LilrB2蛋白與Aβ(16-21)雙鏈的結(jié)合*

吳汶澤，李曉毅

(中國科學(xué)院大學(xué)材料科學(xué)與光電技術(shù)學(xué)院 材料科學(xué)與光電技術(shù)中心， 北京 100049)

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD)是一類神經(jīng)退行性疾病，是威脅人類身體健康的重大隱患之一。有報告指出，全球約有4 000萬人罹患阿爾茲海默癥，而這個數(shù)字預(yù)計將每20年增加一倍。Aβ1-42是阿爾茲海默癥患者的患病標志物之一，一方面，Aβ1-42寡聚態(tài)對神經(jīng)細胞具有毒性，可誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡。另一方面，Aβ1-42寡聚態(tài)可與神經(jīng)細胞上的某些受體結(jié)合，導(dǎo)致其下游通路上突觸損失，造成認知障礙[1-2]。針對Aβ1-42寡聚態(tài)所帶來的危害，目前有2種抑制思路：一是以Aβ1-42寡聚態(tài)為靶點，設(shè)計藥物抑制Aβ1-42寡聚態(tài)的活性，降低Aβ1-42寡聚態(tài)對人體造成的影響；二是以Aβ1-42寡聚態(tài)的受體蛋白為靶點，抑制受體蛋白的活性從而達到緩解AD癥狀的效果，而后者的優(yōu)勢在于在AD發(fā)病的早期就可以看到明顯的效果[3]。

基于上述想法，尋找Aβ1-42寡聚態(tài)的靶向蛋白是一個重要問題。Taeho等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)小鼠上PirB蛋白是Aβ1-42受體之一，PirB與Aβ1-42寡聚態(tài)的結(jié)合會使得下游通路上的cofilin(AD另一種患病標志物)量增大，小鼠有明顯的認知水平缺失，通過比較人類與小鼠的同源基因，發(fā)現(xiàn)人神經(jīng)細胞上lilrB2蛋白會與Aβ1-42寡聚態(tài)結(jié)合，且造成下游通路上的cofilin量增大。屏蔽lilrB2蛋白與Aβ1-42寡聚態(tài)的結(jié)合可作為一種藥物靶向來設(shè)計針對AD的抑制劑。更進一步，Qin等[3]研究了lilrB2與Aβ1-42的結(jié)合，比較發(fā)現(xiàn)，Aβ16-21雙分子鏈可代表Aβ1-42寡聚態(tài)，作為與lilrB2蛋白結(jié)合的核心抗原基，研究lilrB2與Aβ16-21雙分子鏈的結(jié)合機理有助于設(shè)計相應(yīng)的抑制劑。而目前關(guān)于lilrB2蛋白抑制劑先導(dǎo)化合物的研究報道還較少，研究lilrB2與其天然配體的結(jié)合模型對尋找和設(shè)計先導(dǎo)化合物有重要意義。

計算機輔助藥物設(shè)計(computer-aided drug design,CADD)是隨著分子生物學(xué)，計算機技術(shù)發(fā)展而應(yīng)運而生的一種研究手段，由于其快速，高效以及可程序化的特點，計算機輔助滲透到新藥研發(fā)的各個方面。與傳統(tǒng)藥物設(shè)計相比，CADD可顯著提高藥物研發(fā)的成功率，降低研發(fā)成本，縮短研發(fā)周期[5-6]?；谑荏w結(jié)構(gòu)的藥物分子設(shè)計是CADD應(yīng)用的方法之一，即在已知受體三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過分子對接以及分子動力學(xué)的方法研究受體與配體相互作用的方式和特點，從而為設(shè)計受體蛋白抑制劑提供分子層面的支持[7-10]。

目前，關(guān)于lilrB2蛋白抑制劑先導(dǎo)化合物的研究報道較少，本文以lilrB2蛋白為靶點，通過分子對接和分子動力學(xué)的方法，研究lilrB2蛋白與其配體Aβ16-21雙分子鏈之間結(jié)合的方式以及相互作用的熱點氨基酸殘基，為lilrB2蛋白抑制劑先導(dǎo)化合物的尋找和設(shè)計提供分子層面的數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 模型搭建

本文所使用的lilrB2蛋白受體(PDB ID 2GW5)和Aβ16-21雙分子鏈(PDB ID 3OW9)的結(jié)構(gòu)均來源于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫RCSB PDB。LilrB2蛋白包含184個氨基酸殘基，形成2個結(jié)構(gòu)域，2個結(jié)構(gòu)域向外伸展，如圖1所示。

圖1 lilrB2三維結(jié)構(gòu)圖(飄帶模型)

Aβ16-21雙分子鏈有12個氨基酸殘基，雙鏈呈反平行結(jié)構(gòu)，每條鏈上的氨基酸相同，結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 Aβ16-21雙分子鏈三維結(jié)構(gòu)圖(棍狀模型)

從蛋白數(shù)據(jù)庫獲取晶體結(jié)構(gòu)后，首先利用分子動力學(xué)優(yōu)化其結(jié)構(gòu)。lilrB2蛋白在溶液環(huán)境中優(yōu)化90 ns，取平衡軌跡中不同的2幀結(jié)構(gòu)(均方回轉(zhuǎn)半徑分別為1.96和2.02 nm)用于對接。Aβ16-21雙分子鏈在溶液環(huán)境中優(yōu)化50 ns，取平衡軌跡中1幀結(jié)構(gòu)用于對接。將lilrB2蛋白和Aβ16-21雙分子鏈進行分子對接，所得結(jié)果如圖3所示。

圖3 利用分子對接軟件得到的對接復(fù)合物結(jié)構(gòu)圖

由2幀lilrB2結(jié)構(gòu)和1幀Aβ16-21雙分子鏈，得到3個不同結(jié)合方式的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。為探明lilrB2蛋白和Aβ16-21雙分子鏈結(jié)合方式的特點以及結(jié)合時重要的氨基酸殘基，分別以3個復(fù)合物結(jié)構(gòu)為起始構(gòu)象，在溶液環(huán)境下進行分子動力學(xué)模擬，分別用P1,P2,P3表示。P1和P2進行90 ns的平衡模擬，P3進行80 ns的平衡模擬。

1.2 分子對接和分子動力學(xué)模擬

分子對接所使用的軟件為autodock 4.2[11]，對接方式為剛性對接。分子動力學(xué)模型搭建使用的軟件是VMD[12]，分子動力學(xué)運行所使用的軟件是NAMD 2.13軟件包[13]，采用CHARMM27[14]力場，溶液環(huán)境所用水分子模型為TIP3P[15]，使用周期性邊界條件，體系到水盒子邊界距離設(shè)定為1.5 nm，體系中添加Na+和Cl-，濃度0.15 mol/L。模擬是在NPT系綜下進行的，壓強1 atm，溫度300 K。范德華相互作用閾值設(shè)置為1.2 nm。采用粒子網(wǎng)格(PME)方法處理靜電相互作用。所有模擬積分步長均為1 fs。本文數(shù)據(jù)均使用origin 9.1軟件作圖。

1.3 氫鍵分析

氫鍵是分析復(fù)合物結(jié)合穩(wěn)定性的重要指標。本文使用VMD HBonds Plugin 1.2進行氫鍵的統(tǒng)計和分析，所采用的距離閾值為0.35 nm，角度閾值為30°。

2 結(jié)果與討論

2.1 均方根偏差

通過分子對接和分子動力學(xué)模擬，得到了以不同構(gòu)象為起始點的3組軌跡。對這3組軌跡進行數(shù)據(jù)整理，首先，計算得到這3組軌跡的均方根偏移(root-mean-square deviation,RMSD)值隨時間變化的圖像，如圖4所示。RMSD數(shù)據(jù)一方面可以反映在模擬過程中復(fù)合物結(jié)構(gòu)是否有大的起伏，觀察受體蛋白和配體結(jié)合方式在哪個時間段上發(fā)生了變化。另一方面，RMSD是反映體系狀態(tài)是否穩(wěn)定的一個重要指標。

圖4 RMSD隨時間的變化曲線

從圖4可以看到，P1體系在40～50 ns的階段RMSD值有一個明顯的波動，P2在20～30 ns階段RMSD值有一個明顯的波動，而P3的RMSD值一直在0.3 nm附近變動。分析發(fā)現(xiàn)，這種波動是由于lilrB2蛋白和Aβ16-21雙分子鏈的結(jié)合方式發(fā)生了改變。也就是說，lilrB2蛋白和Aβ16-21雙分子鏈的結(jié)合傾向了一種更穩(wěn)定的狀態(tài)。這種狀態(tài)正是我們所要探究的，所以以3個不同構(gòu)象作為起始點進行模擬，以期找到lilrB2蛋白和Aβ16-21雙分子鏈結(jié)合狀態(tài)的共通點。從圖4中還可以看到，P1，P2，P3這3組體系的RMSD值最后都穩(wěn)定在0.3 nm附近，3組體系均已達到平衡狀態(tài)。

2.2 氫鍵占有率

對P1體系30～40 ns和50～60 ns時間段做氫鍵占有率的分析，選取了排名前3的數(shù)據(jù)來分析，數(shù)據(jù)見表1。

這里的氫鍵是通過殘基間的距離和角度來判定的，也就是依據(jù)殘基間的幾何特征來判定氫鍵是否存在，所有在設(shè)定閾值內(nèi)的殘基相互作用都被判定為氫鍵。氫鍵占有率是指在所截取的時間段內(nèi)，該氫鍵出現(xiàn)的頻率。

從表1數(shù)據(jù)可以看出，從30～40 ns階段到50～60 ns階段，ARG77-ALA12的氫鍵占有率由41.20%降到了11.40%，在50～60 ns階段，氫鍵占有率排第1的是ASP23-LYS7，為17.10%。殘基對之間的氫鍵占有率變化暗示著P1體系中受體和配體之間的結(jié)合方式發(fā)生了一些變化。

對P2體系10～20 ns和30～40 ns時間段做氫鍵占有率的分析，數(shù)據(jù)見表2。

由表2中數(shù)據(jù)可見，在10～20 ns時間段內(nèi)，ARG77-ALA12的氫鍵占有率排在第1，為69.10%，而在30～40 ns時間段，ASP23-LYS7的氫鍵占有率居首位，為90.70%，這暗示著P2體系中受體和配體之間的結(jié)合方式也發(fā)生了變化。

結(jié)合表1和表2，lilrB2蛋白和Aβ16-21雙分子鏈之間的結(jié)合方式發(fā)生改變，且在改變之后，ASP23和LYS7的氫鍵占有率一直排在首位，考慮到LYS是堿性氨基酸，帶1個正電荷，ASP是酸性氨基酸，帶1個負電荷，ASP和LYS之間容易形成較強的離子相互作用，所以推測ASP23和LYS7之間的相互作用可能是使得lilrB2蛋白和Aβ16-21雙分子鏈之間結(jié)合形成更穩(wěn)定狀態(tài)的因素之一。

表1 P1中相互作用殘基的氫鍵占有率

表2 P2中相互作用殘基的氫鍵占有率

為進一步研究這一種狀態(tài)的結(jié)合方式，對3組軌跡的最后10 ns數(shù)據(jù)進行氫鍵分析，依舊選取氫鍵占有率排名前三的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)見表3。

根據(jù)表3中數(shù)據(jù)，P1體系中氫鍵占有率最高的是ASP23-LYS7，為43.00%;其次是CYS142-VAL3，為16.40%;排第3的是GLU140-PHE5,占有率為6.50%。P2體系中氫鍵占有率最高的是ASP23-LYS7，為83.70%;排第2的是SER24-ALA6，為32.20%;排第3的是ASP93-LYS1，占有率是8.90%。P3體系中氫鍵占有率最高的是ASP23-LYS1;排第2的是CYS138-LYS1，為33.90%;CYS142-PHE10的氫鍵占有率為22.00%，排第3。結(jié)合來看，lilrB2蛋白上的ASP23殘基與Aβ16-21雙分子鏈上的LYS殘基之間的相互作用對lilrB2蛋白和Aβ16-21雙分子鏈的結(jié)合起到了很大的穩(wěn)定作用。而對于其它氨基酸殘基，疏水作用也對復(fù)合物的穩(wěn)定性起到了重要作用，在不同結(jié)合狀態(tài)下，有CYS142對Aβ16-21支鏈上VAL的作用，SER24對Aβ16-21支鏈上ALA的作用，CYS142對Aβ16-21支鏈上PHE的作用。也就是說，lilrB2與Aβ16-21雙分子鏈形成的復(fù)合物具有較好的穩(wěn)定性，且維持著一種動態(tài)平衡，在這種動態(tài)平衡中，ASP23與Aβ16-21支鏈上LYS殘基的離子相互作用對復(fù)合物的結(jié)合有著重要的影響，而在受體和配體不同結(jié)合狀態(tài)下，lilrB2蛋白上CYS142和SER24殘基與Aβ16-21支鏈上VAL、PHE、ALA殘基的疏水作用也有利于lilrB2蛋白和Aβ16-21雙分子鏈結(jié)合。

表3 3組體系中相互作用殘基的氫鍵占有率

3 結(jié)論

本文通過分子對接和分子動力學(xué)模擬的方法研究lilrB2蛋白和Aβ16-21雙分子鏈的結(jié)合模型以及在結(jié)合中起重要作用的氨基酸殘基。通過設(shè)置3個不同構(gòu)象作為分子模擬的起始點，得到3組不同的模擬軌跡，分析發(fā)現(xiàn)在受體和配體結(jié)合過程中l(wèi)ilrB2蛋白上的ASP23殘基與Aβ16-21支鏈上的LYS殘基有較強的相互作用，對受體和配體結(jié)合起到了重要的影響。在受體和配體不同結(jié)合狀態(tài)下，CYS142和SER24殘基與Aβ16-21支鏈上VAL、PHE、ALA殘基的疏水作用也有利于lilrB2蛋白和Aβ16-21雙分子鏈結(jié)合。