宏基因組測序在骨關(guān)節(jié)感染診斷中的應(yīng)用前景△

李 韜，高琪樂，劉少華，郭超峰

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院骨科脊柱外科，湖南長沙 410008）

骨關(guān)節(jié)感染（osteoarticular infections,OAIs），又稱骨和關(guān)節(jié)感染（bone and joint infections,BJIs），包括假體周圍關(guān)節(jié)感染（periprosthetic joint infections，PJIs）、骨髓炎等，在世界范圍內(nèi)都很常見。假體周圍關(guān)節(jié)感染（PJIs）是關(guān)節(jié)置換術(shù)后的災(zāi)難性并發(fā)癥，目前其全球發(fā)病率約為2%[1]?；颊吣挲g以及相關(guān)微生物的類型和菌株，均會影響骨關(guān)節(jié)感染的嚴(yán)重程度和治療療效。因此，鑒定病原微生物是診斷和調(diào)整抗生素治療的必要條件，但傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)的高陰性率給臨床治療方案的選擇帶來了很大的困擾及挑戰(zhàn)[2,3]。目前仍然沒有好的方法或技術(shù)來確定引起骨和關(guān)節(jié)感染的病原體，以便早期正確治療。近年來，興起的宏基因組測序（metagenomic next-generation sequencing,mNGS）/臨床宏基因組（clinical metagenomics,CMg），包括第二代和第三代測序，已被用于檢測包括關(guān)節(jié)液在內(nèi)的多個(gè)樣本中的病原體[4]。

本文總結(jié)了傳統(tǒng)技術(shù)在OAIs/BJIs診斷中的應(yīng)用和現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)勢及局限性，并討論了mNGS在OAIs診斷中的潛力，展望mNGS在未來的應(yīng)用前景。

1 骨關(guān)節(jié)感染病原體鑒定的現(xiàn)狀

骨關(guān)節(jié)感染（OAIs），可能對骨骼發(fā)育和功能造成嚴(yán)重后果，需要早期診斷和及時(shí)的規(guī)范治療[5]。因此，及早鑒定OAIs病原體對于治療及減少其相關(guān)并發(fā)癥極為重要。

OAIs的傳統(tǒng)診斷技術(shù)包括培養(yǎng)、病原特異性抗體或抗原的檢測和微生物核酸（DNA或RNA）的分子鑒定，最常用的方法是聚合酶鏈反應(yīng)。然而，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法雖然是大多數(shù)醫(yī)院的主要診斷方法，但是時(shí)間長、靈敏度低，而且受到許多因素的影響，如以前使用抗生素、病原體的選擇性和生物膜粘附種植體表面的能力[6]。近年來，分子診斷學(xué)已廣泛應(yīng)用于OAI的診斷，然而，不能識別真菌和多微生物感染，并且敏感性不高[7]。雖然有多種檢測病原體的綜合方法，但高達(dá)60%的病例無法檢測出致病菌，這迫使醫(yī)生使用廣譜抗生素，增加了耐藥細(xì)菌的發(fā)病率[8]。

在2017年之前，宏基因組學(xué)還未應(yīng)用于BJIs樣本[9]。在2017年，有研究報(bào)道m(xù)NGS方法的使用顯著提高了骨關(guān)節(jié)感染患者的病原體檢測（敏感性88%，特異性89%）[10]。在2018年的國際共識會議上，第二代測序技術(shù)被明確推薦為診斷假體周圍關(guān)節(jié)感染的重要補(bǔ)充檢查[11]。

2 傳統(tǒng)檢測方法和技術(shù)

傳統(tǒng)的微生物學(xué)培養(yǎng)是鑒定病原體的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，培養(yǎng)不僅對培養(yǎng)基和人員有要求，而且速度慢、靈敏度低，在鑒定罕見的病原微生物和病毒方面的應(yīng)用有限。初步結(jié)果通常需要2～3 d，確診則需要1周或更長時(shí)間[12]。

組織病理學(xué)檢查可用于區(qū)分致病菌的強(qiáng)弱毒性。組織病理學(xué)檢查診斷PJI的敏感性為38.8%～96.6%，特異性為77%～100%，但未能檢出致病菌[13]。

大量研究表明，分子診斷的敏感性高于常規(guī)培養(yǎng)[14]。16S rDNA PCR等分子檢測方法結(jié)合DNA測序可以提供比培養(yǎng)更快、更準(zhǔn)確的結(jié)果，在國外已得到廣泛應(yīng)用[3]。Juchler等[15]發(fā)現(xiàn)分子 PCR 無法檢測骨關(guān)節(jié)感染中的大量微生物，因此需要開發(fā)新的鑒定技術(shù)[10]。此外，分子檢測方法不能識別真菌和多微生物感染，而且不是高度敏感[7,8]。因此，分子檢測是早期診斷的輔助檢測手段，而不是傳統(tǒng)培養(yǎng)的替代方法。發(fā)展一種快速、方便、特異的診斷方法是十分必要的。

靶向測序，如原核生物的16S rRNA測序，真核生物的18S rRNA測序，真菌的ITS rRNA測序，通過測序基因組的目標(biāo)部分來識別病原體。對于選定的樣本，它是高通量和敏感的檢測，但是，它只涵蓋選定的基因而不是整個(gè)基因組，依賴于已知微生物數(shù)據(jù)庫，可能無法充分分析新的微生物[16]。

3 宏基因組測序/臨床宏基因組學(xué)

臨床宏基因組學(xué)是一個(gè)新興的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。mNGS是一種對患者樣本中微生物和宿主遺傳物質(zhì)（DNA和RNA）進(jìn)行綜合分析的技術(shù)，近年來逐步被應(yīng)用于臨床實(shí)踐，為醫(yī)生診斷和治療傳染病提供了有力證據(jù)[4]。mNGS直接測序臨床標(biāo)本中微生物基因序列，克服了培養(yǎng)的缺點(diǎn)。Voelkerding等[17]總結(jié)了mNGS對基礎(chǔ)基因組學(xué)研究的重大影響，并預(yù)測了其在不久的將來應(yīng)用于臨床的潛力。自2013年以來，基于第三代測序（單分子實(shí)時(shí)測序）的新興技術(shù)逐漸被用于病原體鑒定。Huang等[18]應(yīng)用mNGS診斷4例難治性非結(jié)核分枝桿菌肌肉骨骼感染，所有患者最后通過靶向抗生素抗感染和手術(shù)治愈，表明mNGS是一種新型的檢測病原體的方法，預(yù)示著mNGS在未來有良好的應(yīng)用前景[19]。

與常規(guī)方法相比，mNGS有許多優(yōu)點(diǎn)。最初的大量研究表明，mNGS在傳染病診斷方面優(yōu)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法[10，20，21]，這意味著這種新的臨床檢測方法也具有排除感染的能力。Miao等[21]在511份樣本中比較mNGS和培養(yǎng)對微生物檢出率的影響，發(fā)現(xiàn)mNGS診斷傳染病的敏感性和特異性分別為50.7%和85.7%，優(yōu)于培養(yǎng)物，特別適用于結(jié)核分枝桿菌、病毒、厭氧菌和真菌。Huang等[22]發(fā)現(xiàn)mNGS檢測到的病原菌總體比例明顯高于傳統(tǒng)培養(yǎng)，這可能是診斷OAIs的最佳方法。此外，Wang等[23]比較了mNGS與廣式聚合酶鏈反應(yīng)（BR-PCR）診斷PJIs患者關(guān)節(jié)液中病原體的一致性，發(fā)現(xiàn)mNGS比BR-PCR檢測更敏感。許多研究表明，mNGS可以在培養(yǎng)結(jié)果為陰性的情況下識別病原體，甚至在使用抗生素治療的情況下，或在病原體很少出現(xiàn)的情況下[18]，證明了基于mNGS的方法可以識別罕見的病原體[24]。Miao等[21]也發(fā)現(xiàn)mNGS不受抗生素使用的影響，是一種很有前途的病原學(xué)檢測技術(shù)。Huang等[22]采集了92例OAI患者的130份關(guān)節(jié)液、超聲液和組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)mNGS的總敏感性（88.5%）顯著高于微生物培養(yǎng)（69.2%），mNGS比培養(yǎng)診斷病原體更有價(jià)值，特別對于難以培養(yǎng)的病原體或曾使用抗生素治療的患者[22]。因此，mNGS 受抗生素治療的影響較小[22]，表明mNGS對檢測樣品中的低水平微生物或殘留核酸具有足夠的敏感性。此外，mNGS可以檢測出OAIs患者培養(yǎng)物中被遺漏的潛在病原體，有助于識別被低估的微生物，從而降低復(fù)發(fā)率[20]。目前，培養(yǎng)流程需要2～14 d，而mNGS在收到待測標(biāo)本后，只需24～48 h就能得到最終結(jié)果，這取決于臨床醫(yī)生使用的測序技術(shù)、模式和生物信息學(xué)軟件[25]。這將有助于臨床醫(yī)生盡早調(diào)整對患者的抗菌治療。

mNGS在傳染病診斷方面很有前途，并正迅速從研究轉(zhuǎn)向臨床實(shí)驗(yàn)室[21]。如引言部分所述，mNGS在2017年之前尚未應(yīng)用于BJI樣本[9]。但近年來，關(guān)于mNGS成功檢測出引起OAI的病原體越來越多。例如，Huang等[24]報(bào)道了一種PJI病原體，在血培養(yǎng)瓶中進(jìn)行7 d有氧和厭氧培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)沒有生長，但最終通過mNGS鑒定為微小單胞菌，并通過翻修手術(shù)和青霉素治療得以控制，這表明mNGS可能具有識別PJIs中培養(yǎng)陰性罕見病原體的潛力。Ruppé等[9]證明mNGS可以指導(dǎo)正確運(yùn)用抗生素，對單一和多細(xì)菌骨關(guān)節(jié)感染的敏感性分別為94.1%和76.5%，并發(fā)現(xiàn)臨床宏基因組學(xué)在OAI樣本中的應(yīng)用是支持傳統(tǒng)培養(yǎng)的潛在工具。Street等[10]的研究也發(fā)現(xiàn)mNGS可以為PJIs提供準(zhǔn)確的診斷信息，可能成為一套潛在的PJIs快速診斷工具的一部分。Thoendel等[26]報(bào)告了1例52歲的男子在全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后半年出現(xiàn)竇道炎癥，反復(fù)抗生素治療無效，所有培養(yǎng)和其他病原學(xué)測試均為陰性，最后利用mNGS在假體關(guān)節(jié)超聲振蕩液中檢測到唾液支原體，隨后通過PCR的靶向擴(kuò)增得到證實(shí)，這表明mNGS可以檢測到意外或難以檢測的病原體，并指導(dǎo)基于基因含量分析的治療[26]。Thoendel等[20]對 408 例髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的超聲液體樣本進(jìn)行檢測，mNGS檢測陽性率可達(dá)94.8%，與傳統(tǒng)檢測方法基本一致，此外，相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)陰性的樣本，mNGS的檢出率可達(dá)43.9%，表明對于范圍廣泛的PJI病原體，包括難以檢測導(dǎo)致培養(yǎng)陰性感染的病原體，宏基因組測序技術(shù)可能是一個(gè)強(qiáng)有力的工具[20]。Ivy等[27]利用 mNGS和傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測了168例全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)失敗需要翻修的假體關(guān)節(jié)液樣本，發(fā)現(xiàn)mNGS比培養(yǎng)具有更高的敏感性和特異性，可以檢測潛在的感染，這對培養(yǎng)陰性的患者特別有用。最近，發(fā)表在Nature Medicine的一篇論文也指出mNGS是診斷不明體液感染的一種有前途的工具[19]。因此，mNGS是診斷PJI的新型有力工具。

目前，一個(gè)完整的mNGS分析可以在24～48 h內(nèi)完成，成本約3 000元。由于目前的臨床實(shí)踐中mNGS的成本較高，大多數(shù)情況下只有在常規(guī)檢測失敗后才考慮使用[28]。雖然目前mNGS的價(jià)格相對昂貴，但對病原微生物的準(zhǔn)確識別非常重要，有效的抗菌治療可以改善預(yù)后，對康復(fù)和降低治療成本極為重要[29]。近年來，隨著mNGS的成本降低，運(yùn)用于診斷骨和關(guān)節(jié)感染的前景更加廣闊[10]，并最終可能取代一些方法如培養(yǎng)、抗原檢測和PCR方法，但仍有許多傳統(tǒng)方法，如病毒血清學(xué)測試，將繼續(xù)發(fā)揮感染診斷和研究的重要作用[28]。

在OAI樣品中運(yùn)用mNGS也存在一些限制。首先，mNGS也可能導(dǎo)致不正確或不一致的結(jié)果，甚至產(chǎn)生假陰性[20]，由于測序長度短、數(shù)據(jù)庫不完整等，可能會被錯(cuò)誤分類[30]。對mNGS報(bào)告的另一種解釋可能比較復(fù)雜的情況是，來自瞬時(shí)菌落、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境或空氣等背景信號的出現(xiàn)也會對mNGS檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾[31]，增加 mNGS 結(jié)果解釋的復(fù)雜性[8]。如何建立一個(gè)最佳閾值并從背景生物體中識別真正的病原體，對mNGS檢測而言仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。因此，在未來的臨床工作中，mNGS檢測還需要開發(fā)一種標(biāo)準(zhǔn)化算法，以便更準(zhǔn)確地區(qū)分致病微生物體和背景污染物。

mNGS在感染性疾病診斷方面具有很大的吸引力，特別是傳統(tǒng)檢測方法局限的領(lǐng)域[32，33]。mNGS是一項(xiàng)正在積極開發(fā)的復(fù)雜技術(shù)，受到成本、方法標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)分析工具等諸多因素的影響[32，34]。目前的研究正在努力解決這些不足[35]，mNGS也逐漸被越來越多的醫(yī)師視為診斷感染問題的最后手段。

總之，mNGS檢測速度快，具有高特異性和敏感性，能有效幫助臨床醫(yī)師開始精準(zhǔn)、早期的抗生素治療，并及時(shí)調(diào)整抗生素方案。它是骨和關(guān)節(jié)感染診斷方法的有效補(bǔ)充，甚至是必要的檢測方法。因此，mNGS可作為OAIs病原體檢測的有效診斷工具，在臨床運(yùn)用的前景將更加廣闊。