基于網絡藥理學的佩蘭干預2型糖尿病作用機制研究※

李光美,張 婷,趙 偉

(1.貴州中醫(yī)藥大學,貴州 貴陽 550002;2.貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院,貴州 貴陽 550001)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一種以高血糖、相對缺乏胰島素、胰島素抵抗等為主要特征的代謝性疾病,發(fā)病率較高,已成為我國公共衛(wèi)生領域面臨的主要問題。中醫(yī)在治療糖尿病及其并發(fā)癥方面具有顯著療效。《素問·奇病論》曰:“此人必數(shù)食甘美而多肥也……轉為消渴,治之以蘭,除陳氣也?！痹撜撌鲋鲝堖\用芳香化濁之佩蘭治療糖尿病。佩蘭具有芳香化濕、醒脾開胃、發(fā)表解暑的功效,尤善治脾經濕熱。相關研究表明,佩蘭可下調T2DM大鼠肝臟中DGAT 2基因與蛋白表達,改善脂代謝紊亂[1-2],同時,佩蘭的主要成分香芹酚可減輕T2DM患者的內皮細胞功能障礙和血管炎癥[3]。但佩蘭治療T2DM的更多活性成分、作用靶點及通路尚有待探究。“濁毒”是指體內痰飲、水濕、瘀血不能及時排出而壅積化生的病理產物,又是損傷人體臟腑經絡及氣血陰陽的致病因素[4],濁毒為患被認為是糖尿病及其并發(fā)癥的核心所在[5]。網絡藥理學可以從活性成分-靶點、靶點蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析及基因本體(gene ontology,GO)、京都基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析等進行直觀、全面、系統(tǒng)地闡述藥物與疾病的潛在關系。本研究主要基于網絡藥理學方法探討佩蘭干預2型糖尿病的作用機制,以期為后期臨床研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 佩蘭活性成分、靶點檢索及篩選與“活性成分-靶點”網絡圖的構建 以佩蘭為關鍵詞,從TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中獲取藥物活性成分。將口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、藥物相似性(drug likeness,DL)≥0.18作為篩選條件[6],從而得到目標活性成分及蛋白靶點,并在Uni-Prot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)標準化蛋白質靶點信息。再將其篩選出的活性成分和標準靶點導入Cytoscape 3.7.2版軟件,構建“活性成分-靶點”網絡圖。

1.2 T2DM的疾病靶標獲取及交集靶點的獲取 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com),搜索關鍵詞為“Diabetes Mellitus”或“Diabetes”,篩選關鍵詞為“TypeⅡDiabetes mellitus”或“TypeⅡdibetes”,得出T2DM的疾病靶點,并將其與篩選得到的佩蘭靶點通過韋恩圖(Draw Venn Diagram)得到交集靶點。

1.3 構建“藥物-疾病”蛋白互作PPI圖 將佩蘭干預T2DM的蛋白靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫平臺(https://www.string-db.org)構建PPI網絡圖,再將所得數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化處理分析,以度值(degree)和連接評分(combined score)分析靶點之間相互的作用關系。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路分析 運用Metascape(https://metascape.org/gp/index.html/main/step1)對篩選得到的佩蘭干預T2DM的潛在蛋白靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析,以P＜0.01作為篩選條件,對富集的通路和GO功能排序,運用微生信在線(http://www.bioinformatics.com.cn)及Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化處理,并構建佩蘭干預T2DM的關鍵靶點及信號通路網絡圖,進一步闡述蛋白靶點與通路的相關性。

2 結果

2.1 佩蘭活性成分及靶點篩選結果 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共獲得60個佩蘭的已知成分,以OB≥30%和DL≥0.18作為篩選條件獲得11個活性成分,剔除在TCMSP數(shù)據(jù)庫未找到相關蛋白靶點的4個成分,共納入佩蘭的7個活性成分(見表1),再將其通過TCMSP數(shù)據(jù)庫得到相應靶點名稱,去重后得到87個蛋白靶點,將其蛋白靶點名稱輸入UniProt數(shù)據(jù)庫,獲得其標準化蛋白靶點名稱共79個。

表1 佩蘭活性成分

2.2 藥物“活性成分-靶點”網絡圖的構建 將佩蘭的活性成分與蛋白靶點通過Cytoscape 3.7.2軟件構建網絡圖,網絡圖共包含86個節(jié)點(7個活性成分和79個靶點)和101條線,其中菱形節(jié)點代表活性成分,正六邊形節(jié)點代表蛋白靶點,線代表活性成分與蛋白靶點的關系,其中活性成分與degree和節(jié)點(betweenness)呈正相關[7]。結果顯示,木犀草素(luteolin)、豆甾醇(Stigmasterol)、澤蘭苦素(Eupatoriopicrin)等在網絡圖中具有樞紐作用,這可能是佩蘭干預T2DM的關鍵活性成分。見圖1。

圖1 佩蘭干預2型糖尿病藥物活性成分靶點圖

2.3 獲取T2DM的疾病靶標及“藥物-疾病”交集靶標 通過Genecards數(shù)據(jù)庫獲取T2DM靶點,以Relevance score≥24.2作為標準,獲得1 209個蛋白靶點。分別將佩蘭與T2DM的蛋白靶點導入韋恩圖后得到45個交集靶點。見表2。

表2 佩蘭干預2型糖尿病的有效靶點

2.4 “藥物-疾病蛋白互作”PPI圖 將二者交集蛋白靶點導入STRING在線數(shù)據(jù)庫,限定物種為“Homo sapiens”,選取相互作用閾值高于0.9的高置信度數(shù)據(jù),隱藏無蛋白互作關系的靶點[8]后得到37個節(jié)點、114條邊、平均節(jié)點度數(shù)為5.07的蛋白互作PPI網絡圖。繼將其導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化處理分析,以degree值和combined score值分析靶點之間相互的作用關系。節(jié)點的形狀大小代表degree值,圓形越大,degree值越高,反之越低;節(jié)點之間連線的粗細代表combined score值,線條越粗,互作分數(shù)越高,反之越低,以此篩選出網絡中信息傳遞效率更高、影響作用更大的核心靶點。結果顯示AKT1(protein kinase B)、TP53(tumor suppressor p53)、JUN(Jun Proto-Oncogene)、IL6(Interleukin 6)、TNF(Tumor Necrosis Factor)、VEGFA(vascular endothelial growth factor A)、MAPK1(mitogen-activated protein kinase 1)為其核心靶點。見圖2。

圖2 佩蘭干預2型糖尿病核心蛋白靶點PPI網絡圖

2.5 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析運用Metascape數(shù)據(jù)庫對佩蘭干預T2DM的45個靶點進行GO功能和KEGG信號通路富集分析。GO分析得到1 290個GO條目(P＜0.01),其中生物過程(biological process,BP)1 187個,細胞組成(cellular component,CC)46個,分子功能(molecular function,MF)57個,將三者可信度前10的條目運用微生信在線進行可視化處理(見圖3),結果主要涉及氧化應激反應、細胞凋亡通路等生物過程。KEGG通路富集分析獲得242條通路(P＜0.01),篩選出可信度前18的信號通路,利用微生信在線進行可視化處理(圖4),主要涉及癌癥通路(Pathways in cancer)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、白細胞介素-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、胰島素抵抗信號通路(insulin resistance)、AGE/RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic)等。并將篩選出的信號通路利用Cytoscape3.7.2軟件進行可視化處理,得出靶點-通路網絡圖。見圖5。

圖3 佩蘭干預2型糖尿病核心靶點GO富集分析圖

圖4 核心靶點KEGG通路富集分析

圖5 靶點-通路網絡圖

3 討論

3.1 佩蘭治療T2DM的有效成分分析 本研究采用網絡藥理學方法預測佩蘭干預T2DM的主要活性成分及蛋白靶點。根據(jù)藥物活性成分靶點圖可知,木犀草素作為佩蘭的主要活性成分,可能在干預T2DM的方面發(fā)揮重要作用。木犀草素是一種黃酮類化合物,具有抗氧化、抗炎和神經保護活性。目前認為代謝性炎癥與T2DM密切相關,是T2DM的一個關鍵組成部分,可導致胰島素抵抗[9]。研究發(fā)現(xiàn),木犀草素夠明顯改善早期糖尿病大鼠心功能,減少心室肥大[10],在治療T2DM血管內皮及血管功能障礙中發(fā)揮抗炎作用[11],并減輕糖尿病大鼠的氧化應激反應和膽堿酯酶活性,改善神經元損傷和認知能力[12]。基于以上研究,可見木犀草素在治療T2DM及其并發(fā)癥方面療效顯著,可能與其抑制代謝炎癥作用有關,這也與本研究篩選出的佩蘭干預T2DM的活性成分吻合。

3.2 佩蘭治療T2DM的有效靶點分析 從PPI圖可知,AKT1、TP53、IL6、TNF等作為核心靶點可能在佩蘭干預T2DM過程中發(fā)揮重要作用。AKT也被稱為蛋白激酶B,對細胞遷移和生長的調控至關重要,AKT1作為AKT的一種亞型在人體中廣泛表達,主要通過磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)和m TOR復合物2(m TORC2)被激活[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)AKT可直接抑制Fox01,而降低體內葡萄糖水平[16]。腫瘤抑制基因TP53位于17號染色體上,TP53的多態(tài)性已成為癌癥研究的熱點,同時也有研究證實了TP53中的rs1042522與T2DM的風險有顯著的相關性[17]。IL-6在炎性反應中處于重要地位,IL6R是miR-22的靶基因,通過JAK/STAT信號通路的miR-22調控,抑制T2DM胰島β細胞的存活和凋亡[18]。TNF為腫瘤壞死因子,其作為炎性反應的核心因子參與了糖尿病發(fā)生發(fā)展的過程,TNF-α的表達與空腹血糖水平呈顯著正相關[19],抑制TNF-α的表達使胰島素敏感性增加,過度表達則誘發(fā)胰島素抵抗[20]。以上研究表明,本研究篩選出的佩蘭治療T2DM的蛋白靶點多與細胞凋亡、炎性反應相關。胰島β細胞分泌缺乏、功能下降甚至細胞凋亡是T2DM發(fā)生發(fā)展的關鍵原因,根據(jù)本研究的預測,佩蘭可能通過抑制胰島細胞凋亡,抑制炎癥因子釋放而治療T2DM。

3.3 佩蘭治療T2DM的GO富集分析及KEGG通路分析 根據(jù)靶點-通路網絡圖可知,PI3 K-Akt信號通路、AGE/RAGE信號通路、IL-17信號通路、胰島素抵抗信號通路等與T2DM密切相關。PI3K/AKT信號通路是胰島素代謝的主要途徑,該通路增加葡萄糖利用并減少肝臟和肌肉中的糖異生,進而調節(jié)脂質和葡萄糖代謝平衡[21-23],并在T2DM高血糖癥、神經退行性變,以及動脈粥樣硬化斑塊病理性新血管的形成和發(fā)展中起到抑制作用[24]。AGE/RAGE信號通路在高血糖和鈣化條件下,可以通過PKC、p38 MAPK、fetuin-A、TGF-β、NF-κB 和 ERK1/2 信 號 通路極大影響細胞和全身對增加骨基質蛋白的反應,并通過激活Nox-1和降低SOD-1的表達來增加氧化應激以促進糖尿病介導的血管鈣化[25],是糖尿病周圍神經病變及糖尿病腎病發(fā)病的重要機制[26]。IL-17信號通路是一種參與免疫反應的細胞因子,研究發(fā)現(xiàn),IL-17與纖維化相關的糖尿病性心肌病相關[27],且IL-17信號通路可能是種植體周圍炎和T2DM病之間的主要分子機制[28]。胰島素抵抗信號通路蛋白包括PI3K/Akt、PKC、MAPK、AMPK、NF-κB等[29]。李建萍等[30]初步發(fā)現(xiàn)丹參-紅花配伍對于胰島素信號通路中代謝調控途徑和有絲分裂調控途徑的穩(wěn)態(tài)失衡具有顯著的調控作用?；谝陨险撌?佩蘭作用于多條通路對T2DM發(fā)揮干預作用,但具體機制還有待深入研究。

4 小結

本研究采用網絡藥理學方法對佩蘭干預T2DM的復雜機制作了簡單探索,得出了佩蘭干預T2DM的主要活性成分、蛋白靶點及相關通路多與細胞凋亡、炎癥因子相關,為探索芳香化濁藥物對T2DM的干預作用作了基礎鋪墊。結合本項目組前期研究成果,以佩蘭為君藥的中藥復方“濁毒清”有效治療T2DM及其并發(fā)癥[31-34]。臨床研究表明,濁毒清改善胰島素抵抗的機制與其抗炎作用有關,濁毒清可通過降低炎癥因子水平、抑制代謝性炎性反應進而改善胰島素抵抗[35],但其發(fā)揮作用的主要活性成分及作用通路還有待研究,后續(xù)將在本研究的基礎上,提取相關活性成分,探討佩蘭干預T2DM的具體作用機制,為臨床運用佩蘭提供更多的理論基礎。