Xist lncRNA介導(dǎo)X染色體失活及應(yīng)用研究進展

陶維昆，劉 波，黃 飛，王 杰，高慶華，3

(1.新疆塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300；2.新疆塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，阿拉爾 843300)

X染色體失活(X chromosome inactivation,XCI)作為表觀遺傳調(diào)控的一種重要且獨特的機制，在雌性哺乳動物中可將一條X染色體包裝成異染色質(zhì)失去活性，使其基因功能受到抑制而沉默；在雌性哺乳動物中一條X染色體失去轉(zhuǎn)錄活性，一方面可平衡雌雄性間X連鎖基因表達(dá)水平，防止出現(xiàn)過度表達(dá)情況；另一方面可平衡X連鎖基因與常染色體間基因表達(dá)，上調(diào)有活性X染色體上的基因表達(dá)水平[1]。 X染色體失活中心(X chromosome inactivation center，XIC)是主要的調(diào)控區(qū)域，X-非活性特異性轉(zhuǎn)錄物(X-inactive specific transcript，Xist)位于該區(qū)域中，是調(diào)控染色體失活的主效基因。失活的染色體可誘導(dǎo)Xist編碼長15～17 kb的長鏈非編碼RNA(long chain noncoding RNA，lncRNA)，并在其上積累，同時招募其他因子對染色體進行修飾和沉默X連鎖基因。近年來，隨著Xist lncRNA的重要功能元件、RNA互作結(jié)合蛋白(RNA interaction binding protein，RBP)、下游染色體修飾和基因沉默途徑等方面的新發(fā)現(xiàn)越來越多，XCI引起了研究者的廣泛關(guān)注。對人、小鼠、兔和牛等物種研究發(fā)現(xiàn)，XCI在不同物種、不同時期及雌雄性胚胎之間存在差異[2-3]。此外，其與人類疾病也有關(guān)聯(lián)[4-5]，如Xist lncRNA作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)參與腫瘤和其他人類疾病的發(fā)展[6]。作為哺乳動物生物學(xué)基礎(chǔ)的重要組成部分，XCI在整個生命過程中發(fā)揮著不可替代的作用。作者就Xist lncRNA介導(dǎo)XCI的主要分子機理、調(diào)控機制及在不同物種中的研究進行綜述。

1 XCI發(fā)現(xiàn)與理論假說

1949年，Barr在雌貓有絲分裂間期神經(jīng)細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)一種小體；1960年，Ohno等發(fā)現(xiàn)在雌性動物細(xì)胞中含有異常固縮的染色體[7]；1961年，Lyon等證實其為一條無轉(zhuǎn)錄活性的X染色體，且在細(xì)胞增殖過程中會向后穩(wěn)定傳遞[8-9]。此后，研究者對這一生物學(xué)現(xiàn)象進行了總結(jié)[10]：①雌性哺乳動物細(xì)胞中僅有一條有轉(zhuǎn)錄活性的X染色體，另一條X染色體發(fā)生異常固縮而失活，其上大部分基因失去轉(zhuǎn)錄活性；②X染色體失活發(fā)生于胚胎早期發(fā)育過程中；③失活是隨機發(fā)生的，可為父源遺傳失活，也可為母源遺傳失活；④失活的X染色體在細(xì)胞的有絲分裂過程中能夠穩(wěn)定地向后傳遞。 X染色體失活中心(X chromosome inactivation center，XIC)、長散在重復(fù)序列元件(long interspersed nuclear elements，LINE)、L1重復(fù)序列元件等在染色體失活過程中對X染色體基因抑制沉默發(fā)揮著重要作用[11]。

2 XCI調(diào)控機理

2.1 XCI的3個階段

XCI是一種復(fù)雜的生物過程，伴隨DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)凝縮、多種相關(guān)復(fù)合物富集等多種生物學(xué)變化[12]。簡單來說，包括3個階段：①起始階段，細(xì)胞通過自主性表觀遺傳機制識別未來不活躍的X染色體，進而啟動并觸發(fā)在該X染色體上的Xist轉(zhuǎn)錄，并形成Xist lncRNA轉(zhuǎn)錄聚集；②建立階段，Xist lncRNA覆蓋到該X染色體上促使其大部分基因失去轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制其轉(zhuǎn)錄；③維持階段，失活的X染色體依舊能夠合成Xist lncRNA用以維持自身的失活狀態(tài)，在細(xì)胞經(jīng)過多個分裂周期后，失活的X染色體經(jīng)多次復(fù)制拷貝仍舊會保持這種失活狀態(tài)被傳遞。當(dāng)同一細(xì)胞核內(nèi)其中一條X染色體被作為失活染色體傳遞時，另一條X染色體在傳遞過程則保持該轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)被傳遞[13]。

2.2 Xist lncRNA在失活染色體上的擴散方式

Xist lncRNA結(jié)合到失活染色體上是X染色體失活的關(guān)鍵一步。目前關(guān)于Xist lncRNA在X染色體上結(jié)合與擴散方式仍存在不同說法。Gartler等[14]提出，可能存在一些站點式的位點促進和推動Xist lncRNA傳播，使X染色體上的基因發(fā)生沉默。X染色體上富含LINE類型的分散重復(fù)元件很有可能就是這些位點[15]，Xist lncRNA與特定的位點進行跳躍式的結(jié)合，并從少數(shù)有限的募集位點向外傳播可能是其中的一種模式。Xist lncRNA可能是利用染色體的空間結(jié)構(gòu)，最先失活與Xist基因空間位置上較接近的基因，而后隨著Xist lncRNA擴散至整條X染色體，最終使X染色體轉(zhuǎn)錄沉默[16-17]。Sunwoo等[18]在高分辨率顯微鏡下對小鼠單個細(xì)胞失活X染色體觀察時發(fā)現(xiàn)，Xist lncRNA量比預(yù)測的要少，推測Xist lncRNA的傳播可能存在著另一種“擊-跑模式(hit and run model)”。Simon等[19]借助RNA序列靶點捕獲雜交技術(shù)對4種處于不同階段的雌性小鼠細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)X染色開始失活時，Xist lncRNA先擴散至整條即將失活的X染色體靶向基因的富集區(qū)，然后富集區(qū)向靶向基因貧瘠區(qū)進一步擴散；利用鎖定核酸(locked nucleic acid,LNA)對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞Xist lncRNA進行去除發(fā)現(xiàn)，Xist lncRNA會在幾小時內(nèi)重新覆蓋到基因富集區(qū)和貧瘠區(qū)。因此，在維持階段當(dāng)XCI受到干擾時，細(xì)胞會自主啟動應(yīng)急機制，并短時間內(nèi)迅速恢復(fù)至X染色體失活狀態(tài)，不需要像最初失活時那樣由富集區(qū)向靶向基因貧瘠區(qū)進一步擴散，這一發(fā)現(xiàn)表明在XCI起始階段和維持階段Xist lncRNA擴散方式可能存在差異。此外，X染色體上富含的一些特殊元素可協(xié)助Xist與Xist lncRNA介導(dǎo)的順式傳播沉默，這一關(guān)鍵元素再一次被指向X染色體上富含的LINE重復(fù)片段[1，19]。

2.3 Xist及其反義轉(zhuǎn)錄本(Tsix)在XCI調(diào)控中的作用

XIC作為主要的調(diào)控區(qū)域，不活躍的X染色體能夠誘導(dǎo)XIC編碼的多個lncRNA調(diào)控，包括Xist和Tsix等結(jié)合到XIC，進而富集更多的染色體修飾相關(guān)復(fù)合物，促使蛋白質(zhì)沉積和形成異染色質(zhì)構(gòu)象[20]，從而抑制X染色體的轉(zhuǎn)錄活性。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Tsix在XIC中位置與Xist重疊，Tsix介導(dǎo)抑制Xist的轉(zhuǎn)錄活性，但具體分子機制尚未完全明確。Tsix參與Xist啟動子區(qū)組蛋白修飾狀態(tài)的轉(zhuǎn)換以及DNA甲基化酶Dnmt3a等的富集，然而在失活染色體的啟動子和增強子處，通常組蛋白乙酰化程度較高，組蛋白H3K4me3較為豐富，并促進組蛋白H3K36me3的富集[21-22]。此外，失活染色體在一定程度上也促進了其他相關(guān)的組蛋白富集，如H3K27me3、H2AK119ub1、H3K9me2/3和變體組蛋白macroH2A[23-24]。對Tsix缺失的XY胚胎干細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，胚胎早期發(fā)育過程中Xist基因表達(dá)呈顯著上調(diào)趨勢，Oct4、Nanog、Sox2等轉(zhuǎn)錄因子通過驅(qū)動Tsix的表達(dá)或抑制Xist激活因子Rnf12，從而抑制Xist[25]。Oct4通過與Tsix和Xist結(jié)合調(diào)控這一過程，胚胎干細(xì)胞中Oct4緊密結(jié)合在Xist基因內(nèi)含子上，直至分化過程中會逐漸減少，同時結(jié)合到Xist上的Tsix會增多[26]。因此充分肯定了Xist與Tsix的反義調(diào)控作用，同時表明這一過程中還有其他多種物質(zhì)和機制的參與。

2.4 Xist lncRNA參與介導(dǎo)XCI

Xist lncRNA與失活X染色體的結(jié)合使該條染色體轉(zhuǎn)錄活性明顯降低，在這該過程中Xist lncRNA所募集的蛋白通過直接或間接的方式參與介導(dǎo)XCI基因沉默的發(fā)生，如轉(zhuǎn)錄抑制蛋白SHARP(又稱SPEN)可能通過不同途徑與Xist相互作用，募集組蛋白脫乙酰酶HDAC3、甲狀腺激素受體SMRT[22]。在Xist lncRNA募集的成分中，數(shù)量最多的蛋白是核基質(zhì)蛋白HndrnpK，它參與到PRC1和PRC2復(fù)合物的募集中，導(dǎo)致抑制標(biāo)記物H2AK119ub和H3K27me3的沉積，從而促進沉默發(fā)生[23，27]。在失活X染色體上PRC2密度呈下降趨勢，而后趨于穩(wěn)定，而H3K27me3仍與Xist lncRNA的富集程度呈正相關(guān)[28]。由此說明，XCI過程中Xist lncRNA的豐富度與甲基化酶H3K27me3、多疏抑制復(fù)合體PRC2等存在密切互作機制。在X染色體異常固縮的活性轉(zhuǎn)變過程中，Xist lncRNA聚集在失活染色體之后才發(fā)生H2A1.2的募集增加和組蛋白H4的低乙?；?，而H3-K9的甲基化與Xist lncRNA結(jié)合到X染色體幾乎同步發(fā)生。說明在XCI過程中，Xist lncRNA募集的活性物質(zhì)存在時序性積累和作用順序。有研究認(rèn)為，SPOC結(jié)構(gòu)域是SPEN的一個關(guān)鍵區(qū)域，很可能是SPEN參與介導(dǎo)XCI并發(fā)揮作用的關(guān)鍵位點，但必須通過其他的HDAC3依賴途徑促使XCI基因沉默發(fā)生；進一步研究發(fā)現(xiàn)，Xist lncRNA能夠介導(dǎo)募集其他轉(zhuǎn)錄因子形成多梳抑制復(fù)合體PRC1、PRC2，并誘導(dǎo)組蛋白抑制標(biāo)記物H3K27me3，同時消除RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ)，從而保證CPG島DNA甲基化和組蛋白變體macroH2A的沉積，共同參與維持已失活基因保持該沉默狀態(tài)[28-29]。

3 染色體失活逃逸現(xiàn)象

由于X染色體上存在一些短的成對片段，這些片段若出現(xiàn)缺失或者重復(fù)會導(dǎo)致異常表型的發(fā)生，因此正常情況下X染色體上并不是所有基因都發(fā)生失活。位于X和Y染色體擬常染色質(zhì)區(qū)域(pseudo-autosomal region,PAR)的成對基因可能存在失活逃逸現(xiàn)象[9]。研究發(fā)現(xiàn)，X染色體短臂遠(yuǎn)末端區(qū)域大多數(shù)X-連鎖基因在胚胎早期發(fā)育過程中表現(xiàn)出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄失活特征，而少數(shù)未被沉默的基因主要存在于與Y染色體同源性較高的區(qū)域部分，此外游離在沉默區(qū)域之外的非同源區(qū)域中少部分基因也會存在免于失活現(xiàn)象[29-30]。失活染色體上約15%的基因不發(fā)生失活，這部分逃逸基因在個體、組織、細(xì)胞中失活狀態(tài)各不相同[31]。逃逸基因啟動子區(qū)的甲基化水平明顯低于失活基因。在小鼠中通過敲除Dxz4和Firre基因可破壞失活染色體的空間結(jié)構(gòu)，逃逸基因序列也隨之發(fā)生改變[32]。

部分逃逸基因在組織間是相同的，而另一些則具有組織特異性。在成年老鼠組織中發(fā)現(xiàn)的失活逃逸基因與胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中檢測出的逃逸基因存在差異。胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中XCI為父源性印跡失活，由此提示印跡和隨機失活間存在明顯差異。失活X染色體上某些特定基因表達(dá)水平在組織間存在較大差異，進一步說明逃逸現(xiàn)象具有組織特異的劑量效應(yīng)[33]。因此，XCI逃逸基因在不同組織和性別間的差異可能是男女性別差異的基礎(chǔ)。目前，隨著研究越來越深入，發(fā)現(xiàn)的逃逸基因數(shù)量也在增加，然而逃逸基因如何免于失活，其作用機制目前仍不清楚。

4 生殖細(xì)胞與早期胚胎XCI的發(fā)生

XCI能夠穩(wěn)定傳遞且在早期雌性胚胎細(xì)胞中隨機失活，在這一過程中是如何發(fā)生呢？雄性哺乳動物生殖細(xì)胞形成過程中精原細(xì)胞減數(shù)第一次分裂時，同源染色體配對，父源X染色體上多數(shù)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄沉默(即印跡失活)，只有少數(shù)基因具備轉(zhuǎn)錄活性，因此精子中X染色體上大部分基因處于相對不活躍狀態(tài)。隨著受精的發(fā)生，父源X染色體活性會增強[31]。雌性哺乳動物中X染色體的變化表現(xiàn)為失活和復(fù)活的循環(huán)演變過程。雌性生殖細(xì)胞形成階段，減數(shù)分裂時期失活的染色體被重新活化，且在分裂過程中能夠穩(wěn)定遺傳和存在[34]。經(jīng)減數(shù)分裂成單倍體細(xì)胞的過程中，每個單倍體的雌性生殖細(xì)胞都包含著一條具有轉(zhuǎn)錄活性的X染色體。而在受精卵形成初期，母源X染色體在母源印跡的保護下免于失活，繼承了父本的X染色體會以基因印跡方式發(fā)生失活，而后在隨機XCI啟動前的囊胚期內(nèi)細(xì)胞團中再次出現(xiàn)選擇性地恢復(fù)活性，緊接著在胚胎內(nèi)細(xì)胞團中父本和母本的X染色體才開始發(fā)生失活[35-36]，且這一次的失活完全隨機。研究發(fā)現(xiàn)，在X染色體重新復(fù)活過程中靠近Xist的基因復(fù)活得最晚[37]，且X染色體活化的同時，其表達(dá)水平出現(xiàn)一定程度上調(diào)，同時促進常染色體表達(dá)比率上升[38]。當(dāng)失活染色體表現(xiàn)復(fù)活現(xiàn)象時，細(xì)胞內(nèi)Xist基因會保持沉默狀態(tài)，同時組蛋白抑制標(biāo)記物也會一起消失，直至復(fù)活完成和再次失活開始[39]。

5 不同哺乳動物中XCI的研究

5.1 小鼠XCI

對小鼠早期胚胎研究發(fā)現(xiàn)，XCI的模式在哺乳動物中似乎并不保守，胚胎細(xì)胞在2-～4-細(xì)胞期父源X染色體表現(xiàn)出印跡性失活特征；囊胚胚泡階段內(nèi)細(xì)胞團中失去轉(zhuǎn)錄活性的X染色體被重新激活，兩條X染色體都具備轉(zhuǎn)錄活性；直至囊胚后期著床過程中伴隨著內(nèi)細(xì)胞團的分化，上、下胚層細(xì)胞X染色體隨機失活機制被再次激活，而外胚層滋養(yǎng)細(xì)胞則一直保持父源X染色體失活[40-41]。對小鼠胚外絨毛組織研究發(fā)現(xiàn)，母源X染色體具備活性，而父源X染色體保持失活狀態(tài)，推測這種現(xiàn)象可能是為避免胚胎著床過程中受到母體免疫攻擊[42]，且該現(xiàn)象只在小鼠中發(fā)現(xiàn)。

Oh等[43]研究發(fā)現(xiàn)，分化過程中小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)JPX基因編碼的lncRNA對Xist的轉(zhuǎn)錄有激活促進作用，Xist P2啟動子上的絕緣子結(jié)合蛋白(CTCF)被游離出來以解除CTCF對Xist轉(zhuǎn)錄的抑制作用，從而促進Xist的表達(dá)使XCI正常進行，進一步敲除JPX基因發(fā)現(xiàn)，其對雌性的胚胎干細(xì)胞具有致死性。Nesterova等[44]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠17號和7號染色體基因簇的親本印跡分別需要Airn和Kcnq1ot1基因座，它們通過一種類似于Xist的機制在Polycomb復(fù)合體的長期募集中發(fā)揮作用。在hnRNPK誘導(dǎo)作用下，Airn和Kcnq1ot1基因座的lncRNA在滋養(yǎng)層干細(xì)胞中形成跨越數(shù)百萬個堿基的染色質(zhì)修飾的多復(fù)合順式結(jié)構(gòu)域，且修飾程度與lncRNA基因座鄰近的基因組結(jié)構(gòu)有關(guān)，也與lncRNA本身的豐度相關(guān)[45-46]。對著床前小鼠胚胎和胚胎干細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，SPEN不但對X染色體基因沉默發(fā)揮積極作用，而且參與維持神經(jīng)細(xì)胞中XCI，同時SPEN逃避對XCI基因的表達(dá)有明顯的抑制作用；SPEN在Xist上調(diào)后立即被募集到X染色體，并靶向遷移到活性基因的增強子和啟動子區(qū)；基因沉默后SPEN從染色質(zhì)上迅速脫離，表明SPEN在染色質(zhì)上的結(jié)合是需要主動轉(zhuǎn)錄的；此外研究人員認(rèn)為SPOC結(jié)構(gòu)域是SPEN基因沉默的主要效應(yīng)物，并證明SPOC與Xist RNA的結(jié)合足以介導(dǎo)基因沉默[29]。Patrat等[47]鑒定了SPOC的蛋白質(zhì)伴侶，包括NCoR/SMRT、m6ARNA甲基化酶、NuRD復(fù)合物、RNA聚合酶Ⅱ以及參與轉(zhuǎn)錄起始和延伸調(diào)控的其他因子，推測SPEN可能充當(dāng)XCI起始的分子整合劑，在活性增強子和啟動子區(qū)域使得Xist lncRNA與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、核小體重塑和組蛋白去乙?；高B接在一起，SPOC在該過程中與SPEN共同發(fā)揮生物學(xué)功能。

5.2 人XCI

近年來，關(guān)于人早期胚胎干細(xì)胞(hESCs)的形態(tài)特征、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組特征、XCI分子特性等方面研究發(fā)現(xiàn)，人和小鼠胚胎干細(xì)胞移植后外胚層有類似的多能性狀態(tài)，但人植入后胚胎外胚層細(xì)胞和植入前囊胚期胚胎干細(xì)胞與小鼠存在差異，表明XCI在哺乳動物中具有物種特異性。由于受XCI影響，在X連鎖基因甲基化CpG結(jié)合蛋白2(MeCp2)中，分別用綠色熒光蛋白GFP和紅色熒光蛋白tdTomato標(biāo)記X染色體(Xa-GFP和Xi-tdTomato)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人胚胎著床前囊胚內(nèi)細(xì)胞團中大多數(shù)細(xì)胞兩條X染色體保持活性且轉(zhuǎn)錄較活躍，大部分細(xì)胞中檢測到Xist雙等位基因表達(dá)[48]。著床前hESCs外胚層轉(zhuǎn)錄組中也檢測到高水平TFCP2L1和Xist雙等位基因表達(dá)。人早期胚胎中XCI分別開始于桑椹胚至囊胚階段，且不受印跡的影響，此外，在人胚胎ICM中檢測到Xist轉(zhuǎn)錄物在X染色體周圍出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，說明此時正在發(fā)生著XCI[49]，進一步證實XCI在哺乳動物中具有物種特異性。然而目前人類這方面的研究模型不夠完善，缺乏理想的系統(tǒng)來研究人早期胚胎發(fā)育過程中的X染色體調(diào)控機制，因此人XCI的機制尚不明確[50]。

5.3 牛、羊等其他物種XCI

XCI機制研究表明，組蛋白H3K27me3能夠促進Xist表達(dá)和XCI發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，在牛早期胚胎桑椹胚期前后均能檢測到Xist和組蛋白H3K27me3大量表達(dá)，在發(fā)育第7天的囊胚中也檢測到Xist lncRNA與組蛋白H3K27me3，第9天表達(dá)量仍沒有出現(xiàn)下調(diào)，另外在ICM和外胚層前體中也檢測到一定比例的細(xì)胞具有Xist lncRNA和組蛋白H3K27me3[51]。此外，JPX RNA通過游離CTCF來激活Xist,從而促進XCI發(fā)生，在牛早期胚胎發(fā)育過程中，當(dāng)JPX RNA水平受到干擾后Xist的表達(dá)會下調(diào)，進而使PGK1、DYNLT3和MSN的表達(dá)隨之上調(diào)[52]。研究發(fā)現(xiàn)，在牛早期胚胎發(fā)育不同階段(2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑椹胚和囊胚)JPX和Xist都有表達(dá)，2-細(xì)胞期表達(dá)水平很低還未能量化，且隨著胚胎發(fā)育相對表達(dá)量逐步升高，尤其在桑椹胚階段顯著上調(diào)；在不同性別牛胚泡中雌性Xist基因和X連鎖基因表達(dá)水平更高，推測X染色體似乎還未完全失活，表明XCI在牛上可能開始于4-細(xì)胞到桑椹胚期[53]。何杰[51]對牛胎兒心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織中JPX和Xist的相對表達(dá)量檢測發(fā)現(xiàn)，JPX和Xist在雌性胎兒組織中的相對表達(dá)量顯著高于雄性胎兒組織，說明此時不同性別和不同組織間XCI已經(jīng)完成并維持穩(wěn)定狀態(tài)[52]。研究提出，小鼠和牛早期胚胎胚外組織中可能發(fā)生印跡XCI，而人、馬、兔和豬等在發(fā)育過程中只發(fā)生隨機XCI；Xist基因可能在牛精子細(xì)胞中表達(dá)，但沒有發(fā)現(xiàn)甲基化[54]，具體仍有待進一步研究證實。

目前，在綿羊上也發(fā)現(xiàn)了XCI現(xiàn)象，隨著綿羊基因組測序的完成和RNA-Seq技術(shù)的進步，為探究綿羊的X染色體劑量補償和X連鎖基因表達(dá)提供了新的思路和方法[55]。此外，在小鼠性別鑒定中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄SRY基因的睪丸細(xì)胞及雄性胚胎從受精卵發(fā)育至囊胚的過程中幾乎不轉(zhuǎn)錄Xist基因；無SRY基因的雌性卵母細(xì)胞和雌性胚胎從合子開始到發(fā)育至2-細(xì)胞的過程中Xist基因不發(fā)生轉(zhuǎn)錄，然而從4-細(xì)胞期開始到囊胚期雌性細(xì)胞始終保持Xist基因轉(zhuǎn)錄活性[56-57]。吳霄[57]在探究Xist基因甲基化水平對豬體細(xì)胞核移植胚胎克隆效率時發(fā)現(xiàn)，Xist基因甲基化水平越低，克隆團囊胚率越高，呈高度負(fù)相關(guān)，小鼠中也有相似的情況發(fā)生。但羊XCI進程中是否也存在與豬、小鼠相似的情況，還需要進一步去探索。

6 小 結(jié)

XCI作為雌性哺乳動物一種獨特的發(fā)育調(diào)控機制和表觀遺傳調(diào)控模式，由Xist與Tsix主要調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)，通過DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳修飾調(diào)控整個生理過程，對哺乳動物正常生長發(fā)育進程意義重大。對人、小鼠、兔和牛等XCI研究表明，其調(diào)控機制和分子機理復(fù)雜，具有種間特異性，而且似乎沒有遵循統(tǒng)一的模式，同時諸多數(shù)據(jù)顯示，不同物種間X連鎖基因在XCI啟動后的下調(diào)保守性并不一致。值得注意的是，胚胎基因組在小鼠2-～4-細(xì)胞期、在人4-～8-細(xì)胞期、在兔和牛8-～16-細(xì)胞期被激活，由此推測哺乳動物XCI的啟動緊跟著胚胎基因組的激活。同時，XCI這一良好的表觀遺傳學(xué)研究模型對于臨床疾病治療具有一定的指導(dǎo)意義。在臨床研究中,XCI的程度與臨床疾病如X連鎖顯性遺傳Alport綜合征、性別特異性流產(chǎn)、Rett綜合征、Menkes病及染色體有關(guān)疾病等存在聯(lián)系[10]。目前Xist lncRNA被證實參與多種類型腫瘤發(fā)展，包括腦腫瘤、白血病、肺癌、乳腺癌和肝癌，在人類疾病特別是癌癥方面起著重要調(diào)節(jié)功能，并有望用作新的診斷和預(yù)測標(biāo)志物[58]。

Xist lncRNA是表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮功能的經(jīng)典范例，盡管其在很大程度上仍無法全面解釋XCI機制，但這方面的研究對基因沉默、異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核構(gòu)成、性別特異性差異產(chǎn)生的機理及遺傳上可能出現(xiàn)的假顯性等方面有更全面的了解。目前這些機制在小鼠和人上研究較多，但在家養(yǎng)哺乳動物上的研究相對滯后。建立XCI的理想體系模型和表型、分子量化分析能夠加快認(rèn)識哺乳動物種間特異性特征與XCI之間聯(lián)系。隨著單細(xì)胞RNA-Seq技術(shù)的分析效果越來越強，借助高通量技術(shù)了解X染色體基因調(diào)控和XCI調(diào)控機制將成為新的研究助力。