間充質(zhì)干細(xì)胞在椎間盤(pán)退變中作用△

王向陽(yáng)，劉永輝，石 洋，崔宏勛

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州 450000；2.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院，河南省骨科醫(yī)院，河南鄭州 450000）

腰痛是世界主要疾病負(fù)擔(dān)之一，其預(yù)防和治療是公共衛(wèi)生計(jì)劃中的一個(gè)重要挑戰(zhàn)，并且產(chǎn)生了巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)和健康影響[1]。盡管導(dǎo)致腰痛原因復(fù)雜多樣，但研究發(fā)現(xiàn)椎間盤(pán)退變（intervertebral disc degeneration,IDD）是導(dǎo)致慢性腰痛的重要原因之一[2]。IDD主要特征是其內(nèi)部區(qū)域髓核細(xì)胞的丟失和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）分解。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSC）是一種多能干細(xì)胞，易于獲取，在一定條件下能夠分化為椎間盤(pán)細(xì)胞，同時(shí)能夠分泌多種營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)組織穩(wěn)態(tài)以及免疫調(diào)節(jié)，這些特性對(duì)于修復(fù)IDD具有重要意義，因此它作為一種創(chuàng)新的生物治療方法逐漸引起了研究人員的注意，現(xiàn)將MSC在IDD修復(fù)中的研究成果及臨床應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1 MSC概述

MSC是在體外和體內(nèi)均具有廣泛增殖能力的潛能干細(xì)胞，在特定誘導(dǎo)條件下可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)及冷凍保存后仍具有多向分化潛能。Friedenstein等[3]于1968年首次從大鼠骨髓中分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs），他描述了這種能夠分泌生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的成纖維細(xì)胞樣種群，后來(lái)由Caplan等[4]首先提出的成人“間充質(zhì)干細(xì)胞”的一般概念是為適應(yīng)源自胚胎中胚層的細(xì)胞的概念而出現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)MSC能夠從脂肪組織、肺、牙髓、外周血、滑膜、子宮內(nèi)膜等諸多組織中分離出來(lái)[5]，且具有多重生理特性，主要為多能性、營(yíng)養(yǎng)能力、歸巢/遷移、免疫抑制等[6，7]。目前MSC已被廣泛應(yīng)用于臨床治療中，在組織修復(fù)、血液系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等多個(gè)領(lǐng)域研究中展現(xiàn)了光明的前景。

2 MSC修復(fù)退變椎間盤(pán)的作用機(jī)制及對(duì)比

2.1 MSC增殖與多向分化潛能

MSC具有廣泛的增殖和分化能力，這是其區(qū)別于其他成體細(xì)胞的顯著特征之一，MSC增殖分化的健康細(xì)胞能夠重新填充受損椎間盤(pán)，在恢復(fù)正常的組織平衡的同時(shí)能夠抑制椎間盤(pán)的退化級(jí)聯(lián)[8]。Risbud等[9]率先證實(shí)了BMSCs在低氧和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1作用下可向類(lèi)髓核細(xì)胞分化，之后研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤(pán)中低氧、高滲和機(jī)械負(fù)荷的特殊環(huán)境有助于MSC獲得椎間盤(pán)細(xì)胞樣表型，并能促進(jìn)合成ECM的結(jié)構(gòu)成分合成[10]，但也有學(xué)者研究認(rèn)為，椎間盤(pán)中無(wú)血管、低糖、低pH值的環(huán)境，可能會(huì)導(dǎo)致植入的細(xì)胞無(wú)法長(zhǎng)期存活，基于MSC增殖分化機(jī)制的修復(fù)功能可能受到限制，不足以誘導(dǎo)椎間盤(pán)的再生[11]。

2.2 MSC的“歸巢”特性

MSC的歸巢特性是維持組織穩(wěn)態(tài)并促進(jìn)組織修復(fù)的重要機(jī)制之一。MSC通過(guò)響應(yīng)損傷、免疫或物理化學(xué)信號(hào)而被動(dòng)員，并遷移至效應(yīng)位點(diǎn)，進(jìn)而發(fā)揮作用，該過(guò)程受到信號(hào)分子、氧氣和機(jī)械信號(hào)的嚴(yán)格梯度控制[12]。Illien-Jünger等[13]在離體培養(yǎng)的牛椎間盤(pán)中證實(shí)了MSC的歸巢，與模擬生理?xiàng)l件下的椎間盤(pán)相比，退化變性椎間盤(pán)表現(xiàn)出對(duì)MSC較強(qiáng)的吸引性，且顯著增加了蛋白聚糖的合成。Sakai等[14]在小鼠模型中同樣證實(shí)了MSC的歸巢，并發(fā)現(xiàn)其遷移效率與椎間盤(pán)變性的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。Wangler等[15]發(fā)現(xiàn)，MSC的歸巢能夠可激活Tie2陽(yáng)性祖細(xì)胞群，表達(dá)Tie2的椎間盤(pán)細(xì)胞是具有分化潛能的祖細(xì)胞群，一旦激活，可以分裂產(chǎn)生子細(xì)胞，子細(xì)胞能夠遷移到損傷部位，并最終分化成修復(fù)受損組織所需的細(xì)胞類(lèi)型。但是，Tie2陽(yáng)性祖細(xì)胞的比例會(huì)隨著衰老和椎間盤(pán)變性而降低，從而導(dǎo)致椎間盤(pán)再生修復(fù)能力的喪失，MSC歸巢提高了椎間盤(pán)中Tie2細(xì)胞的比例?？偠灾壳把芯科毡檎J(rèn)為MSC歸巢對(duì)退變的椎間盤(pán)有非常積極的影響，包括免疫調(diào)節(jié)作用，合成代謝基因的上調(diào)，細(xì)胞存活和增殖以及生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生[16]，通過(guò)MSC歸巢機(jī)制開(kāi)辟關(guān)于內(nèi)源修復(fù)策略的新方法也將是今后研究重點(diǎn)。

2.3 MSC旁分泌作用

MSC的旁分泌作用能夠以細(xì)胞外囊泡的方式分泌產(chǎn)生的大量生物活性因子（生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子及外泌體等）并作用于鄰近的細(xì)胞，這些因子在關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程的調(diào)節(jié)中起著重要作用[17]。Shim等[18]將BMSCs和變性椎間盤(pán)細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)過(guò)程中，BMSCs降低了白細(xì)胞介素-1a、白細(xì)胞介素-1b、白細(xì)胞介素-6、和腫瘤壞死因子-a等各種促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)水平，這些基因共同參與了ECM的降解。同時(shí)表皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、成骨蛋白-1、生長(zhǎng)分化因子-7和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-b等生長(zhǎng)因子基因表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，此外，共培養(yǎng)的退變椎間盤(pán)細(xì)胞中ECM的積累量大于單獨(dú)培養(yǎng)細(xì)胞。Cao等[19]研究也驗(yàn)證了BMSCs可能通過(guò)同時(shí)上調(diào)細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β和下調(diào)炎癥信號(hào)分子NF-κB的途徑來(lái)延遲髓核細(xì)胞基質(zhì)的變性。隨著越來(lái)越多的證據(jù)表明炎癥與腰背痛的發(fā)展相關(guān)[20]，MSC通過(guò)旁分泌機(jī)制調(diào)控炎癥反應(yīng)可能比其再生性質(zhì)更重要。

2.4 不同來(lái)源MSC的比較

盡管已發(fā)現(xiàn)了多種MSC細(xì)胞類(lèi)型和來(lái)源，但依據(jù)取材難度，分化能力、增殖能力不同，目前用于椎間盤(pán)修復(fù)的MSC的主要來(lái)源是椎間盤(pán)本身（髓核組織、纖維環(huán)、軟骨終板中的駐留干細(xì)胞或原代細(xì)胞）及骨髓和脂肪組織。在細(xì)胞獲取方面，相較于椎盤(pán)源性干細(xì)胞分離的較低效率及BMSCs的較高侵入性，脂肪來(lái)源干細(xì)胞（adipose mesenchymal stem cells,ADSCs）在豐富性和易于分離收集方面優(yōu)勢(shì)明顯[21]。在細(xì)胞增殖分化方面，不同來(lái)源的MSC表征和分化潛力有所不同，但不同文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果存在差異，這可能是樣本來(lái)源、試驗(yàn)方法不同所致。Liang等[22]比較了軟骨終板源性干細(xì)胞（cartilage endplate-derived stem cells,CESCs）、髓核源性干細(xì)胞（nucleus puplposusderived stem cells,NPSCs）、纖維環(huán)源性干細(xì)胞（annulus fibrosus-derived stem cells,AFSCs）三種椎間盤(pán)源性MSC，發(fā)現(xiàn)三者細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯差異，但NPSCs和AFSCs的細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于CESCs，在分化相關(guān)基因的表達(dá)方面，AFSCs要強(qiáng)于NPSCs和CESCs。Zhou等[23]研究發(fā)現(xiàn)，與BMSCs相比，ADSCs較少依賴(lài)線粒體呼吸來(lái)產(chǎn)生能量，因此能夠較好地適應(yīng)缺氧環(huán)境，同時(shí)ADSCs具有較低的人白細(xì)胞抗原I類(lèi)抗原表達(dá)水平和較高的免疫抑制能力，在調(diào)節(jié)炎癥方面可能更具優(yōu)勢(shì)，此外有研究發(fā)現(xiàn)ADSCs較BMSCs可以分化為更具NP樣表型的細(xì)胞[24]。綜上所述，不同來(lái)源的MSC均能夠分化成椎間盤(pán)所需細(xì)胞來(lái)促進(jìn)修復(fù)，但椎間盤(pán)源性干細(xì)胞不僅具有普通干細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)特性，同時(shí)因其內(nèi)源性特點(diǎn)，在椎間盤(pán)修復(fù)有著巨大潛力，ADSCs在獲取、增殖分化能力、免疫調(diào)節(jié)等方面較其他來(lái)源細(xì)胞更具有優(yōu)勢(shì)，也可以作為修復(fù)IDD優(yōu)秀的干細(xì)胞來(lái)源。

3 MSC應(yīng)用進(jìn)展

3.1 MSC臨床研究

從臨床的角度來(lái)看，MSC是非常有吸引力的，因?yàn)樗鼈兛梢园踩貜幕颊呓M織中分離出來(lái)，并且其免疫原性幾乎可以忽略不計(jì)，自體移植和同種異體移植都可以進(jìn)行，且無(wú)需免疫抑制藥物[25，26]。Sakai等[27]于2003年首次提出了干細(xì)胞移植治療IDD的方法，此后，在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，各研究團(tuán)隊(duì)逐步開(kāi)始進(jìn)行臨床研究。Noriega等[28]對(duì)24例保守治療無(wú)效的的慢性腰痛患者進(jìn)行的一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示，接受MSC治療的患者在功能指標(biāo)上顯示出快速而顯著的改善，且長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn)（42個(gè)月），即使在接受治療數(shù)月以后，仍可以觀察到IDD逐步的改善，包括含水量增加、Pfirrmann評(píng)分下降；而安慰劑組沒(méi)有疼痛或殘疾的任何改善，1年后，Pfirrmann評(píng)分甚至顯著惡化。Centeno等[[29]對(duì)33例慢性腰痛患者進(jìn)行了培養(yǎng)擴(kuò)增的自體BSMCs治療，隨訪期長(zhǎng)達(dá)6年；患者疼痛評(píng)分及改良SANE評(píng)分均明顯改善，MRI顯示85%的患者的椎間盤(pán)膨出尺寸平均減小了23%，此外，未發(fā)生感染、腫瘤、異位骨化等任何不良事件。由此可見(jiàn)，MSC治療IDD具有較好的療效及安全性。Pettine等[30]的研究中，26例椎間盤(pán)源性腰痛患者接受了自體BMSCs注射治療，并接受了2年隨訪。在接受治療1年后，患者視覺(jué)模擬評(píng)分和Oswestry有了顯著的改善，磁共振成像發(fā)現(xiàn)8例患者的椎間盤(pán)高度增加，Pfirrmann評(píng)分有所改善，值得注意的是研究還發(fā)現(xiàn)患者疼痛緩解的總次數(shù)和速率與注射BMSCs濃度相關(guān)。Pettine等[31]的另一項(xiàng)研究中也報(bào)告了類(lèi)似的結(jié)果，接受多次BMSCs注射治療的患者ODI和VAS評(píng)分改善速度更快，幅度更高。盡管臨床應(yīng)用MSC治療取得了積極進(jìn)展，但關(guān)于其適應(yīng)證選擇及安全問(wèn)題也引起了關(guān)注，適應(yīng)證的選擇對(duì)于MSC治療的效果至關(guān)重要，但目前無(wú)明確標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)前研究認(rèn)為MSC治療更適用于處于IDD的早期，Pfirrmann分級(jí)為三級(jí)或四級(jí)的單節(jié)段IDD所引起的的中度慢性背痛[32]。綜上，MSC的臨床應(yīng)用仍處于萌芽階段，盡管研究證實(shí)了MSC治療能夠降低患者疼痛并改善IDD情況，但需要進(jìn)一步研究以確定哪些患者是合適的治療對(duì)象，此外MSC合適的注射方法、次數(shù)及劑量、長(zhǎng)期效果及安全性也需進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

3.2 MSC聯(lián)合生物材料支架

MSC的分化增殖過(guò)程中，易受到生長(zhǎng)因子和內(nèi)環(huán)境的影響，目前針對(duì)椎間盤(pán)應(yīng)用已經(jīng)開(kāi)發(fā)了基于膠原、透明質(zhì)酸、藻酸鹽和纖維蛋白等多種支架。Chen等[33]使用光交聯(lián)的明膠-透明質(zhì)酸水凝膠支架，移植ADSCs后置入大鼠體內(nèi)；結(jié)果顯示，該支架能夠激活αVβ6-TGF-β1通路從而促進(jìn)ADSCs向椎間盤(pán)細(xì)胞分化、增強(qiáng)修復(fù)效果。Frauchiger等[34]將工程絲絨膜復(fù)合材料作為BMSCs支架，并在其中加入GDF-6、TGF-β3基因，體外培養(yǎng)后觀察到支架的應(yīng)用提高了細(xì)胞存活率，同時(shí)GDF-6和TGF-β3的加入使BMSCs分化為更趨近椎間盤(pán)細(xì)胞的表型。周逸馳等[35]應(yīng)用多能誘導(dǎo)干細(xì)胞結(jié)合海藻酸鈉鹽微球凝膠支架置入兔椎間盤(pán)退變模型，結(jié)果顯示支架的應(yīng)用使得椎間盤(pán)內(nèi)蛋白多糖和Ⅱ型膠原增加更顯著，且顯著降低MMP3蛋白表達(dá)，有效改善了椎間盤(pán)退變。除了人工材料制作的支架外，天然生物材料，如來(lái)自椎間盤(pán)的脫細(xì)胞基質(zhì)，因其天然的ECM成分對(duì)MSC分化具有良好誘導(dǎo)作用，也展現(xiàn)出了巨大潛力[36]。綜上，利用MSC與生物材料支架相結(jié)合的組織工程方法既可以為MSC提供合適的環(huán)境，促進(jìn)其增殖分化避免損害，同時(shí)支架中的某些藥物成分能夠控制MSC的分化傾向，此外應(yīng)用支架能夠減少細(xì)胞滲漏損失，降低由滲漏引起的異位骨贅形成的風(fēng)險(xiǎn)[37]，因此未來(lái)組織工程可能在椎間盤(pán)再生領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

綜上所述，基于MSC治療IDD得到了廣泛的研究，MSC可以補(bǔ)充椎間盤(pán)細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、釋放生長(zhǎng)因子，進(jìn)而修復(fù)椎間盤(pán)緩解患者癥狀，目前的體外及體內(nèi)試驗(yàn)表明MSC療法效果及安全性較高，但最佳細(xì)胞來(lái)源、細(xì)胞預(yù)處理、注射量等問(wèn)題仍然尚未清楚，此外如何評(píng)估椎間盤(pán)再生的效果，其長(zhǎng)期療效及潛在不良反應(yīng)也還需要研究。對(duì)于某些椎間盤(pán)疾病患者，MSC細(xì)胞的再生療法彌補(bǔ)保守治療和積極手術(shù)之間的鴻溝，但治療的具體適應(yīng)證仍需進(jìn)一步明確。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，支架技術(shù)的應(yīng)用提高了MSC治療的效果及安全性，也將推動(dòng)MSC在臨床的應(yīng)用。