白細胞分化抗原74在膽囊癌中的表達及其與表皮生長因子受體表達的相關性分析

王鵬 邱振東 張利龍 左騰 李凱 陳辰 王衛(wèi)星

膽囊癌在肝外膽道系統(tǒng)惡性腫瘤中的發(fā)病率約占80%～95%[1-2]。由于缺乏早期臨床表現(xiàn)，膽囊癌一旦發(fā)現(xiàn)病情多處于進展期[3]。膽囊具有豐富的淋巴組織及血供，膽囊癌細胞易向鄰近器官侵犯并隨血液系統(tǒng)或淋巴管向遠處轉移，預后差， 5年生存率約為32%，是消化道腫瘤中惡性程度較高的一類腫瘤[4-5]。膽囊癌的主要治療方式為手術，放化療以及姑息治療是其輔助治療手段[5-7]。白細胞分化抗原74(cluster of differentiation 74,CD74)作為一種具有多種免疫功能的Ⅱ型跨膜蛋白，在炎癥以及多種惡性腫瘤中均有表達，是腫瘤細胞增殖及多種實體腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因子[8-10]。本研究擬通過測定膽囊癌組織中CD74的表達水平以及其與膽囊癌的臨床病理相關性以及其與已知腫瘤標志因子表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor ，EGFR)的相關性，探討CD74在膽囊癌中的作用及其相關機制。

對象與方法

一、對象

我院2016年9月～2021年9月間收治的膽囊癌病人54例，男性17例，女性37例，平均年齡為61.2歲，所有病人術前均未接受新輔助化療或放療，排除肝臟腫瘤轉移至膽囊所致的轉移癌。

二、方法

1.試劑：兔抗人EGFR抗體，購自北京中杉金橋公司。通用免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購自Thermo公司。

2.免疫組化檢測：采用SP法測定膽囊癌組織中的CD74以及EGFR的表達情況[11]。

3.Western blot檢測：組織蛋白提取并Western blot法檢測CD74在膽囊癌中的表達情況，將液氮中凍存的腫瘤組織秤取50 mg，液氮研磨后,提取蛋白，蛋白變性，電泳，轉膜，封閉，孵育一抗，孵育二抗，采用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃膜，分析。

4.免疫組化結果判定：免疫組化結果判定由2位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師獨立完成，其均對病人臨床資料未知。免疫組化圖片采用OLYMPUS BX53正置顯微鏡拍照。CD74陽性表達為細胞胞漿內有黃色或棕黃色沉著。每張病理切片隨機選擇5個200倍視野鏡下拍照。采用Image-pro Plus 6.0圖片分析軟件對染色的面積、密度、光密度值進行分析。綜合染色強度和細胞著色率對免疫組化結果進行評分：0分，不著色；1分，淡黃色著色；2分，黃色染色；3分，棕黃色染色。對于細胞著色率亦進行評分：0分，0～5%細胞著色；1分，6%～25%細胞著色；2分，26%～50%細胞著色；3分，>50%細胞著色。綜合每張切片的平均染色強度評分和平均細胞著色率評分之和，0分陰性，1～2分弱陽性，3分陽性，4～6分強陽性。0～2分定義為陰性表達，3～6分定義為陽性表達[12]。

三、統(tǒng)計學方法

應用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。CD74表達情況比較采用χ2檢驗，多因素Logistic回歸分析顯著性差異的因素 。應用Spearman秩相關性分析CD74表達水平與EGFR水平的相關性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

在正常膽囊組織中CD74呈陰性表達。54例膽囊癌病人中CD74的表達情況與臨床病理特征的關系見表1。通過Logisitic多因素分析表明，腫瘤的浸潤深度和TNM分期是影響CD74表達的獨立因素(見表2)。在膽囊癌組織中分化程度低的膽囊癌組織CD74表達強于分化程度好的膽囊癌組織(圖1)。Western blot技術分析同樣印證了CD74在分化差的膽囊癌組織中表達上調(圖2)。54例病人中，CD74的表達與性別、年齡無明顯差異性(P>0.05);分化差的膽囊癌中CD74的表達高于中分化及低分化膽囊癌。反應腫瘤浸潤程度的T分期，T分期晚的膽囊癌組織CD74表達高于T分期較早的膽囊癌組織，但與腫瘤組織的N分期尚無明顯差異；TNM分期較早的膽囊癌與分期較差的膽囊癌組織中CD74的表達具有明顯差異(表1)。EGFR在膽囊癌中的表達情況見圖3。通過免疫組化分析細胞漿中陽性染色情況，54例膽囊癌切片，均有EGFR的陽性表達(評分>3分)。通過Spearman秩相關分析CD74與EGFR表達的相關性，結果表明，CD74的IHC的IOD值與EGFR的IOD值呈正相關。CD74在不同分化程度的膽囊癌組織中的IOD值以及同EGFR之間的相關性，見圖4。

表1 CD74在膽囊癌中的表達與病人臨床病理特征的關系(例)

CD74在膽囊癌組織中的表達情況。A：PBS陰性對照組；B：正常膽囊組織中CD74的表達情況；C：高分化膽囊癌組織中CD74的表達情況；D：中分化膽囊癌組織中CD74D的表達情況；E：低分化膽囊癌組織中CD74的表達情況；F：陽性對照(結腸癌組織)

表2 腫瘤分化程度、浸潤深度以及TNM分期的多因素Logistic分析

P:低分化的膽囊癌組織；W：高分化膽囊癌組織;M:中分化的膽囊癌組織圖2 Western blot 檢測不同分化程度的膽囊癌組織中CD74的表達情況

A：與高分化組比較，aP<0.05；與中分化組比較，bP<0.05;B：中CD74的表達IOD值與EGFR呈正相關，系數(shù)為0.607

討論

膽囊癌的臨床表現(xiàn)與慢性膽囊炎以及膽石癥有一定的重疊，絕大多數(shù)膽囊癌病人就診時，疾病大多處于進展期。進展期膽囊癌的預后差，其5年生存率約為32%[13]，是消化系疾病中預后較差的腫瘤之一。

A：低表達； B：高表達圖3 EGFR在膽囊癌中的表達情況(SP×200)

CD74在血液系統(tǒng)腫瘤以及多種實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。本研究結果表明，CD74在膽囊癌組織中過表達，且在低分化膽囊癌中的表達明顯高于高分化膽囊癌。Western blot結果提示，CD74的表達在低分化膽囊癌中表達升高，這同樣在蛋白水平印證了實驗結果。CD74的表達與膽囊癌的分化程度、腫瘤浸潤深度即T分期以TNM分期具有明顯的相關性，其差異有統(tǒng)計學意義，而與病人的年齡、性別以及淋巴結轉移情況無明顯相關性，TNM分期與淋巴結轉移有明顯關聯(lián)。本研究結果表明，CD74在54例膽囊癌病人中有35例陽性表達，其中T3-T4分期有25例，與膽囊癌的浸潤深度有明顯差異，但在有無淋巴結轉移方面，淋巴結轉移陽性病人中CD74的表達有18例，無淋巴結轉移組CD74陽性有17例,通過線性分析淋巴結轉移情況與T分期的相關性，其結果表明，T分期與淋巴結轉移情況無明顯相關性，差異無統(tǒng)計學意義。

CD74是MHC-Ⅱ的固定鏈，是一種跨膜蛋白，其在抗原提呈細胞如B細胞、單核細胞以及巨噬細胞中的表達明顯升高，D-CD74復合物對于宿主的免疫反應具有抑制作用，此作用促進了腫瘤細胞的增殖。大量研究表明，CD74在惡性腫瘤中的過表達可以阻斷腫瘤細胞內源性的抗原提呈作用，從而導致免疫逃逸。在B細胞淋巴瘤以及多發(fā)性骨髓瘤中CD74已經(jīng)被報道作為一種新的治療靶點，在非血液系統(tǒng)惡性腫瘤中如胃癌，腎癌以及非小細胞肺癌中CD74也已經(jīng)被報道作為一種新的標志物，且具有預測預后的作用[14-15]。

在本研究中，低分化膽囊癌組織中CD74的免疫組化平均IOD值高于中分化以及高分化膽囊癌組織，Western blot 結果同時印證了這樣的結果。CD74的致癌機制與MIF具有重要的關聯(lián)，MIF是重要的炎癥因子，CD74與MIF復合物是作為受體/配體復合物參與慢性炎癥及慢性炎癥向腫瘤發(fā)展的過程。其可能的機制是通過封閉p53這種抑癌基因，阻礙p53的跨膜行為，阻止p53進入細胞核內，阻斷其所介導的凋亡過程。因此，導致細胞的增殖增多，介導上皮增殖[16-17]。CD74與MIF的復合物還可以通過EGFR增加上皮細胞的增殖，EGFR作為多種實體腫瘤的靶向治療點，其參與腫瘤的增殖、遷徙以及浸潤轉移的重要過程[18]。CD74與MIF復合體通過上體白細胞介素-8來上調EGFR的表達水平，而EGFR是生長因子家族的重要成員之一，其主要功能為調控細胞的生長、增殖以及分化，在正常細胞的生理過程中其作用十分重要。目前，在腫瘤細胞中，針對EGFR靶點的治療已經(jīng)廣泛應用，如肺癌、腎癌等實體腫瘤[19]。本研究通過Spearman秩相關得出以下結論，CD74的表達水平與EGFR呈正相關，即膽囊癌中高表達CD74的樣本中EGFR的表達同樣高表達，CD74可能與細胞的EGFR具有相關性，其可能是治療膽囊癌的潛在治療靶點之一。

綜上，通過免疫組化以及Western blot分析CD74以及EGFR在膽囊癌中的表達，結果表明，CD74與EGFR呈正相關,且與病人的臨床病理特征明顯相關，CD74是參與膽囊癌發(fā)生發(fā)展的重要因子。