熊章 羅宸 吳帥 吳勁松
根據(jù)2021版《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類》(WHO CNS5)[1],成人彌漫性腦膠質(zhì)瘤主要分為:星形細胞瘤,IDH突變型;少突膠質(zhì)瘤,異檸檬酸脫氫酶(IDH)突變和1p/19q共缺失;膠質(zhì)母細胞瘤,IDH野生型。研究表明,最大程度的安全切除可以改善膠質(zhì)瘤病人術(shù)后癥狀、生活質(zhì)量、無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)[2-3]。目前,術(shù)中的主要干預技術(shù)一方面是針對腫瘤組織邊界的研究,力求探明腫瘤組織浸潤邊界,以期做到腫瘤的全切,如術(shù)中導航、術(shù)中磁共振、術(shù)中熒光顯影、術(shù)中超聲等;另一方面是對腦功能區(qū)識別的研究,以避免術(shù)中對腦功能區(qū)的損傷,做到安全切除腫瘤,如神經(jīng)電生理刺激、術(shù)中喚醒等。這些技術(shù)的單獨應(yīng)用或組合使用可提高膠質(zhì)瘤病人的PFS和OS[4]。分子病理在腦膠質(zhì)瘤診療中的地位愈發(fā)重要。研究發(fā)現(xiàn),手術(shù)切除程度對不同分子亞型的腦膠質(zhì)瘤病人的預后影響并不相同。腦膠質(zhì)瘤分子病理術(shù)中快速檢測技術(shù)逐漸成熟,既往有多項研究對此進行了相關(guān)探索。本文重點探討手術(shù)切除程度對不同分子亞型成人彌漫性腦膠質(zhì)瘤預后的影響,總結(jié)腦膠質(zhì)瘤術(shù)中快速分子病理檢測的研究進展。
腦膠質(zhì)瘤的彌漫性生長意味著外科醫(yī)生很難完全切除腫瘤,膠質(zhì)瘤的切除范圍(extent of resection,EOR)也一直是神經(jīng)外科領(lǐng)域的研究熱點。Smith等[5]研究低級別膠質(zhì)瘤的EOR時發(fā)現(xiàn),EOR大于90%的病人會有相對較好的5年OS(97%)、5年P(guān)FS(75%)、8年OS(91%)和8年P(guān)FS(43%)。他們還發(fā)現(xiàn),當EOR閾值在80%以上時,低級別膠質(zhì)瘤病人的OS會隨著EOR的提升而提高。在精準醫(yī)療時代,針對不同分子亞型的腦膠質(zhì)瘤病人進行個體化治療是未來的趨勢。WHO CNS5對不同分子亞型(如IDH突變、1p/19q共缺失、TERT啟動子突變等)給出了比較明確的診斷分類,不同診斷分類的膠質(zhì)瘤對應(yīng)不同的術(shù)后輔助治療策略及預后預期,而其對膠質(zhì)瘤手術(shù)的指導尚不明確。神經(jīng)外科醫(yī)生在術(shù)中實時了解腫瘤的分子病理,及時調(diào)整手術(shù)策略,并在最大化腫瘤切除與最小化功能損傷之間取得平衡。研究發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)瘤病人IDH突變率為46%,TERT啟動子的突變率為45%,包含IDH和(或)TERT的突變率達到了91%[6]。我們以IDH和TERT突變狀態(tài)為線索,結(jié)合WHO CNS5,對不同分子亞型病人預后與手術(shù)切除程度的相關(guān)性進行總結(jié)。
有研究發(fā)現(xiàn),成人膠質(zhì)瘤中IDH和TERT的雙突變幾乎與1p/19q共缺失是一致的[7],我們認為,IDHmut+TERTmut的分子分型是少突細胞膠質(zhì)瘤。
Hou等[8]利用中國膠質(zhì)瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(Chinese Glioma Genome Atlas database,CCGA)對449例膠質(zhì)瘤病人的臨床及病理信息分析發(fā)現(xiàn),對于KPS>80,年齡>45歲的少突細胞膠質(zhì)瘤病人,與次全切(subtotal resection,STR)相比,腫瘤的完全切除(gross total resection,GTR)不能使病人更加受益。也就是說,對于該分子分型的膠質(zhì)瘤在手術(shù)切除時不必太過激進,少許殘留不會影響病人預后。這可能是由于少突膠質(zhì)細胞瘤呈惰性生長,且對常規(guī)術(shù)后輔助治療(放療及替莫唑胺化療)較為敏感,即使不能完全切除腫瘤,病人仍可存活較長時間。該團隊還提出對于這些腫瘤應(yīng)該進行“有效的安全切除”,即在保留功能的前提下最大化切除腫瘤。Delevl等[9]研究發(fā)現(xiàn),少突膠質(zhì)細胞瘤的腫瘤是否完全切除(GRT)對病人的總體生存影響不大。因此,結(jié)合Berger教授對低級別膠質(zhì)瘤的研究,對于分子分型為IDHmut+TERTmut的膠質(zhì)瘤,可在保留功能前提下有效切除(EOR>80%)。
依據(jù)最新的膠質(zhì)瘤分類指南WHO CNS5,IDHmut膠質(zhì)瘤應(yīng)診斷為:星形細胞瘤,IDH突變型,組織學等級分為2~4級,其中以低級別膠質(zhì)瘤為主。低級別星形細胞瘤是一種生長相對緩慢的浸潤性腦腫瘤,指南推薦低級別膠質(zhì)瘤的影像學切除邊界則為T2WI/FLAIR的高信號區(qū)域[10]。Wijnenga等[11]研究發(fā)現(xiàn),對于低級別IDHmut星形細胞瘤(WHO 2級),任何術(shù)后殘留都會影響生存預后,甚至需要在確保安全的情況下進行二次手術(shù),切除殘余腫瘤,以達到GTR的目的。Hou等[8]研究指出,對于低級別星形細胞瘤(IDHmut),提升EOR可改善病人的預后。另外,對于2021版指南中高級別IDHmut星形細胞瘤(WHO 3~4級),即2016版《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準》(2016 CNS WHO)分類中IDH突變的間變星形細胞瘤和膠質(zhì)母細胞瘤,并不是所有腫瘤在術(shù)前影像上都有T1WI增強序列的強化灶,關(guān)于切除范圍的研究較少。Beiko等[12]發(fā)現(xiàn),對有強化灶的病人進行影像學邊界(強化灶)切除,可改善生存預后,而強化灶以外的切除尚有爭議。對于無強化灶的病人,切除范圍對預后的影響需要進一步研究??傮w而言,這部分病人應(yīng)盡可能做到影像學邊界全切。
依據(jù)最新的膠質(zhì)瘤分類指南WHO CNS5,該類型突變應(yīng)診斷為膠質(zhì)母細胞瘤,IDH野生型,WHO 4級,預后較差。目前,高級別膠質(zhì)瘤手術(shù)切除的共識是:按照其影像學邊界,即磁共振T1WI的增強區(qū)進行切除[13]。膠質(zhì)母細胞瘤具有很強的浸潤性,腫瘤細胞常出現(xiàn)在增強區(qū)域之外的瘤周區(qū),即T2WI/FLAIR的高信號區(qū)(非增強區(qū))。2020年發(fā)表在JAMA Oncology上一項多中心回顧性研究提出,對于膠質(zhì)母細胞瘤,同時切除高級別膠質(zhì)瘤的增強區(qū)和非增強區(qū)可明顯改善年齡<65歲病人的預后,對于65歲以上的病人,擴大切除非增強區(qū)可能獲益不明顯[14]。相比于影像學邊界的GTR,擴大切除非增強區(qū)可明顯提高膠質(zhì)母細胞瘤病人生存時間。目前的觀點基本支持對非增強進行擴大切除,但對于應(yīng)達到怎樣的切除閾值對病人預后獲益最顯著仍有爭議。對于少部分IDHwt+TERTmut分子分型的膠質(zhì)瘤,組織病理表現(xiàn)為較低級別膠質(zhì)瘤,影像學上并無T1WI增強區(qū),有關(guān)手術(shù)切除范圍的研究較少。我們團隊的一項回顧性研究發(fā)現(xiàn),對于此類型的膠質(zhì)瘤,基于T2WI/FLAIR高信號區(qū)的最大化安全切除可使病人明顯受益[15]。
對于分子分型為IDHwt+TERTwt的膠質(zhì)瘤,如果其組織病理為高級別膠質(zhì)瘤(合并微血管增生/壞死等惡性特征),則可診斷為膠質(zhì)母細胞瘤(符合2016 CNS WHO分類標準和WHO CNS5分類標準)或兒童彌漫性高級別膠質(zhì)瘤(主要分子特征為組蛋白H3改變,包括H3 K27改變及H3 G34突變,以及其他分子改變)。膠質(zhì)母細胞瘤手術(shù)切除范圍的研究如前文所述,建議進行增強區(qū)+T2/FLAIR高信號區(qū)(非增強區(qū))切除的手術(shù)策略。而兒童彌漫性高級別膠質(zhì)瘤多數(shù)侵犯功能區(qū)或中線部位,手術(shù)完全切除難度大,研究發(fā)現(xiàn),只有對腫瘤的GTR才會有明顯的生存獲益[16],而STR與活檢相比則無明顯的生存差異。這就要求在術(shù)前對腫瘤類型及切除程度有所判斷,或者通過活檢取樣,對相關(guān)分子指標進行術(shù)中檢測,術(shù)中明確其病理診斷,再決定是否進行GTR或手術(shù)以外其他輔助治療。因此,對于兒童高級別膠質(zhì)瘤的相關(guān)手術(shù)策略研究,可能還需要更為可靠的術(shù)中分子檢測技術(shù)的支持。
IDHwt+TERTwt分子分型中組織病理為低級別的膠質(zhì)瘤,準確的分子病理診斷需要結(jié)合相關(guān)分子的測序結(jié)果,其中少數(shù)具有特定分子特征:TERT啟動子突變(TERTmut,該分子分型前文已闡述)、EGFR 基因擴增或7號染色體擴增/10號染色體缺失三者之一,納入膠質(zhì)母細胞瘤的診斷,暫無與EOR相關(guān)的詳細分子分層研究,可依據(jù)指南進行T2/FLAIR高信號區(qū)(影像學邊界)切除的手術(shù)策略。其余主要考慮診斷為兒童彌漫性低級別膠質(zhì)瘤,包括彌漫性星形細胞瘤,伴MYB/MYBL1改變、血管中心型膠質(zhì)瘤及彌漫性低級別膠質(zhì)瘤,伴MAPK信號通路改變等。對所有IDHwt的低級別膠質(zhì)瘤的研究發(fā)現(xiàn),提升T2WI/FLAIR高信號區(qū)(影像學邊界)的切除率可改善生存預后[15,17]。在后續(xù)的研究中我們會更多關(guān)注不同分子分型與手術(shù)切除范圍對病人預后獲益的影響。另外,局限性星形細胞瘤的分子分型也為IDHwt+TERTwt,包括毛細胞型星形細胞瘤、多形性黃色細胞瘤等,影像學可表現(xiàn)為強化灶,如果術(shù)中檢測出它們具有的特定分子特征(如BRAF、NF1、ATRX等突變),可幫助明確診斷,進行影像學邊界切除即可達到很好的治療效果[18]。
WHO CNS5對腦脊髓腫瘤分類進行了第六次修訂,引入了更加豐富的分子分型,以及更加完善的與組織學類型相結(jié)合的整合病理診斷與分級。臨床常見的膠質(zhì)瘤病理類型有:星形細胞瘤,IDH突變型(IDH1,IDH2,ATRX,TP53,CDKN2A/B);少突膠質(zhì)瘤,IDH突變+1p/19q共缺失(IDH1,IDH2,1p/19q,TERT,CIC,F(xiàn)UBP1,NOTCH1);膠質(zhì)母細胞瘤,IDH野生型(IDH野生型,TERT,7/10染色體改變,EGFR)等。不同分型意味著不同的治療策略和預后,所以提供實時的分子突變信息,將允許外科醫(yī)生根據(jù)每個病人的基因圖譜調(diào)整手術(shù)策略。在大多數(shù)神經(jīng)病理學實驗室中,1p/19q共缺失是通過熒光原位雜交(FISH)檢測,IDH突變(IDH1 R132H)則通過免疫組化(IHC)方法進行檢測。其他更詳細和精確的分子突變信息將會根據(jù)病人需求進一步進行基因測序分析。然而,基于下一代測序技術(shù)(NGS)的基因檢測不僅價格較高,而且檢測周期較長(5~14天),無法應(yīng)用于術(shù)中檢測。隨著神經(jīng)外科的發(fā)展,人工智能的融合,研究人員開發(fā)了基于MRI的影像組學技術(shù),可用于術(shù)前無創(chuàng)預測IDH突變狀態(tài)。然而大部分影像組學模型尚缺乏外部驗證集,不能很好解釋模型構(gòu)建原理,影響了臨床的應(yīng)用和轉(zhuǎn)化。與此同時,科學家們也在嘗試對組織標本的術(shù)中檢測技術(shù)。下文總結(jié)了近年來膠質(zhì)瘤術(shù)中分子檢測技術(shù)的研究進展。
基因測序技術(shù)正在快速發(fā)展,分子檢測已經(jīng)從選擇性使用標準PCR發(fā)展到常規(guī)使用實時定量PCR(Real Time-PCR),再到最近的下一代測序或高通量測序。在整個演變過程中,桑格(Sanger)DNA測序一直是測定核酸序列的金標準,但每次反應(yīng)只能檢測少量的序列,且對檢測標本要求較高(目標序列含量不少于20%)。NGS則可在大規(guī)模并行高通量測序時單次進行數(shù)百萬到數(shù)十億個的測序反應(yīng),明顯縮短了檢測時間和成本,增加了輸出的序列,對科學研究和臨床實踐有重要意義。然而這些技術(shù)仍然耗時較長,操作復雜,只能用于對術(shù)后標本的檢測。我們在臨床實踐中,主要是想通過術(shù)中檢測獲取少數(shù)已知關(guān)鍵分子的突變狀態(tài)(如IDH、TERT等)。為此,科學家開發(fā)了一系列點突變檢測的技術(shù),使術(shù)中分子檢測成為可能。
1.IDH1和IDH2的突變主要為4號外顯子132密碼子和172密碼子的改變。有多種方法可檢測這些突變,包括焦磷酸測序、免疫組化、低溫變性共擴增PCR(CO-amplification at Lower Denaturation temperature PCR, COLD-PCR)等。單個核苷酸位點的突變會使雙鏈DNA溶解的溫度發(fā)生改變,COLD-PCR利用這一特征[19],在PCR過程中通過精確控制溫度,使突變頻率很低的目的片段呈指數(shù)級擴增??茖W家對COLD-PCR繼續(xù)優(yōu)化,將擴增產(chǎn)物進行熒光溶解曲線分析(FMCA),實現(xiàn)了快速、靈敏、特異的術(shù)中檢測IDH1和IDH2突變。該技術(shù)靈敏度高特異性好,即使突變頻率低至2.5%也能準確進行檢測,從取下標本到得出突變結(jié)果僅耗時約60分鐘,結(jié)果準確可靠。該技術(shù)的難點在于對不同突變片段臨界溫度的確定,暫且只能進行IDH1和IDH2的突變檢測,大規(guī)模的臨床應(yīng)用也尚缺乏可靠的前瞻性研究證據(jù)。
2.實驗室常用的DNA提取步驟一般都需要裂解、反復多次離心和洗滌,操作比較耗時費力。科學家建立了一種簡單的DNA提取方法[20],僅需將少許膠質(zhì)瘤標本用Tris-EDTA緩沖液在95 ℃條件下孵育5分鐘,收集上清即可。作者進一步整合已開發(fā)的IDH熒光探針(all-in-one),進行了后續(xù)的測序檢測,整體流程需要90~100分鐘,在保證檢測結(jié)果準確性的同時大大提升了檢測效率,可用于術(shù)中的分子檢測。該技術(shù)可檢測腫瘤細胞含量高于10%的組織,目前只能檢測IDH突變狀態(tài),其他分子指標有待進一步開發(fā)。
3.擴增阻滯突變系統(tǒng)(Amplification Refractory Mutation System-PCR,ARMS-PCR)是基于PCR技術(shù)建立的用于檢測已知點突變的方法[21]。其原理是在PCR過程中引入2條引物,使其3'端堿基分別與突變和野生型模板堿基互補,隨著DNA鏈的延申就可以將突變狀態(tài)檢測出來。但在實際過程中單個錯配堿基有時也可以進行DNA鏈的延伸,造成假陽性。Timucin等提出了包含3個錯配堿基的系統(tǒng)(3m-ARMS),即在野生型引物3'端加入3個錯配堿基,明顯減弱非特異性延伸,總耗時1個小時,操作方便,非常適合術(shù)中使用。該技術(shù)對于引物設(shè)計要求較高,目前只能進行IDH1/2的檢測。
4.鎖核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)是一種特殊的核酸衍生物,可與相應(yīng)DNA單鏈片段互補結(jié)合形成雜交體。相比與普通雙鏈DNA,雜交體具有更高的溶解溫度(Tm)?;谠撛?,閻海教授團隊將LNA技術(shù)用于分子檢測的qPCR中開發(fā)了GliomaDx技術(shù)[22],可明顯增強突變位點與引物的特異性結(jié)合,促進突變片段的指數(shù)擴增,從而提高了目的基因的檢測效率。GliomaDx技術(shù)的敏感性是Sanger測序的200多倍(最低可檢測密度為0.2%),可識別出其他技術(shù)可能漏診的病例,并且可在1個小時內(nèi)完成對組織樣本IDH及TERT突變狀態(tài)的檢測。該技術(shù)操作簡單,如果能夠擴大檢測范圍,將可以提升術(shù)中分子檢測的實用性。
分子病理的重要性日益凸顯,科學家們提出了對術(shù)中分子分型的渴求,也一直在研發(fā)不同的檢測新技術(shù)。IDH狀態(tài)是膠質(zhì)瘤分型和預后的重要指標,IDH突變后可形成2-羥基戊二酸(2-HG)的堆積,有學者建立了一系列檢測2-HG的方法,可間接反應(yīng)IDH的突變狀態(tài)。質(zhì)譜分析是一種測量物質(zhì)質(zhì)荷比的方法,已被廣泛用于醫(yī)療領(lǐng)域。近幾年來有許多經(jīng)研究聚焦于質(zhì)譜技術(shù)實現(xiàn)術(shù)中對2-HG的快速檢測[23],比如高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(Liquid Chromatography/Electrospray Ionization tandem Mass Spectrometry,LC/ESI-MS/MS)、解吸電噴霧電離質(zhì)譜(Desorption Electrospray Ionization-Mass Spectrometry,DESI-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Gas Chromatography Mass Spectrometry,GC-MS)[24-26]等,這些技術(shù)不僅可以間接判斷IDH狀態(tài),還可以評估腫瘤細胞百分比,時效性和準確性都很好,但目前僅能作為一種輔助技術(shù),也許未來隨著技術(shù)的發(fā)展可以大規(guī)模應(yīng)用于臨床,整合入膠質(zhì)瘤治療管理,術(shù)中評估多種分子突變狀態(tài),甚至可用來評估腫瘤邊界。
其他可快速檢測分子突變狀態(tài)的技術(shù)還包括拉曼光譜、快速免疫組化、微流控技術(shù)等。術(shù)中分子檢測相比常規(guī)術(shù)后的分子檢測要求較高,必須具備高靈敏度、高特異度、高時效性,且操作流程簡捷。目前大部分的檢測技術(shù)還需更新迭代,不斷發(fā)展,轉(zhuǎn)化成臨床實踐成果。各類技術(shù)的優(yōu)缺點詳見表1。
表1 各項快速分子檢測技術(shù)的優(yōu)缺點
腦膠質(zhì)瘤分子病理已成為是腦膠質(zhì)瘤診療中的必不可少的一環(huán),隨著研究的進展,我們發(fā)現(xiàn)分子病理不僅可以用于腦膠質(zhì)瘤的整合診斷、預后預測、治療指導,還影響病人手術(shù)切除所帶來的預后獲益。術(shù)中快速分子病理檢測是實現(xiàn)分子病理指導腦膠質(zhì)瘤手術(shù)切除的關(guān)鍵。當下高新技術(shù)迅速發(fā)展,測序技術(shù)、影像技術(shù)、物理化學技術(shù)、免疫技術(shù)、人工智能技術(shù)等逐漸融入各個領(lǐng)域,術(shù)前及術(shù)中分子病理檢測也逐漸成為可能。隨著相關(guān)研究對術(shù)中分子病理檢測技術(shù)的優(yōu)化與整合(圖1),術(shù)中分子病理檢測可通過準確的分子分型指導膠質(zhì)瘤手術(shù)策略,推進腦膠質(zhì)瘤的精準治療。
圖1 腦膠質(zhì)瘤分子分型指導手術(shù)切除的示意圖