]。研究指出，Zn毒性主要是通過在細(xì)胞中產(chǎn)生過量自由基以及激活NADPH氧化酶和一氧化氮合酶，同時抑制糖酵解和三羧酸循環(huán)相關(guān)酶，損傷線粒體中的電子傳遞鏈并加強質(zhì)子漏，進(jìn)而影響細(xì)胞正常代謝[3-4]。在實際養(yǎng)殖中發(fā)現(xiàn)，部分養(yǎng)殖戶會在飼料中添加高水平的Zn以達(dá)到促生長的目的[5]。已有研究證實，長期使用高Zn飼料可增加動物體內(nèi)Zn的積累，進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟、腎臟以及胰臟等組織發(fā)生病理變化，發(fā)生表觀中毒病征[6-7]。

乙酰左旋肉堿(acetylL-carnitine，ALC)是機體中的一種左旋肉堿衍生物，可幫助脂肪酸進(jìn)入線粒體并產(chǎn)生ATP[8]。據(jù)報道，ALC具有抗氧化、抗炎以及促進(jìn)能量代謝等作用[8-9]，但其在Zn毒性中的作用及其機制仍鮮有報道。因此，本研究選用豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)作為實驗對象，采用ALC干預(yù)高Zn處理后的細(xì)胞，并檢測細(xì)胞凋亡的相關(guān)指標(biāo)，以此揭示ALC對高Zn誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的干預(yù)機制。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑和儀器七水硫酸鋅(99.5%，Cas號：7446-20-0)購自阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；ALC(99%，Cas號：5080-50-2)購自Santa Cruz公司；PK-15細(xì)胞由實驗室保存； DMEM高糖培養(yǎng)基(Cas號：G4510-500ML)、胰酶(Cas號：G4001-100ML)和青鏈霉素(Cas號：G4003-100ML)購自武漢賽維爾生物科技有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Cas號：164210-50)購自武漢普諾賽生命科技有限公司；CCK-8試劑盒(Cas號：CK04)購自日本同仁化學(xué)研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Cas號：R323-01)和熒光定量試劑盒ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix(Cas號：Q711-02/03)購于諾唯贊生物科技有限公司；ECL發(fā)光液(Cas號：SB-WB001)購于上海圣爾生物科技有限公司；二喹啉甲酸(bincinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒(Cas號：P0010S),蛋白二抗(Cas號：A0208,A0192),RIPA裂解液(Cas號：P0013B),苯甲基磺酰胺(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(Cas號：ST506)購自碧云天生物技術(shù)公司；Caspase-3(Cas號：9662)和cleaved Caspase-3抗體(Cas號：9661)購自Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體(Cas號：bs-0755R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

熒光定量PCR儀(LightCycler480型)購自美國Roche公司；酶標(biāo)儀(ELx808型)購自美國BioTeck公司；電泳儀(BG-Power600型)購自上海天能科技有限公司。

1.2 PK-15細(xì)胞培養(yǎng)PK-15細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS和1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞活力檢測將細(xì)胞接種于96孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長至80%時，采用不同濃度的Zn2+(0，50，100，200,400 μmol/L)和ALC(0，25，50，100,200 mmol/L)進(jìn)行細(xì)胞處理。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8試劑孵育細(xì)胞1 h，采用酶標(biāo)儀讀取波長為450 nm的吸光度，并獲取ALC的最佳處理濃度和Zn2+的半數(shù)抑制濃度。

1.4 細(xì)胞處理根據(jù)所得到的ALC的最佳處理濃度和Zn2+的半數(shù)抑制濃度，ALC處理量100 mmol/L，選擇Zn2+處理量為120 μmol/L。因此，將細(xì)胞分為4組進(jìn)行培養(yǎng)，分組如下：對照組(control group)、單獨Zn處理組(Zn group)、Zn與ALC混合處理組(Zn+ALC group)和單獨ALC處理組(ALC group)。

1.5 實時熒光定量PCR采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測bax、bak-1、bcl-2和Caspase-3的mRNA表達(dá)?？俁NA提取選用TRIzol法進(jìn)行提取，提取的總RNA選用PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。從NCBI中獲得bax、bak-1、bcl-2和Caspase-3的基因序列，并選用GAPDH基因作為內(nèi)參基因。引物序列由Primer 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計，最終由擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA采用染料法進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為10 μL：ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix 5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物均為0.2 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5 min；循環(huán)反應(yīng)95℃ 10 s，60℃ 30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)；溶解曲線95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。所得出Ct值采用2-ΔΔCt法計算mRNA的表達(dá)。

1.6 免疫印跡細(xì)胞采用RIPA裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白含量。樣本經(jīng)過稀釋至同一濃度后，與4×Loding Buffer進(jìn)行混勻。隨后蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h、蛋白一抗(Caspase-3和cleaved Caspase-3抗體均以1∶1 000稀釋)4℃孵育16 h、二抗室溫孵育1 h后，用ECL發(fā)光液顯影，成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶。

1.7 統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Graphpad Prism軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與圖片繪制，組間比較分析采用單因素方差(ANOVA)分析進(jìn)行檢驗，t檢驗分析2組之間的差異，不同字母表示顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 ALC最佳孵育濃度的選擇由圖1可知，PK-15細(xì)胞活力在ALC的處理濃度在0～100 mmol/L時呈現(xiàn)升高趨勢，其中濃度為100 mmol/L時細(xì)胞活力顯著高于0 mmol/L ALC組(P<0.05)。當(dāng)ALC濃度達(dá)到200 mmol/L時，其細(xì)胞活力顯著低于100 mmol/L ALC組(P<0.05)。由此，本研究選擇了100 mmol/L濃度作為ALC孵育PK-15細(xì)胞的最佳濃度。

注：不同小寫字母間表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 Zn2+半數(shù)抑制濃度的確定本研究通過對不同濃度的Zn2+進(jìn)行細(xì)胞活力的檢測，繪制出PK-15細(xì)胞在暴露于Zn2+中的細(xì)胞活力曲線。與對照組相比，50，100，200,400 μmol/L Zn2+中的細(xì)胞活力呈現(xiàn)顯著下降(P<0.05)(圖2)。經(jīng)過計算，得出Zn2+在PK-15細(xì)胞中的半數(shù)抑制濃度為121.945 μmol/L。

圖2 不同濃度的Zn2+對PK-15細(xì)胞活力的影響

2.3 Zn和ALC對PK-15細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響如圖3所示，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bax、bak-1和Caspase-3的mRNA表達(dá)在Zn組中較對照組顯著升高(P<0.05)，Zn+ALC組中bax、bak-1和Caspase-3的mRNA表達(dá)與Zn組相比呈現(xiàn)顯著下降(P<0.05)。此外，bcl-2的mRNA表達(dá)在Zn組中較對照組顯著下降(P<0.05)，Zn+ALC組中bcl-2的mRNA表達(dá)與Zn組相比呈現(xiàn)顯著升高趨勢(P<0.05)。對照組和ALC組中的bax、bak-1、bcl-2和Caspase-3的mRNA表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 Zn和ALC對PK-15細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4 Zn和ALC對PK-15細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)如圖4所示，Caspase-3的蛋白表達(dá)在Zn組中顯著低于對照組(P<0.05)，而在Zn+ALC組中的表達(dá)則顯著高于Zn組(P<0.05)。此外，cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)在Zn組中顯著高于對照組(P<0.05)，而在Zn+ALC組中的表達(dá)則顯著低于Zn組(P<0.05)。對照組和ALC組中Caspase-3和cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)未見顯著性差異(P>0.05)。

A.免疫印跡條帶圖；B.蛋白表達(dá)的量化分析

3 討論

Zn是一種必需微量元素，參與了多種生命過程[1]。在飼料中補充適量的Zn不僅可以提高動物繁殖性能、維持腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，而且會提高抗氧化功能，提升機體免疫力[10]。然而，動物攝入過量的Zn可引起抗氧化功能下降，造成氧化應(yīng)激以及程序性死亡的發(fā)生[11]?；谀壳靶笄蒺B(yǎng)殖行業(yè)中易出現(xiàn)重金屬引起毒性損傷的問題，使得Zn元素在飼料中的運用得到更多關(guān)注。在本研究中，我們通過體外培養(yǎng)豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)，采用Zn2+對細(xì)胞進(jìn)行處理，由此評價其細(xì)胞毒性機理。研究發(fā)現(xiàn)，在孵育Zn2+濃度在100，200，400 μmol/L時，細(xì)胞活力顯著下降，提示過量的Zn可導(dǎo)致PK-15細(xì)胞產(chǎn)生損傷。

大量研究證實，在重金屬引起的細(xì)胞損傷中常伴隨著細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12-13]。凋亡是一種由多種基因高度調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡，其特征是染色質(zhì)縮合、DNA裂解和凋亡小體的形成。細(xì)胞凋亡的機制非常復(fù)雜，主要分為內(nèi)源性和外源性2種途徑[14]。其中，大部分研究主要集中于內(nèi)源性細(xì)胞凋亡的探討，線粒體途徑的凋亡也成為了廣大學(xué)者的研究熱點。在大多數(shù)情況下，線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡是由Bcl家族控制的，該家族是由bax和bak-1等促凋亡因子和抗凋亡因子bcl-2組成。當(dāng)收到凋亡信號時，促凋亡蛋白會轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，Bcl-2蛋白進(jìn)而下調(diào)，導(dǎo)致線粒體外膜通透，線粒體膜電位降低，釋放膜間促凋亡物質(zhì)，進(jìn)而促使Caspase-3被剪切，并破壞細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，將細(xì)胞分解成凋亡小體[15]。已有研究證實，重金屬元素可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。LIAO等[14]研究證實，飼喂高劑量的銅可致使肉雞腎臟bax、bak-1和Caspase-3的mRNA表達(dá)升高，進(jìn)而發(fā)生線粒體途徑的細(xì)胞凋亡；WANG等[16]研究也證實了鉬和鎘聯(lián)合飼喂肉鴨也導(dǎo)致腎臟氧化應(yīng)激和凋亡。本研究中，在Zn2+處理后，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bax、bak-1和Caspase-3的mRNA表達(dá)與對照組相比顯著升高，且bcl-2的mRNA水平和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著下降，cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)則顯著升高。由此可得，過量的Zn可誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞發(fā)生凋亡。

A.C是生物體內(nèi)含量最豐富的左旋肉堿衍生物，是通過乙酰輔酶A和左旋肉堿在肉堿乙酰轉(zhuǎn)運酶的催化生成[17]。ALC可防止脂肪酸和線粒體中乙酰輔酶A在細(xì)胞中的毒性積累，同時為線粒體中能量代謝提供足夠的乙酰輔酶A[17]。已有研究證實，ALC在抗炎、抗氧化、抗凋亡及促進(jìn)脂肪代謝等生物學(xué)作用。目前，關(guān)于ALC已在生殖系統(tǒng)疾病、阿茲海默癥和肝性腦病等疾病中開展了相關(guān)的臨床應(yīng)用[18]。然而，關(guān)于ALC在治療重金屬中毒方面的相關(guān)研究目前尚不多見。本研究在豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)中揭示了ALC對Zn毒性損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示Zn+ALC組中bax、bak-1和Caspase-3的mRNA表達(dá)顯著低于Zn組，bcl-2的mRNA水平則高于Zn組。此外，Zn誘導(dǎo)下降的Caspase-3蛋白表達(dá)在ALC處理下呈現(xiàn)顯著升高，而cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)則顯著降低。由此可得，ALC可顯著緩解Zn誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞的凋亡效應(yīng)，這一結(jié)果也揭示了ALC對Zn誘導(dǎo)毒性損傷的保護(hù)作用，并為進(jìn)一步挖掘Zn中毒的治療提供重要方法。