圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝生物標(biāo)志物受試者工作特征曲線分析

盧立葉,牛富貴，王中華，林雪彥，王 云，侯秋玲

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271000)

脂肪肝是圍產(chǎn)期奶牛高發(fā)的一種代謝紊亂疾病，尤其是高產(chǎn)奶牛。圍產(chǎn)期奶牛處于能量負(fù)平衡狀態(tài)導(dǎo)致體脂過量動(dòng)員，造成肝臟甘油三酯(TG)堆積從而形成脂肪肝[1]。奶?；贾靖问巩a(chǎn)奶量下降[2]，產(chǎn)犢間隔延長(zhǎng)[3]，降低全身免疫力并且伴隨其他疾病發(fā)生[4]，如乳房炎、酮病、子宮內(nèi)膜炎、胎衣不下、蹄病、皺胃變位等，對(duì)奶牛的生產(chǎn)繁殖能力、壽命以及經(jīng)濟(jì)效益會(huì)產(chǎn)生巨大影響。因此，準(zhǔn)確診斷脂肪肝既有利于奶牛健康又可以減少牧場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失。

奶牛產(chǎn)前21 d至產(chǎn)后21 d為圍產(chǎn)期，此時(shí)奶牛面臨胎兒分娩、子宮修復(fù)、激素紊亂、抵抗力下降以及泌乳等生理和代謝的巨大改變[5-6]，因此,機(jī)體對(duì)能量、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求增加了數(shù)倍[7]。在此期間，奶牛采食量降低，通過飼糧攝入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿足泌乳需求，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的能量負(fù)平衡。飼糧提供的生糖前體物質(zhì)不足使能量缺乏，最終導(dǎo)致血清葡萄糖(Glu)和胰島素(Ins)濃度降低，體脂發(fā)生動(dòng)員，體內(nèi)脂肪以非酯化脂肪酸(NEFA)的形式運(yùn)輸?shù)礁闻K，直至在肝臟氧化產(chǎn)生能量。然而，隨著脂肪的分解，血漿中NEFA濃度升高。與奶?；贾靖斡嘘P(guān)的因素眾多[8]，包括圍產(chǎn)期奶牛處于能量負(fù)平衡狀態(tài)、圍產(chǎn)期奶牛特殊的生理階段和代謝變化、肥胖程度、年齡、胎次、飼養(yǎng)管理和遺傳等方面的因素。

目前，脂肪肝的檢測(cè)方法有肝臟活檢[9]、血清生理生化[10]、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)[11]、數(shù)字化圖像技術(shù)[12]等。在臨床上，通過血清生理生化診斷奶牛脂肪肝是比較容易實(shí)現(xiàn)的方法，目前比較認(rèn)可的診斷方法為Reid提出的Y值法[13]，但是需要3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算，不能直接判斷，所以不適合規(guī)模化牧場(chǎng)。因此，本研究初步篩選與脂肪肝有關(guān)血清指標(biāo)作為生物標(biāo)志物，用受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)估生物標(biāo)志物及診斷敏感性、特異性、準(zhǔn)確性和最佳臨界值，以期為快速、準(zhǔn)確診斷脂肪肝提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 在山東泰安金蘭牧場(chǎng)、山東濟(jì)南高速牧場(chǎng)隨機(jī)選取77頭產(chǎn)后7 d中國(guó)荷斯坦奶牛，奶牛平均胎次為2.18胎，平均年齡為3.67歲。分娩后每天擠奶2次，早晚各飼喂1次全混合飼糧(TMR)，全天自由飲水。

1.1.2 樣品采集 晨飼前2 h尾根靜脈采集奶牛血液10 mL，放入促凝管內(nèi)室溫靜置30 min，3 500 r/min離心10 min，用移液槍吸出血清，分裝于1.5 mL離心管中，一式3份，-20 ℃保存。

1.1.3 主要試劑及儀器 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、Glu、TG、總膽固醇(TCHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自四川省邁克科技有限責(zé)任公司；NEFA ELISA試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司；Ins、胰高血糖素(Gln)、載脂蛋白B(ApoB)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)ELISA試劑盒均購(gòu)自南京奧青生物技術(shù)有限公司。全自動(dòng)生化分析儀(7020)購(gòu)自日立有限公司。

1.2 方法

1.2.1 奶牛分組 檢測(cè)采集的77頭奶牛血清中AST、Glu、NEFA的含量，根據(jù)公式Y(jié)=-0.51-0.003NEFA+2.84Glu-0.528AST 計(jì)算出Y值，將Y>1作為正常組奶牛，Y<1為脂肪肝組奶牛[13]。

1.2.2 血清生理生化指標(biāo)檢測(cè) 用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中ALT、AST、ALP、TP、ALB、Glu、TG、TCHO、HDL-C、LDL-C、NEFA、Ins、Gln、ApoB和TGF-β等的含量。

1.2.3 脂肪肝生物標(biāo)志物篩選 用Spearman法分析血清ALT、AST、ALP、TP、ALB、Glu、TG、TCHO、HDL-C、LDL-C、NEFA、Ins、Gln、ApoB、TGF-β、FGF-21與Y值的相關(guān)性，將相關(guān)性和組間差異顯著的血清指標(biāo)作為診斷脂肪肝的生物標(biāo)志物。

1.2.4 ROC曲線評(píng)估 將生物標(biāo)志物進(jìn)行ROC曲線評(píng)估，曲線下面積(AUC)值>0.5[14]的指標(biāo)具有診斷意義，經(jīng)ROC曲線分析后獲得生物標(biāo)志物診斷脂肪肝的敏感性與特異性，根據(jù)敏感性與特異性計(jì)算出約登指數(shù)(Youden)，不同的敏感性與特異性對(duì)應(yīng)不同的約登指數(shù)，其中最大約登指數(shù)對(duì)應(yīng)的即為生物標(biāo)志物的最佳臨界值、敏感性與特異性。

1.2.5 生物標(biāo)志物準(zhǔn)確性驗(yàn)證 用Reid方程計(jì)算的Y值診斷脂肪肝的準(zhǔn)確率為100%做標(biāo)準(zhǔn)，利用實(shí)驗(yàn)室前期檢測(cè)的461頭奶牛血清AST和NEFA數(shù)據(jù)，驗(yàn)證本試驗(yàn)結(jié)果得出的NEFA和AST最佳臨界值對(duì)脂肪肝診斷的準(zhǔn)確率，NEFA診斷準(zhǔn)確率(%)=NEFA臨界值檢出奶牛脂肪肝陽性數(shù)量/Y值檢出脂肪肝陽性數(shù)量×100%;AST診斷準(zhǔn)確率(%)=AST臨界值檢出的奶牛脂肪肝陽性數(shù)量/Y值檢出脂肪肝陽性數(shù)量×100%;NEFA+AST診斷準(zhǔn)確率(%)=NEFA、AST臨界值共同檢出的脂肪肝陽性數(shù)量/Y值檢出脂肪肝陽性數(shù)量×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用非參數(shù)檢驗(yàn)與獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，用Spearman法進(jìn)行相關(guān)性分析，用ROC曲線分析各檢測(cè)指標(biāo)的診斷統(tǒng)計(jì)意義，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。 通過比較指標(biāo)的ROC曲線下面積判斷指標(biāo)診斷的準(zhǔn)確性，根據(jù)Youden指數(shù)確定生物標(biāo)志物的最佳臨界值，并計(jì)算敏感性、特異性及準(zhǔn)確度。

2 結(jié) 果

2.1 奶牛生理生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

采集分娩后7 d的77頭奶牛的血清，檢測(cè)NEFA、Glu、AST含量，Reid方程診斷結(jié)果表明，脂肪肝奶牛有11頭，正常奶牛有66頭。奶牛的常規(guī)生理生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明，NEFA、Glu、AST、ALT含量在兩組間差異極顯著(P<0.01)，TP含量在兩組間差異顯著(P<0.05)；血清中部分激素及細(xì)胞因子與載脂蛋白檢測(cè)結(jié)果表明，兩組間沒有顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同組奶牛血清生理生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表

2.2 脂肪肝生物標(biāo)志物篩選

通過Spearman法相關(guān)性分析可見，血清NEFA、Glu、AST、TP、TG、Gln與Y值之間存在極顯著相關(guān)(P<0.01)，NEFA、AST、ALT、Gln與Y值之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.63、r=-0.37、r=-0.28、r=-0.30)；Glu、TP、TG、LDL-C、Ins與Y值之間呈正相關(guān)(r=0.69、r=0.50、r=0.35、r=0.29、r=0.25)，結(jié)合表1中血清組間差異結(jié)果將NEFA、Glu、AST、ALT、TP、TG、LDL-C、Ins、Gln定為脂肪肝生物標(biāo)志物(表2)。除血清NEFA、Glu、TP之外，其他指標(biāo)相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值都在0.50以下，相關(guān)性較低。

表2 血清指標(biāo)與Y值間的相關(guān)性分析

2.3 ROC曲線評(píng)估生物標(biāo)志物診斷性能

將生物標(biāo)志物進(jìn)行ROC曲線評(píng)估，以AUC值>0.50作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，由表3可知，NEFA、AST、ALT和Gln的AUC值分別為0.91、0.75、0.75和0.56，可以用來準(zhǔn)確診斷脂肪肝，診斷敏感性分別為81.8%、72.7%、63.6%和54.5%，診斷特異性分別為92.8%、89.4%、84.8%和69.7%，診斷最佳臨界值分別為471.74 μmol/L、95.50 U/L、46.50 U/L和64.60 ng/mL。其他相關(guān)因子AUC值均在0.50以下，不能準(zhǔn)確診斷脂肪肝。NEFA的AUC值最高，說明診斷的準(zhǔn)確性也最高，敏感性與特異性也高于AST、ALT和Gln。

表3 血清生物標(biāo)志物ROC曲線診斷效能

2.4 NEFA和AST診斷性能驗(yàn)證

461頭奶牛血清NEFA和AST的檢測(cè)結(jié)果表明，NEFA、AST和NEFA+AST的診斷準(zhǔn)確率分別為89.96%、73.49%和69.08%(表4)。Y值診斷發(fā)病率為54.01%，NEFA、AST和NEFA+AST診斷發(fā)病率分別為48.59%、39.70%和37.31%。

表4 NEFA和AST最佳臨界值對(duì)脂肪肝的診斷準(zhǔn)確率

3 討 論

Bobe等[15]研究表明,奶牛產(chǎn)犢天數(shù)與脂肪肝的發(fā)生密切相關(guān)，一般產(chǎn)后3～5 d開始發(fā)病，第2周發(fā)病較為嚴(yán)重，產(chǎn)后30 d內(nèi)脂肪肝發(fā)病率達(dá)到35%～50%;也有研究表明,產(chǎn)后10 d奶牛脂肪肝發(fā)病率達(dá)到65%[16];Shen等[17]研究表明產(chǎn)后9 d奶牛脂肪肝發(fā)病率高達(dá)60.64%。本研究檢測(cè)461頭奶牛血清發(fā)現(xiàn),產(chǎn)后7 d奶牛脂肪肝發(fā)病率高達(dá)54.01%，與以上研究結(jié)果相符。試驗(yàn)所選牧場(chǎng)對(duì)產(chǎn)后7 d奶牛進(jìn)行集中管理，為了方便采樣所以選擇產(chǎn)后7 d為采血時(shí)間。

本研究將Reid基于血清學(xué)提出的回歸公式作為診斷脂肪肝的方法，相較于其他方法，只需采集血清檢測(cè)所需指標(biāo)，用公式計(jì)算即可判斷奶牛是否患脂肪肝。肝臟活檢是診斷脂肪肝的金標(biāo)準(zhǔn)，Reid公式診斷脂肪肝的準(zhǔn)確率僅次于肝臟活檢，具有較高的診斷準(zhǔn)確率，同時(shí)能夠避免對(duì)奶牛造成損傷，目前為多數(shù)研究人員所使用[18]。肝臟活檢會(huì)造成奶牛損傷，而Reid方程診斷脂肪肝需要多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行公式計(jì)算，在臨床使用受到限制。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，ROC曲線普遍用于疾病準(zhǔn)確性診斷[19-20]，尤其是生物標(biāo)志物診斷，所以本試驗(yàn)用ROC曲線評(píng)估生物標(biāo)志物最佳臨界值來直接診斷脂肪肝。

通過生理生化指標(biāo)間差異與相關(guān)性分析可篩選出作為生物標(biāo)志物的生理生化指標(biāo)。從生理生化結(jié)果來看，脂肪肝奶牛產(chǎn)后干物質(zhì)攝入量急劇下降，使奶牛處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，導(dǎo)致NEFA濃度升高、Glu濃度降低。Glu是機(jī)體主要能量來源，奶牛開始泌乳后乳糖合成增多，乳腺對(duì)Glu的需求增加，為滿足營(yíng)養(yǎng)需求，Glu被合理分配于各組織器官，導(dǎo)致脂肪肝奶牛血液Glu降低。 Du等[10]對(duì)產(chǎn)后3～9 d的15頭健康奶牛和輕度脂肪肝奶牛進(jìn)行肝臟脂質(zhì)代謝與線粒體適應(yīng)研究表明，脂肪肝奶牛Glu低于正常奶牛，輕度脂肪肝奶牛的Glu為3.07 mmol/L,正常奶牛為3.75 mmol/L。 本研究中正常奶牛Glu含量為3.30 mmol/L，脂肪肝奶牛為2.67 mmol/L，脂肪肝奶牛Glu低于正常奶牛，與以上研究結(jié)果相符。AST、ALT主要通過肝臟產(chǎn)生，奶牛發(fā)生脂肪肝后，肝臟脂肪過度沉積、肝臟嚴(yán)重壞死或被破壞時(shí)造成AST、ALT升高。本研究中脂肪肝組TP低于正常組，說明脂肪肝奶牛體內(nèi)能量低于正常奶牛，也進(jìn)一步說明脂肪肝奶牛肝臟分泌TP的能力降低。

從相關(guān)性分析來看，血清NEFA、Glu、AST、ALT、TP、TG、LDL-C、Ins、Gln與Y值具有相關(guān)性，這些指標(biāo)待進(jìn)一步進(jìn)行ROC分析。除NEFA、Glu、TP之外，其他生理生化指標(biāo)與脂肪肝相關(guān)性普遍較低，可能是脂肪肝奶?；疾≥^輕，屬于輕度脂肪肝，與正常奶牛之間的數(shù)值差距較小。

本研究經(jīng)過ROC分析確定NEFA、AST、ALT和Gln可作為脂肪肝診斷的生物標(biāo)志物。Jorritsma等[21]研究表明，產(chǎn)后6～17 d脂肪肝奶牛的NEFA濃度顯著升高，可作為奶牛肝脂血癥的指標(biāo)；Samanc等[22]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后2 d奶牛會(huì)發(fā)生脂肪肝，認(rèn)為產(chǎn)犢前后肝臟NEFA的酯化與TG的聚集隨著脂質(zhì)動(dòng)員增加[8]；當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重壞死或脂肪過度沉積時(shí)AST、ALT濃度升高[6,23]，表明AST、ALT可作為診斷奶牛脂肪肝的生物標(biāo)志物；Sakowski等[24]研究表明，ALT的增加可能與產(chǎn)后奶牛能量負(fù)平衡引起的肝臟損傷有關(guān)。與ALT類似，AST濃度的增加表明圍產(chǎn)期奶牛代謝變化增強(qiáng)。Gln對(duì)脂肪肝診斷的準(zhǔn)確性低于NEFA、AST和ALT，可能是由于激素變化反映圍產(chǎn)期奶牛全身代謝狀態(tài)，不只代表肝臟，但不排除Gln可作為診斷脂肪肝的生物標(biāo)志物?？傊琋EFA升高、Glu降低時(shí)奶牛處于能量負(fù)平衡狀態(tài),AST、ALT升高是肝細(xì)胞以及線粒體發(fā)生破壞導(dǎo)致的，圍產(chǎn)期脂肪肝奶牛NEFA、AST、ALT和Gln發(fā)生顯著變化，說明其可以作為診斷圍產(chǎn)期脂肪肝的生物標(biāo)志物。

在驗(yàn)證部分，用NEFA、AST和NEFA+AST診斷脂肪肝的發(fā)病率均低于Y值診斷的結(jié)果，可能與Y值的診斷結(jié)果由3個(gè)生理生化指標(biāo)共同得出有關(guān)，也有可能是本試驗(yàn)采樣時(shí)間選自產(chǎn)后1周，奶牛未發(fā)展至重度脂肪肝，所以未在試驗(yàn)中做脂肪肝分級(jí)有關(guān)。單獨(dú)用NEFA和AST最佳臨界值診斷時(shí)陽性檢出率高，而NEFA+AST的診斷準(zhǔn)確率低于單獨(dú)使用，但也具有較高的診斷準(zhǔn)確率，可見通過最佳臨界值可以更直接、快速、簡(jiǎn)便地用于規(guī)?；翀?chǎng)診斷脂肪肝。

4 結(jié) 論

經(jīng)過ROC曲線評(píng)估后表明NEFA、AST、ALT、Gln能作為診斷圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝的生物標(biāo)志物。NEFA、AST、ALT、Gln作為生物標(biāo)志物診斷脂肪肝具有明確的臨床最佳臨界值和較高的診斷敏感性與特異性，最佳臨界值分別為471.74 μmol/L、95.50 U/L、46.50 U/L和64.60 ng/mL。