ERCC在骨肉瘤發(fā)病機(jī)制作用與順鉑耐藥性△

韓超哲，趙 瑩，段 劭，李 超*

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科，黑龍江哈爾濱 150081；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150081）

骨肉瘤是一種青少年常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，是癌癥相關(guān)死亡的重要原因［1］。其第一次發(fā)病高峰主要出現(xiàn)在快速生長的青春期，第二次發(fā)病高峰主要出現(xiàn)在70～85歲［2］。雖然骨肉瘤的發(fā)病率較低，僅為1.7～4.4人/百萬，但因具有強(qiáng)大的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，易導(dǎo)致殘疾與死亡，給患者造成了巨大的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［3］。通常采用手術(shù)聯(lián)合化療的方式治療骨肉瘤，盡管在化療和手術(shù)治療方面取得了巨大的進(jìn)展，但報(bào)告顯示骨肉瘤的預(yù)后通常較差，尤其是對于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者，5年生存率低于30%［1，4］。生存率低下與預(yù)后不良主要原因是對順鉑耐藥，而機(jī)體對順鉑的耐藥性主要取決于DNA修復(fù)能力，其中核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair,NER）是修復(fù)DNA損傷的主要機(jī)制之一，受損的堿基通過這種機(jī)制被從基因組中移除，其中NER途徑的關(guān)鍵組成部分，即切除修復(fù)交叉互補(bǔ)（excision repair cross complementing,ERCC）基因，被認(rèn)為是DNA修復(fù)能力的關(guān)鍵因素［5］。遺傳因素可以解釋DNA修復(fù)能力的差異，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）作為最普遍的遺傳變異形式之一，在預(yù)測個(gè)體患癌風(fēng)險(xiǎn)中起關(guān)鍵作用，并廣泛用于研究腫瘤的發(fā)生率和預(yù)后評估［6］。ERCC基因家族對遺傳穩(wěn)定性至關(guān)重要，并且SNPs已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與骨肉瘤的發(fā)病與預(yù)后評估相關(guān)［7］。本文將對ERCC基因?qū)е鹿侨饬龅陌l(fā)病與耐藥等方面進(jìn)行綜述。

1 ERCC基因與DNA修復(fù)

機(jī)體的DNA修復(fù)系統(tǒng)在保護(hù)遺傳穩(wěn)定性中扮演重要角色，DNA修復(fù)通路被精細(xì)調(diào)節(jié)以保持基因組完整性以應(yīng)對DNA損傷，與癌癥風(fēng)險(xiǎn)和易感性有關(guān)［7］。同時(shí)，DNA修復(fù)機(jī)制可以使腫瘤細(xì)胞在化療誘導(dǎo)的DNA損傷中存活，從而發(fā)生癌癥化療的耐藥性。在這些DNA修復(fù)通路中，NER可以在DNA的活性轉(zhuǎn)錄區(qū)通過亞通路轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)NER或在非轉(zhuǎn)錄區(qū)通過亞通路全基因組NER來識別DNA損傷并清除受損的核苷酸［4，8］。它是一種由ERCC基因參與的復(fù)雜的多步驟的DNA修復(fù)過程，NER的基本步驟包括：損傷識別、展開折疊和動態(tài)校對（ERCC2和ERCC3）、切開DNA鏈與清除雙切口間的寡核苷酸序列（ERCC1、ERCC4和ERCC5）、通過DNA聚合酶修復(fù)合成和連接［9］。

其中ERCC1基因位于人類染色體19q13.2上，由10個(gè)外顯子組成，跨度約為17.3 kb，被認(rèn)為是NER系統(tǒng)的先導(dǎo)基因，負(fù)責(zé)對損傷進(jìn)行識別和剪切，ERCC2基因位于人類染色體19q13.3上，由23個(gè)外顯子組成，跨度約為 54 kb［7，10］。ERCC2 作為人類轉(zhuǎn)錄起始因子的亞基，可以編碼DNA解旋酶，解開損傷部位附近的DNA雙鏈，ERCC1和ERCC2是NER過程中兩個(gè)關(guān)鍵的限速酶［11］。ERCC3基因位于人類染色體2q21上，跨度約為45 kb，由14個(gè)外顯子組成，ERCC2和ERCC3基因編碼蛋白通過作為ATP依賴的DNA解旋酶來參與NER途徑，負(fù)責(zé)打開損傷部位周圍的DNA鏈，從而清除部分DNA交聯(lián)［12］。ERCC4基因位于人類染色體16p13.12上，跨度約28.2 kb，由11個(gè)外顯子組成，ERCC4也可稱之為著色性干皮病互補(bǔ)組F（xe?roderma pigmentosum complementation group F,XPF）［4］。ERCC1基因的表達(dá)產(chǎn)物與 XPF蛋白共同創(chuàng)建了二聚體核酸內(nèi)切酶蛋白（ERCC1-XPF），在ERCC1-XPF中ERCC-1可以與DNA結(jié)合并穩(wěn)定XPF，而XPF則具有核酸內(nèi)切酶催化能力，該二聚體與DNA損傷識別相關(guān)，并且是NER途徑必不可少的5′-3′結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶，其在NER途徑中起到限速或調(diào)節(jié)作用［13］。ERCC5基因位于人類染色體13q33上，由15個(gè)外顯子組成，跨度約為32 kb。它編碼一種在NER途徑中具有多種功能的結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶，可以識別并剪切DNA鏈3′末端的損傷［6］。

基因組DNA在轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域內(nèi)常會發(fā)生DNA損傷，因而準(zhǔn)確的修復(fù)是維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和DNA正常轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)［14］。綜上所述，ERCC基因是NER途徑的關(guān)鍵組成部分，其編碼了參與復(fù)雜DNA修復(fù)機(jī)制的蛋白質(zhì)，能有效去除大面積病變，減少環(huán)境化學(xué)物質(zhì)對DNA的損傷，所以被認(rèn)為是影響DNA修復(fù)能力的關(guān)鍵因素。ERCC基因?qū)NA損傷的清除和染色體穩(wěn)定性的維持有重要作用。

2 ERCC基因與骨肉瘤的發(fā)生

2.1 ERCC基因與骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制

NER通路的基因變異是骨肉瘤的危險(xiǎn)因素，研究表明，在NER和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄過程中ERCC1與ER?CC2低表達(dá)可減弱DNA的修復(fù)能力，從而使骨肉瘤發(fā)病概率增加［11，15］。研究人員發(fā)現(xiàn)，除ERCC1與ERCC2之外，還有很多的ERCC等位基因也與骨肉瘤相關(guān)，如ERCC5中的第1 104位密碼子組氨酸被天冬氨酸替代可能導(dǎo)致異常細(xì)胞的增殖與分化，其突變的殘基會降低NER活性，破壞ERCC5的穩(wěn)定并降低其細(xì)胞蛋白質(zhì)水平，增加其癌癥易感性［6，16］。針對ERCC基因的研究或許能為骨肉瘤發(fā)病機(jī)制的研究帶來新的方向。

2.2 ERCC的SNPs對骨肉瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響

SNPs是在外顯子或內(nèi)含子區(qū)域遺傳的單堿基變化，可能會改變基因表達(dá)和損害蛋白質(zhì)功能，使個(gè)體易患惡性腫瘤［17，18］。如研究發(fā)現(xiàn)ERCC1 rs11615多態(tài)性位于118密碼子上，其CT與TT基因型與CC基因型相比擁有更低的ERCC1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，使其DNA修復(fù)能力更弱，導(dǎo)致個(gè)體患骨肉瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加［10，15］。ERCC2 rs1799793 位于 312密碼子上，是一種非同義變異，能夠改變編碼氨基酸（Lys751Gln），并且Jin等通過條件邏輯回歸分析研究148例骨肉瘤患者與296例對照組發(fā)現(xiàn)，攜帶ERCC2 rs1799793 GA+AA基因型的個(gè)體與骨肉瘤風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)，其比值比（Odd Ratio,OR）95%置信區(qū)間（confidence interval,CI）為 1.58（1.03～2.41）［7，11］。Zhao 等［16］通過研究以往 60 項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)ERCC5基因rs17655 G>C多態(tài)性與癌癥易感性增加相關(guān)，其（CC與 GG：OR（95%CI）=1.10（1.00～1.20）； CG 對 GG：OR （95%CI） =1.06（1.02～1.11）；CG+CC 對 GG：OR（95%CI）=1.07（1.02～1.12）；C 與 G：OR（95%CI）=1.05，（1.01～1.09）。綜上所述，ERCC基因的SNPs對于骨肉瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的評估和預(yù)測具有一定參考性，未來有可能作為骨肉瘤的篩查或預(yù)測分子。

3 ERCC基因與骨肉瘤的治療

3.1 ERCC基因及其SNPs與骨肉瘤患者順鉑耐藥和預(yù)后的關(guān)系

幾十年來骨肉瘤的治療方式?jīng)]有改變，依然是手術(shù)切除病灶與結(jié)合全身化療來控制微轉(zhuǎn)移疾?。?9］。盡管采用了這種積極的治療方法，但由于患者對化療藥物產(chǎn)生耐藥，仍有35%～45%的患者復(fù)發(fā)且預(yù)后不良［20］。順鉑是治療骨肉瘤的主要化療藥物之一，它可通過與DNA結(jié)合包括鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)的方式，形成順鉑-DNA附加物，并抑制DNA復(fù)制來發(fā)揮功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［15］。高效的DNA修復(fù)能力是產(chǎn)生順鉑耐藥的重要機(jī)制，NER途徑對順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷具有修復(fù)作用，通過識別和去除順鉑-DNA附加物來達(dá)到修復(fù)的目的［21］。

NER途徑中的ERCC基因遺傳變異可以改變編碼蛋白的數(shù)量或活性，因此可決定個(gè)體對順鉑的反應(yīng)或耐藥性［22］，Hattinger等［23］對 99 例順鉑治療的骨肉瘤患者的活檢進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究，通過對整個(gè)患者系列進(jìn)行的多變量分析發(fā)現(xiàn)，在無事件生存率和總生存率中，ERCC1高表達(dá)與更高的預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。此外，已發(fā)現(xiàn)ERCC基因的SNPs可以改變基因表達(dá)和功能，或與骨肉瘤耐藥和預(yù)后相關(guān)［17］。在不同的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，ERCC1和ERCC2基因中的SNPs與順鉑反應(yīng)相關(guān)，并可影響骨肉瘤患者的預(yù)后［4］，如ERCC1 rs3212986多態(tài)性位于該基因的3′UTR中，該多態(tài)性對ERCC1 mRNA起穩(wěn)定性作用，因此ERCC1 rs321298的多態(tài)性會導(dǎo)致DNA修復(fù)能力受限，從而影響治療反應(yīng)和總體生存率［10］。Hadeel與Liu等研究發(fā)現(xiàn)，ERCC1（C118T-rs11615） 和 C8092A- rs3212986） 和 ERCC2（A751C-rs171140）和（G312A-rs1799793）能影響順鉑的修復(fù)能力，并影響骨肉瘤患者的生存率與預(yù)后［24］。Cao等［15］通過條件邏輯回歸分析研究確診的186例骨肉瘤患者發(fā)現(xiàn)，與攜帶野生型基因型的患者相 比 ，ERCC1 （C118T （rs11615） 和 C8092A（rs3212986）的CC基因型與良好化療效果和高生存率相關(guān)，其OR（95%CI）分別為 2.56（1.02～7.35）和 3.01（1.07～9.71）。Wang等［25］招募 146 例亞洲骨肉瘤患者通過進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析，研究其多變量比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，發(fā)現(xiàn)ERCC1 rs11615 TT基因型攜帶者比寬型CC基因型攜帶者生存率更高并且預(yù)后更好，其調(diào)整后的OR（95%CI） 為 0.24 （0.08～0.96）， 并 且 ERCC2 rs1799793的AA基因型攜帶者則有著更低的骨肉瘤死亡風(fēng)險(xiǎn)（風(fēng)險(xiǎn)率（hazard ratio,HR）=0.22，95%CI=0.12～0.93。

Li等［4］通過對亞洲人與白種人2 303名符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者中13項(xiàng)合格的隨訪研究中發(fā)現(xiàn)，ER?CC2 rs1799793和ERCC5 rs2296147的純合變異基因型與骨肉瘤顯著相關(guān)（rs1799793的TT vs GG：HR=0.62， 95%CI=0.41～0.93； rs2296147 的 TT vs CC：HR=0.42，95%CI=0.23～0.78）， 但 其認(rèn) 為 ERCC1 rs11615基因多態(tài)性與骨肉瘤預(yù)后無關(guān)，與Wang等實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符，這種矛盾可能是Li等分析患者過少，人種不同所導(dǎo)致的。上述研究發(fā)現(xiàn)ERCC1 rs321298； rs11615； rs11615、 ERCC2 rs 1799793；rs171140和ERCC5 rs2296147可作為骨肉瘤的遺傳預(yù)后標(biāo)記物，也可作為不同患者個(gè)體化治療和術(shù)后治療的生物標(biāo)記物。ERCC基因作為骨肉瘤的預(yù)測標(biāo)記物可以為骨肉瘤治療方案的改進(jìn)提供新的方向。

3.2 ERCC基因靶向抑制——減少順鉑耐藥性新思路

Fanelli等［26］通過對順鉑敏感或耐藥的人骨肉瘤細(xì)胞系進(jìn)行基因沉默和體外逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥等方法，證明雷公藤甲素和NSC 130813（NERI02；F06）這兩種靶向ERCC基因的藥物是減少順鉑耐藥性方面最有效的藥物，并且沒有與順鉑交叉耐藥的證據(jù)，通過體外聯(lián)合治療表明，當(dāng)與順鉑一起給藥時(shí)，雷公藤甲素和NSC130813都能夠提高順鉑對耐藥骨肉瘤細(xì)胞的療效。

在人骨肉瘤細(xì)胞系中，雷公藤甲素被證明可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并可以通過劑量依賴性方式抑制血管生成［27］。Titov 等［28］通過實(shí)驗(yàn)研究替換內(nèi)源性野生型ERCC3中的雷公藤甲素12，13-環(huán)氧基共價(jià)修飾的殘留物Cys342，使其對雷公藤甲素完全耐藥，從而證實(shí)ERCC3基因是雷公藤甲素的相關(guān)靶點(diǎn)，雷公藤甲素可與人類ERCC3形成共價(jià)復(fù)合物，通過抑制其DNA依賴性ATP酶活性來抑制其DNA修復(fù)活性。NSC130813則可以通過靶向阻斷ERCC1和ERCC4/XPF之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來干擾DNA修復(fù)，并可以與順鉑協(xié)同促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡［26，29］。

這種靶向抑制ERCC基因以阻斷DNA的修復(fù)能力對順鉑的抗癌活性具有重要意義，是提高現(xiàn)有DNA損傷藥物療效的一種有前途的治療策略。通過使用這些靶向抑制劑藥物可以為骨肉瘤定制治療和改善患者預(yù)后提供創(chuàng)新方案。

ERCC基因是NER途徑的關(guān)鍵基因，是影響DNA修復(fù)能力的關(guān)鍵因素，ERCC基因及其SNPs與骨肉瘤的發(fā)生、易感性、順鉑耐藥和預(yù)后均有關(guān)，是預(yù)測治療反應(yīng)的分子標(biāo)志，也是其新的治療靶向基因。盡管ERCC基因的活性是維持正常細(xì)胞基因組完整性所必需的，但ERCC對以順鉑為基礎(chǔ)的化療等DNA損傷療法具有消極作用。因此抑制ERCC的表達(dá)可能是強(qiáng)化此類治療效果的方法，是具備應(yīng)用前景的聯(lián)合策略。骨肉瘤患者預(yù)后與生存率的現(xiàn)狀激發(fā)了人們對新治療方案的追求，患者對順鉑的耐藥性是骨肉瘤治療中遇到的巨大障礙，迫切需要開發(fā)新靶點(diǎn)來改善預(yù)后。針對ERCC-XPF內(nèi)切酶活性與ERCC3基因的抑制可能成為減少骨肉瘤對順鉑耐藥性新的靶向治療方向。聚焦ERCC基因的SNPs也可以幫助臨床醫(yī)師評估骨肉瘤患者的預(yù)后，定制個(gè)性化治療方案。