磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路參與龍葵堿抑制PC-3細(xì)胞增殖與凋亡過程的機(jī)制研究※

喬澤昀,王 鵬,趙文兵

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué),山西 晉中 030619;2.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,山西 太原 030013)

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤之一,發(fā)病率較高。雄激素剝奪療法在前列腺癌的晚期治療中起著重要作用,然而多數(shù)患者在治療14～30個(gè)月后都會(huì)進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌,患者生存期較短[1-2]。龍葵堿是一種由茄科植物龍葵提取分離出的生物堿,具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,其機(jī)制可能與靶向作用于腫瘤細(xì)胞內(nèi)、外源性凋亡途徑的多個(gè)靶點(diǎn)有關(guān)[3]。磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的存活和抗凋亡中發(fā)揮重要作用,其中活化的Akt[磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)]可以磷酸化多種與細(xì)胞存活相關(guān)的下游底物,從而抗細(xì)胞凋亡[4-5]。本研究主要觀察PI3K/AKt信號(hào)通路在龍葵堿體外誘導(dǎo)人前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖與凋亡機(jī)制中的作用,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人前列腺癌PC-3細(xì)胞株取自山西中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室;CCK8試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技有限公司;小牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;龍葵堿(純度≥99%)購(gòu)自曼斯特(成都)生物科技有限公司;用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡的試劑盒來源于宇恒(蘇州)生物科技有限公司;PI3K、p-Akt、Bax、Akt、Bcl-2、Caspase-3、磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶(p-PI3K)等抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取前列腺癌PC-3細(xì)胞株,培養(yǎng)基選擇DMEM培養(yǎng)基(含10%小牛血清),在37℃、5%CO2混合氣體環(huán)境的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)前需加入100 U/m L青霉素和100μg/m L鏈霉素以保證環(huán)境穩(wěn)定。2～3 d為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞換液,實(shí)驗(yàn)細(xì)胞約3～5 d可進(jìn)行傳代。

1.3 應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)龍葵堿對(duì)PC-3細(xì)胞增殖抑制率 從培養(yǎng)好的PC-3細(xì)胞株中選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,保證細(xì)胞存活率等條件相同,同樣選取DMEM培養(yǎng)基(含10%的小牛血清),保證培養(yǎng)基完好,再添加0.25%胰蛋白酶促成消化反應(yīng),經(jīng)過上述步驟后,把實(shí)驗(yàn)細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞密度為5×104個(gè)/m L,再把單細(xì)胞懸液接種在96孔板上,每孔約100μL,接種完畢后,在37℃、5%CO2混合氣體環(huán)境的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)完畢后,將20μL不同濃度(0.5、2、8μg/m L)的龍葵堿分別注入孔板的每個(gè)孔中。在對(duì)照組(不加入任何藥物)中,需要在每組中再多設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,每個(gè)復(fù)孔呈平行狀態(tài),培養(yǎng)24、48、72 h后,再測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)完畢后,需要在每個(gè)孔中再加入10μL的CCK-8溶液,置于37℃、5%CO2混合氣體環(huán)境條件下持續(xù)培養(yǎng),時(shí)間約為2 h。最后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光值(OD值),細(xì)胞增殖抑制率(%)＝(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%。

1.4 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)龍葵堿對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響 制備細(xì)胞,選取培養(yǎng)好的對(duì)數(shù)期實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,保證細(xì)胞培養(yǎng)成功率的前提下進(jìn)行細(xì)胞接種,密度定為2.0×105個(gè)/m L,實(shí)驗(yàn)分組方法同前。將分好組的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)完畢后,取出并放入15 m L離心管內(nèi),加入胰酶將其制為成單細(xì)胞懸液,注意貼壁細(xì)胞需要用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌,最后依照儀器說明書檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。

1.5 應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)PI3K/Akt通路中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及凋亡過程中Bax、Bcl-2、Caspase-3等相關(guān)蛋白的表達(dá) 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞PC-3取出,在保證培養(yǎng)成功率的前提下,接種于4個(gè)培養(yǎng)瓶中,每組1瓶,4組分別記錄為對(duì)照組(生理鹽 水)、低劑量組 (0.5μg/m L)、中劑量組(2μg/m L)、高劑量組(8μg/m L)。細(xì)胞貼壁后棄上清液,分別添加藥物后在同一條件下培養(yǎng)24 h。收集全部細(xì)胞,在4℃條件下用PBS緩沖液洗滌兩次,添加預(yù)冷好的細(xì)胞裂解緩沖液,進(jìn)行冰上裂解。15 min后將裂解產(chǎn)物在4℃條件下10 000×g離心30 min取上清液。確保步驟完善及樣本無(wú)誤后,用Bradford法測(cè)蛋白濃度。將等量的樣品在15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)分離,電泳完畢后,在37℃條件下,將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,再用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h,分別與Bcl-2、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K等抗體,在37 ℃條件下持續(xù)反應(yīng)2 h,再用辣根酶標(biāo)記的第二抗體在37℃條件下持續(xù)反應(yīng)1 h,用磷酸緩沖鹽溶液(PBST)充分洗滌兩次,每次15 min,使用DAB進(jìn)行顯色并進(jìn)行記錄和掃描,之后用抗actin抗體進(jìn)行檢測(cè),確認(rèn)上樣量最終是否一致。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組比較采用方差分析,組間比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 龍葵堿對(duì)PC-3細(xì)胞的增殖抑制作用 MTT結(jié)果顯示,龍葵堿可抑制PC-3細(xì)胞的增殖,PC-3細(xì)胞增殖抑制率隨龍葵堿濃度提高和作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高,與對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 龍葵堿對(duì)PC-3細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2 龍葵堿對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果顯示,龍葵堿呈濃度依賴性地進(jìn)行誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡,PC-3細(xì)胞凋亡百分率隨龍葵堿濃度提高而升高。見表2、圖1。圖1。

圖1 不同濃度龍葵堿處理24 h對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響

2.3 龍葵堿作用PC-3細(xì)胞 PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt及凋亡過程中 Bax、Bcl-2、Caspase-3、P53表達(dá)變化 Western blot結(jié)果顯示,龍葵堿可呈濃度依賴性地下調(diào)p-PI3K、Bcl-2、p-Akt蛋白表達(dá),上調(diào)Bax、Caspase-3、P53蛋白表達(dá)。對(duì)Akt、PI3K無(wú)明顯影響。見表3、4及圖2。

表3 不同濃度龍葵堿處理PC-3細(xì)胞24 h后磷酸化蛋白激酶B、蛋白激酶B、磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶、磷脂酰肌醇-3-羥激酶蛋白的表達(dá)(±s)

表3 不同濃度龍葵堿處理PC-3細(xì)胞24 h后磷酸化蛋白激酶B、蛋白激酶B、磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶、磷脂酰肌醇-3-羥激酶蛋白的表達(dá)(±s)

注:p-Akt,磷酸化蛋白激酶B;Akt,蛋白激酶B;PI3K,磷脂酰肌醇-3-羥激酶;p-PI3K,磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶。

組別 p-Akt Akt p-PI3K PI3K高濃度組 0.24±0.02 0.52±0.02 0.21±0.12 0.55±0.03中濃度組 0.28±0.01 0.54±0.01 0.25±0.01 0.57±0.02低濃度組 0.31±0.01 0.54±0.01 0.28±0.02 0.59±0.01對(duì)照組 0.37±0.01 0.54±0.01 0.36±0.03 0.60±0.01 F值 34.68 1.15 30.48 2.51 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＞0.05

表4 不同濃度龍葵堿處理PC-3細(xì)胞24 h后Bax、Bcl-2、Caspase-3、P53蛋白的表達(dá)(±s)

表4 不同濃度龍葵堿處理PC-3細(xì)胞24 h后Bax、Bcl-2、Caspase-3、P53蛋白的表達(dá)(±s)

組別 Bax Bcl-2 Caspase-3 P53高濃度組 0.46±0.01 0.22±0.03 0.43±0.07 0.39±0.14中濃度組 0.44±0.01 0.30±0.02 0.39±0.04 0.34±0.01低濃度組 0.36±0.03 0.35±0.03 0.35±0.03 0.31±0.01對(duì)照組 0.28±0.03 0.40±0.01 0.25±0.01 0.22±0.02 F值 28.28 8.61 7.91 27.64 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖2 不同濃度龍葵堿作用于PC-3細(xì)胞24 h后PI3K/Akt通路中磷酸化蛋白激酶B、蛋白激酶B、磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶、磷脂酰肌醇-3-羥激酶蛋白及凋亡過程中Bax、Bcl-2、P53-Caspase-3等蛋白的表達(dá)

3 討論

龍葵堿是從龍葵中提取出的一種生物堿?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,龍葵堿是龍葵發(fā)揮藥理作用的主要成分,包括茄堿、茄解堿、澳洲茄堿及澳洲茄邊堿等[3]。近年研究發(fā)現(xiàn),龍葵堿可誘發(fā)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、抑制腫瘤血管生成等方面抑制前列腺癌、宮頸癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、腦膠質(zhì)瘤等多種腫瘤的生長(zhǎng)[6-9]。

本研究主要觀察PI3K/AKt信號(hào)通路在龍葵堿體外誘導(dǎo)人前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖與凋亡機(jī)制中的作用,結(jié)果顯示龍葵堿可抑制PC-3細(xì)胞增殖,PC-3細(xì)胞增殖抑制率隨龍葵堿濃度提高和作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高(P＜0.05),即呈濃度依賴性,此結(jié)論初步證實(shí)龍葵堿在體外環(huán)境下的抗腫瘤作用。細(xì)胞凋亡作為腫瘤細(xì)胞主動(dòng)性程序性死亡的過程,是抗腫瘤或抑制腫瘤細(xì)胞周期生長(zhǎng)的重要機(jī)制[10]。Bcl-家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡通路的基因中起到重要作用,包括抗凋亡基因Bcl-2及促凋亡基因Bax。P53與線粒體的凋亡密切相關(guān),可促進(jìn)Noxa、Puma及Bax等凋亡相關(guān)基因的表達(dá),與抑凋亡蛋白Bcl-x L等相結(jié)合,從而釋放Bax,還可直接和Bax、Bak結(jié)合并使之激活[11-12]。本研究結(jié)果表明,龍葵堿可呈濃度依賴性地下調(diào)p-PI3K、Bcl-2、p-Akt蛋白表達(dá)(P＜0.05),上調(diào)Bax、Caspase-3、P53蛋白表達(dá)(P＜0.05);流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明,龍葵堿呈濃度依賴性地進(jìn)行誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡,PC-3細(xì)胞凋亡百分率隨龍葵堿濃度提高而升高(P＜0.05),提示龍葵堿可能通過抑制Bcl-2蛋白表達(dá),加強(qiáng)Bax蛋白表達(dá),激發(fā)PT通道的開放,使線粒體通透性加強(qiáng),導(dǎo)致在細(xì)胞外面的Ca2+大量進(jìn)入細(xì)胞中,過量的Ca2+使線粒體的電位下降;另一方面使線粒體膜內(nèi)相對(duì)高滲,基質(zhì)膨脹,導(dǎo)致外膜破裂,從而釋放細(xì)胞色素C,細(xì)胞色素C進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi),激活Caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致Caspase-3的活化而誘導(dǎo)凋亡發(fā)生[13-15]。

PI3K/Akt信號(hào)通路與腫瘤衰亡密切相關(guān),同時(shí)該通路也參與許多重要的生物學(xué)過程。信號(hào)通路中的AKT可影響其下游的多種效應(yīng)分子如Bcl-2等,從而發(fā)揮其抗凋亡作用,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡抑制。相關(guān)研究表明,PI3K/Akt信號(hào)通路與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[16-18]。目前,PI3K/Akt信號(hào)通路在龍葵堿誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡的過程中的作用未見相關(guān)報(bào)道。在本研究中,龍葵堿呈濃度依賴性地降低PI3K、Akt磷酸化水平,說明龍葵堿可能通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡。

綜上所述,龍葵堿可抑制PC-3細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。本研究證實(shí)龍葵堿對(duì)PC-3細(xì)胞具有體外抑制作用,為龍葵堿的臨床應(yīng)用提供了新的理論基礎(chǔ),同時(shí)也為相關(guān)藥物的研制提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),然而龍葵堿對(duì)前列腺癌細(xì)胞是否存在體內(nèi)抑制作用尚不明確。此外,在龍葵堿抑制PC-3細(xì)胞增殖與凋亡過程中PI3K/AKT信號(hào)通路是否與其他通路存在相互作用,仍待進(jìn)一步研究證實(shí)。