芹菜素通過NF-κB和MAPK通路抑制MAC-T細胞和小鼠乳腺的炎性反應

陳喜宏，余世田，馬 驍，路桂聰，王瑞宏，玉永雄，蔣曹德*

(1.西南大學 動物科學技術學院，重慶 北碚 400715；2.城口縣農業(yè)農村委員會，重慶 城口 405999)

牛乳腺炎是一種奶牛乳腺組織感染的頑固性疾病，其發(fā)病率高、治愈率低、淘汰率高。國內外奶牛場由于乳腺炎造成了乳制品產量和品質下降、治療成本和牧場管理費用飆升，乳腺炎已成為限制全球奶牛產業(yè)發(fā)展的最重要原因之一[1]。當前奶牛乳房炎普遍采用抗生素療法，不僅導致病原菌產生耐藥性，而且乳汁中抗生素殘留嚴重危害人類健康。植物提取物富含天然活性物質，具有無殘留、無抗藥性、多功能等優(yōu)勢，已廣泛用作畜禽飼料添加劑[2]。研究植物提取物的抗炎作用，對于探討奶牛乳房炎的抗生素替代療法具有重要的理論和實踐意義。

前期研究表明核因子κB(NF-κB)為經典的炎性反應通路，革蘭陰性菌脂多糖(LPS)被toll 樣受體4(TLR4) 識別后，激活NF-κB激酶(IKK)，導致NF-κB抑制蛋白(IκB)磷酸化和泛素化，從而釋放NF-κB p65亞基并進入細胞核啟動炎性因子與炎性介導因子的表達，其中包括白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧酶2(COX-2)等[3]。其他研究報道了促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路通過MAPK激酶的激酶—MAPK激酶—細胞外信號調節(jié)激酶(ERK1/2)、C-Jun 氨基端激酶(JNK1/2)和p38級聯調控NF-κB、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧酶2(COX-2)等的表達[4-5]。MAPK和NF-κB信號通路在炎癥發(fā)生中的重要作用已在小鼠乳腺上皮細胞[6-9]、RAW264.7細胞[10]、BV-2細胞[11]、人單核細胞[12]中得到廣泛的證實。

芹菜素(apigenin，Api)即4′,5,7-三羥基黃酮，是一種天然的黃酮類物質[3]。芹菜素的抗炎抗氧化功能相繼報道于小鼠結腸腫瘤與上皮細胞、牛的內皮細胞[13-15]。其他研究還揭示了芹菜素對NF-κB p65磷酸化、iNOS和COX-2的抑制作用[16-17]。目前在小鼠上皮細胞、內皮細胞與巨噬細胞中的研究集中在芹菜素的抗炎抗氧化作用，但是芹菜素對于MAPK通路和NF-κB通路的關鍵成員以及牛乳腺炎發(fā)生的調控功能還不清楚。因此，本研究選擇牛的乳腺上皮細胞MAC-T和BME-UV1以及小鼠乳腺組織，分析芹菜素對細胞炎癥反應的抑制作用及其抗炎的分子通路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)MAC-T細胞(BMCC，CHN)培養(yǎng)于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，DMEM基礎培養(yǎng)液(Hyclone,Logan,SH30022.FS USA)含有10% FBS(Gibco，AUS)，1% 青鏈霉素和100 mg/L的鏈霉素(Solarbio，P1400-100 北京)；培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2(Forma Series 3 WJ,Thermo,USA)。當細胞貼壁生長到90%時用0.25%胰酶(Solarbio,CAS:9002-07-7 北京)消化并傳代。

1.2 細胞活性檢測MAC-T細胞以1×104/孔的密度接種于96孔板上。待細胞貼壁后添加不同質量濃度(0，1，5，10，25，50，100，200 mg/L)的芹菜素(MCE，CAS No.:520-36-5,USA)處理并設置5個重復。細胞培養(yǎng)24 h后將上清液棄去并加入10 μL MTT(Solarbio，CHN)和90 μL DMEM基礎培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后，棄去培養(yǎng)液，再加入110 μL Formazan(Solarbio,CAS:298-96-4 北京)共同孵育10 min，用光密度計(Multiskan GO，Thermo，USA)檢測D490 nm值。細胞活性=(處理組D值/對照組D值)×100%。

1.3 動物試驗選取30只(20只雌性和10只雄性)6～8周齡BALB/c小鼠(伯恩斯韋爾生物技術有限公司，重慶)進行自由采食飼養(yǎng)。試驗前采用在12 h光照與黑暗交替、無病原體條件下飼養(yǎng)1周。然后，每只籠子里飼養(yǎng)2只母鼠和1只公鼠進行交配。在母鼠分娩7 d后，將哺乳期的母鼠隨機分成4組：空白對照組、LPS組(10 μg)、LPS+Api (15 mg)和Api+LPS[18]。LPS (200 mg/L，50 μL)溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，用32G針注射到最容易觀察和采集的第4對乳頭(R4和L4)的乳腺導管中[9,18]。LPS組的每只哺乳期小鼠用9 μL 4%水合氯醛深度麻醉，在脂多糖滴注前、后1 h腹腔注射芹菜素[9]?？瞻讓φ战M和LPS組腹腔注射等體積的PBS。注射LPS 24 h后[18]，通過頸椎脫臼處死小鼠，收集乳腺組織并儲存在-80℃。

1.4 總RNA的提取與real-time PCR MAC-T細胞按照2×106/孔接種于6孔板中，貼壁后按照不同實驗進行不同處理。為篩選LPS處理的最佳時間與質量濃度，MAC-T細胞培養(yǎng)在含有不同質量濃度LPS(Acmec，AL8880 CHN)(0，1，5，10，20 mg/L)的培養(yǎng)液中，并在1，12和24 h分別收集細胞，試驗設置3個獨立重復試驗。對于芹菜素的處理，MAC-T細胞培養(yǎng)在含有不同質量濃度芹菜素(0(陰性對照)，1，7和15 mg/L)和1 mg/L LPS的培養(yǎng)液中，并以20 mg/L DEX(dexamethasone)(Macklin，D807084 CHN)和1 mg/L LPS共處理作為陽性對照。培養(yǎng)24 h后收集細胞，每個處理設置3個重復。各種處理收集的細胞均用PBS潤洗3次，每孔加入600 μL RNAiso plus(TaKaRa，D9108A JPN)充分裂解后轉移至無核酶離心管中，加入1/5 RNAiso plus體積的氯仿，充分混勻后室溫靜置5 min；4℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上清液至新的無核酶離心管，加入等體積異丙醇后混勻并于-20℃沉淀30 min；4℃ 12 000 r/min離心10 min 收集RNA沉淀，75%乙醇清洗RNA沉淀2次后干燥，并加入20 μL DEPC水溶解RNA沉淀，用超微量分光光度計(NanoDrop One，Thermo，USA)測定RNA濃度。

按照mRNA反轉錄試劑盒(江蘇楚天生物科技有限公司，常州)說明書進行反轉錄。利用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (寶生物工程(大連)有限公司)在CFX96(Bio-Rad，USA)熱反應儀上進行real-time PCR反應。除了各引物退火溫度見表1，real-time PCR反應體系、熱循環(huán)程序和60～95℃熔融曲線分析參照文獻[19]。每個PCR反應3次重復，以β- actin為內參基因，采用2-△△Ct方法計算基因相對表達量[20-21]。

表1 熒光定量引物序列

1.5 Western blotMAC-T 細胞按照2×106/孔接種于6孔板中待其貼壁，隨后培養(yǎng)在含有不同質量濃度芹菜素(0，1，7和15 mg/L)和1 mg/L LPS的培養(yǎng)液中，24 h后收集細胞。細胞總蛋白提取采用細胞總蛋白提取試劑盒(Solarbio，R0020 北京)，隨后用BCA蛋白定量試劑盒(Vazyme，ml058939 南京)進行總蛋白定量。取4 μL蛋白樣品加入16 μL上樣緩沖液(Solarbio，P1040 北京)后煮沸變性5 min，隨后采用10% SDS-PAGE(PowerPac HC，Bio-Rad，USA)。電泳條帶通過轉印設備(1703812，Bio-rad，USA)轉移到PVDF膜(Biosharp，AP-4796 上海)，在含有5%牛血清白蛋白(Biotopped，北京)的封閉液中室溫封閉1 h后，進一步與一抗4℃孵育過夜，其中一抗包括β-actin(bsm-33036M；稀釋比1∶10 000)，p65(bs-23217R，稀釋比1∶1 000)，p-p65(bs-0982R，稀釋比1∶1 000)，IκBα(bs-1287R；稀釋比1∶1 000)，p-IκBα(bs-2513R，稀釋比1∶1 000)，ERK1/2(bs-2637R，稀釋比1:1 000)，p-ERK1/2(bs-3016R，稀釋比1:1 000)(Bioss，北京)以及JNK1/2(WL01295，稀釋比1∶750)，p-JNK1/2(WL01813C，稀釋比1∶750)，p38(WL00764，稀釋比1∶750)和p-p38(WLP1576，稀釋比1∶750)(Wanleibio，沈陽)。上述一抗雜交膜經TBST洗滌3次后，與特異性二抗(AB501-01A，Novoprotein，北京)室溫孵育1 h。用ECL化學發(fā)光系統(Gel Doc XR，Bio-Rad，USA)檢測目標條帶，并使用Image Lab (version 5.2.1,Bio-Rad,USA)和GraphPad Prism(version 8.2)進行定量分析。每個實驗設置3次重復，以20 mg/LDEX和1 mg/L LPS共處理作為陽性對照。

1.6 免疫細胞熒光將MAC-T細胞以1×104/孔的密度接種于96孔板并設置5個重復，待其貼壁后將MAC-T細胞培養(yǎng)在含有不同質量濃度芹菜素(0(陰性對照)，1，7，15 mg/L)和1 mg/L LPS的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，并以20 mg/L DEX和1 mg/L LPS共處理作為陽性對照。培養(yǎng)結束后棄上清，PBS潤洗3次，免疫染色固定液固定10 min；PBS洗滌3次，免疫染色封閉液室溫封閉1 h，加入一抗(p-p65和 p-IκB)4℃孵育過夜；加入Cy3標記的二抗即羊抗兔免疫球蛋白(SN368，Beyotime，上海)室溫孵育1 h，用PBS洗滌3次后加入20 μL細胞核染色液DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)染色10 min；用PBS洗滌3次加入適量免疫染色封片液，在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.7 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)對于炎癥細胞因子和氧化應激因子的檢測，使用無菌注射器從4個治療組的小鼠中提取5 mL血液，儲存在10 mL含有0.1 mL肝素鈉(10 g/L鹽水溶液)的離心管中，并在4℃下以3 000 r/min離心30 min。為了測試p-p65核轉移，在6孔板中培養(yǎng)和處理MAC-T和BME-UV1細胞，使用核蛋白提取試劑盒提取細胞核蛋白，并使用BCA蛋白定量試劑盒(Vazyme，ml058939 南京)進行定量。采用酶聯免疫試劑盒(游喧，上海)檢測血液上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量，以及細胞核中p-p65的含量。每個酶聯免疫吸附反應進行3次。

2 結果

2.1 芹菜素對MAC-T細胞活性的影響隨著芹菜素處理濃度的增加，MAC-T細胞活性表現為先提高后下降，在芹菜素質量濃度為7 mg/L時細胞增殖顯著高于其他質量濃度(P<0.01)，當質量濃度超過20 mg/L時細胞增殖顯著下降(P<0.05)。因此，確定芹菜素的適宜處理質量濃度為1～15 mg/L。

圖1 芹菜素處理對MAC-T細胞活性的影響

2.2 LPS誘導的MAC-T細胞炎癥反應為篩選引起炎癥反應的LPS質量濃度，分析了不同質量濃度的LPS處理組和未處理對照組MAC-T細胞中IL-6 mRNA表達水平。與處理1～24 h后的對照相比，在用1～20 mg/L LPS處理的MAC-T細胞中，IL-6轉錄水平具有劑量和時間依賴性 (P<0.01，圖2A)。而且，在1 mg/L LPS處理的細胞中，IL-1β和TNF-α的mRNA表達顯著升高(P<0.01,圖2B-F)。因此，根據文獻選擇1 mg/L LPS進行后繼研究[20]。

2.3 芹菜素對LPS誘導的MAC-T炎性反應與氧化應激的抑制作用為檢測芹菜素的抗炎和抗氧化作用，采用不同質量濃度的芹菜素和1 mg/LLPS共處理MAC-T細胞。如圖2所示，1，7 和15 mg/L 3種質量濃度的Api處理均顯著降低了LPS誘導的COX-2、iNOS、IL-1β和IL-6 mRNA的表達量，而且除TNF-α(P>0.05)外，其他細胞因子的表示水平也顯著低于DEX處理組(P<0.01，圖2B-F)。

注：圖A中不同大寫字母表示P<0.01，相同大寫字母之間表示P<0.05；圖B中#和##分別表示與空白對照組比較P<0.05 和P<0.01，*和**分別表示與LPS處理組比較P<0.05和P<0.01。下同

2.4 芹菜素對MAC-T細胞NF-kB信號通路關鍵蛋白磷酸化的抑制利用Western blot檢測了芹菜素對NF-κB信號通路關鍵成員p65和IκBα的磷酸化的影響(圖3)。與對照組相比，LPS處理后MAC-T細胞p65和IκBα蛋白質水平沒有差異(圖3A)，但是它們的磷酸化顯著上調(P<0.05)(圖3B、C)。相反，1，7，15 mg/L的芹菜素處理均極顯著下調了LPS誘導的MAC-T細胞p65和的磷酸化水平(P<0.01)，而且芹菜素對p-p65和p-IκBα抑制程度呈現劑量依賴效應。各質量濃度芹菜素處理后，p-p65和p-IκBα水平也顯著低于DEX處理組(P<0.05)。同樣，LPS與LPS共處理可顯著降低BME-UV1細胞中LPS誘導的p-IκB和p-p65水平(P<0.01)。

A.Western blot結果；B～C.不同質量濃度芹菜素處理24 h后LPS誘導的p65和IκBα磷酸化蛋白表達量

進一步檢測了芹菜素對LPS誘導的p65核轉移的影響(圖4)。在對照組(Control)中，p65蛋白主要集中在細胞質中(圖4A～C)；經過LPS處理后，p65蛋白轉移進入細胞核(圖4D～F)。相反，芹菜素與LPS共處理后，3種質量濃度的芹菜素(1，7，15 mg/L)處理均能抑制p65核轉移(圖4J-R)。

圖中藍色熒光為細胞核，紅色熒光為p65蛋白；Merge為紅色和藍色熒光疊加

2.5 芹菜素對MAC-T細胞MAPK信號通路相關蛋白磷酸化的抑制前期文獻報道MAPK是激活NF-κB和促炎調節(jié)因子的關鍵級聯通路[6]，因此檢測了芹菜素對MAPK通路關鍵成員p38、JNK1/2和ERK1/2的磷酸化水平的影響(圖5)。LPS處理后，p38、JNK1/2和ERK1/2的磷酸化水平較陰性對照組都有極顯著的提高(P<0.01)(圖5B-D)。然而，1，7，15 mg/L芹菜素處理后，上述3個蛋白激酶的磷酸化水平極顯著下降(P<0.01)，其中p38的磷酸化下降程度呈現芹菜素劑量依賴效應(圖5B)，并且p38和ERK1/2的磷酸化在各種質量濃度芹菜素處理下都顯著低于DEX處理(P<0.01)(圖5B、D)。

圖5 芹菜素對MAPK信號通路的抑制

2.6 芹菜素對LPS誘導的小鼠乳腺炎性細胞因子與氧化應激因子表達的抑制利用小鼠乳腺探討了芹菜素對LPS誘導的炎癥反應以及NF-κB和MAPK通路的影響。ELISA分析顯示，與空白對照組相比，LPS顯著提高了促炎細胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)和氧化應激因子(COX-2和iNOS)的血液蛋白水平(P<0.05，圖6)，但是芹菜素前處理(Api + LPS)和后處理(LPS + Api)均極顯著下調了5種細胞因子的表達(P<0.01)。Western blot顯示，芹菜素前處理與后處理均顯著抑制了LPS誘導的NF-κB磷酸化水平(p-IκB和p-p65)(P<0.05，圖7)和MAPK磷酸化 (p-p38、p-JNK1/2和P-ERK1/2)(P<0.05，圖8)。這些結果與體外結果一致，進一步證實了芹菜素的抗炎作用。

圖6 芹菜素對小鼠炎癥反應的影響

圖7 芹菜素對小鼠NF-κB通路的影響

圖8 芹菜素對小鼠MAPK信號通路的影響

3 討論

本研究利用LPS處理MAC-T細胞揭示芹菜素的抗炎作用。MAC-T細胞是表達猴病毒-40的大T抗原的牛乳腺上皮細胞，由于其與原代細胞具有相似的生物學反應，常被用作研究牛乳腺炎癥的模型[20]。因此，本研究選擇該細胞系來研究芹菜素對MAC-T細胞炎癥反應的影響。

大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是引起牛乳腺炎常見的病原體，但是大腸桿菌引發(fā)急性臨床癥狀，并激活機體免疫反應，包括細胞因子和趨化因子等的表達[6,21]。LPS是大腸桿菌細胞壁的主要成分，通過TLR4/NF-κB級聯激活炎癥反應[22]。另一方面，DEX是一種廣泛用于治療人類炎癥性疾病以及LPS誘導的動物模型和體內實驗的類固醇藥物。因而，本研究建立了空白、LPS和LPS + DEX對照，通過LPS組與空白對照組比較，揭示LPS誘導的炎癥反應；通過比較LPS +Api、LPS + Api與LPS、LPS + DEX處理差異，揭示芹菜素的抗炎作用。

研究表明LPS激活TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性細胞因子的表達，導致牛乳腺腺組織嚴重損傷[6,23]。在RAW264.7、腎小管上皮細胞和腸道炎癥疾病中的研究發(fā)現，芹菜素能降低LPS誘導的IL-6、IL-1β和TNF-α的表達[6,17,24]。本研究發(fā)現芹菜素不僅降低LPS誘導的IL-1β和IL-6的表達，而且還抑制了炎癥介導因子COX-2和iNOS的表達(圖3)，這與芹菜素在HepG2細胞炎癥和前列腺癌細胞中降低COX-2和iNOS的mRNA水平相一致[25-26]。實際上，COX-2是一種誘導酶，其表達受IL-1、IL-6等細胞因子和生長因子的調控，該炎性介導因子的表達是前列腺素刺激的關鍵步驟[27]。iNOS是一種一氧化氮合酶，被炎癥、組織損傷等病理刺激激活，抑制iNOS對降低炎癥介質NO水平至關重要[27]。因此，COX-2和iNOS均是炎癥標志物，它們的表達與氧化應激和炎癥的發(fā)生密切相關。本研究中數據表明，芹菜素的抗氧化和抗炎作用是通過下調IL-6、IL-1β、iNOS和COX-2的表達來實現的。

NF-κB在LPS誘導的肺部和巨噬細胞炎癥中起著關鍵作用[18-19]。桑色素、荷葉堿和皂苷等植物提取物通過阻斷NF-κB信號發(fā)揮炎癥的抑制作用[5,28-29]。NF-κB是細胞中廣泛存在的轉錄因子，主要由p50和p65復合物組成，在靜息狀態(tài)下與抑制性蛋白IκBα結合而失去活性[22]。LPS刺激后，IκBα通過磷酸化和泛素化被降解并釋放p-p65，隨后遷移到細胞核參與COX-2、TNF-α、IL-6和IL-1β等靶基因的轉錄激活[23]。有研究報道，在內皮細胞炎癥中，芹菜素能抑制p-p65和p-IκB的表達量以及p-p65的核積累[30]，但過表達IKK能解除芹菜素對NF-κB p65磷酸化的抑制[30]。本研究從體外和在體研究均發(fā)現芹菜素能顯著降低p-IκBα和p-p65水平以及p-p65核移位(圖4、7)。這些結果說明芹菜素能通過抑制IκBα降解和p65激活減輕LPS誘導的炎性反應。

已有文獻表明MAPK信號通路通過iNOS、COX-2等炎性介導因子促進炎性細胞氧化應激反應[6,30]。MAPK信號包含3個MAP激酶，即ERK1/2、JNK1/2和p38，這些酶存在于所有的真核細胞中。本研究中，芹菜素抑制了MAC-T細胞炎癥中p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-p38水平(圖5、8)，此研究結果證實了小鼠、大鼠以及HK-2細胞中的研究結果[32-34]，說明芹菜素的抗氧化活性與MAPK信號通路活性的抑制有關。

綜上所述，本研究表明芹菜素能降低MAC-T細胞中LPS誘導的炎性細胞因子IL-6、IL-1β和炎性介導因子COX-2、iNOS的表達；芹菜素通過抑制NF-κB和MAPK信號通路抑制MAC-T細胞炎性反應，但是其奶牛乳腺炎防治中的應用有待進一步研究。