鐵死亡在腦缺血-再灌注損傷過程中的研究進展

謝吐秀，呂菁君，張新奇，許 欣，嚴貴敏，王 靜

心搏驟停、缺血性腦卒中和休克后的腦缺血可導致神經(jīng)元死亡和組織損傷，已成為全球致死和致殘的主要原因。目前治療腦缺血的關鍵手段是盡快恢復缺血區(qū)的血供，防止神經(jīng)元、膠質細胞和血管內皮細胞的死亡[1]，然而早期腦組織再灌注會釋放大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)和炎性因子，導致腦水腫和神經(jīng)功能缺陷等[2]。腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)損傷的機制主要包括線粒體功能障礙、鈣超載、興奮性氨基酸的毒性作用、鐵死亡等[3-4]。鐵死亡(Ferroptosis)于2012年由Dixon等[5]首次提出，是由鐵依賴的多不飽和脂肪酸的消耗、膜脂過氧化物的累積及隨后的膜損傷引起。近年來的研究表明，鐵死亡參與腦I/R損傷的發(fā)生發(fā)展，抑制鐵死亡具有神經(jīng)保護和抗氧化等特性，已成為防治相關疾病的研究熱點。本文主要從鐵死亡概述、鐵死亡與腦I/R損傷和鐵死亡調控腦I/R損傷的機制進展三方面進行綜述，以期為治療腦I/R損傷相關疾病提供參考。

1 鐵死亡概述

鐵死亡作為一種新的細胞死亡方式，由谷胱甘肽(glutathione， GSH)耗竭或谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase 4， GPX4)活性降低、異常的鐵代謝(如鐵超載)誘導的脂質過氧化以及含多不飽和脂肪酸的磷脂(polyunsaturated fatty acid-containing phospholipids， PUFA-PLs)的累積所致，可被鐵螯合劑、親脂抗氧化劑和一些特定抑制劑逆轉[5]。其通常表現(xiàn)為壞死樣的形態(tài)變化[6]，包括胞膜完整性喪失、細胞質腫脹、中度染色質凝聚、線粒體凝結或腫脹，膜密度增加，線粒體嵴減少或消失[5]。既往的研究表明，鐵死亡在形態(tài)學、生化和遺傳特征方面具有其獨特性，不同于其他受調控的細胞死亡方式，如細胞凋亡、壞死性凋亡、細胞焦亡和自噬。然而，近年來的研究表明，鐵死亡與壞死性凋亡均涉及膜脂成分調控，兩者間可能存在串擾。這可能由于混合系激酶區(qū)域樣蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein， MLKL)可通過消耗多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid， PUFA)來發(fā)揮抗鐵死亡作用，而?；o酶A合成酶長鏈家族成員 4 (acyl-CoA synthetase long-chain family member 4， ACSL4)則通過抵抗MLKL驅動的增強膜通透性來發(fā)揮抗壞死性凋亡作用[7]。此外，脂質過氧化可誘導微管相關蛋白1輕鏈3轉位和自噬體形成，而過度的自噬和溶酶體活動可通過鐵累積或脂質過氧化促進鐵死亡[8]?？梢姡F死亡與自噬間亦可能存在串擾。

鐵是細胞增殖和生長所需的關鍵元素之一，但是鐵超載會導致線粒體氧化磷酸化途徑異常激活，且在合成ATP時會產(chǎn)生大量ROS[9]。當ROS水平超過抗氧化系統(tǒng)胱氨酸-谷氨酸逆向轉運蛋白System Xc-的抵御能力時，可驅動細胞膜上的PUFA發(fā)生過氧化，產(chǎn)生致命性脂質ROS累積，直接或間接破壞細胞的結構和功能?？梢?，鐵死亡是一種受GPX4嚴格調控的、呈壞死樣的細胞死亡方式，與GSH代謝、鐵代謝和脂質過氧化密切相關。

2 鐵死亡與腦I/R損傷

鐵死亡作為一種鐵依賴性的、非凋亡的調節(jié)性細胞死亡形式，在腫瘤、退行性病變、I/R損傷性疾病[10]等發(fā)生發(fā)展過程中起著至關重要的作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在腦I/R損傷過程中，腦組織中可檢測到過量游離鐵累積[11]。鐵超載一方面通過產(chǎn)生ROS來引發(fā)氧化損傷和隨后的細胞死亡；另一方面，通過催化羥自由基的形成來觸發(fā)脂質過氧化和隨后的鐵死亡[11]。Guo等[12]的研究亦發(fā)現(xiàn)，腦I/R損傷大鼠會出現(xiàn)嚴重的腦損傷和神經(jīng)功能缺陷，伴有鐵死亡的典型分子特征，包括GSH紊亂、鐵異常累積和脂質過氧化物增加。

2.1GSH的耗竭 System Xc-作為細胞中重要的抗氧化系統(tǒng)組分，廣泛分布于磷脂雙分子層中，是由兩個亞基 SLC7A11和 SLC3A2組成的異源二聚體，可調控GSH的合成。抑制System Xc-活性可通過抑制胱氨酸的吸收來影響GSH的合成，導致GPX活性降低，細胞抗氧化能力下降，脂質ROS累積，繼而發(fā)生氧化損傷和鐵死亡。在GPX家族中，GPX4在鐵死亡的發(fā)生中起著舉足輕重的作用。Yuan等[13]的小鼠腦I/R模型發(fā)現(xiàn)，GPX4蛋白表達顯著下調，細胞還原型輔酶Ⅱ(NADPH)/氧化型輔酶Ⅱ(NADP+)和GSH/氧化型谷胱甘肽(GSSG)比率均顯著降低，腦組織中游離鐵和ROS累積，線粒體嵴減少和線粒體膜密度增加，細胞活力降低，細胞死亡增多。香芹酚可通過增加GPX4的表達來抑制鐵死亡，繼而保護沙鼠神經(jīng)元免受I/R損傷[14]。高良姜素作為一種黃酮類化合物，可通過上調SLC7A11來間接增加GPX4的表達，從而抑制鐵死亡并減輕沙鼠腦I/R損傷[15]。此外，在小鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion， MCAO)模型中，F(xiàn)errostatin-1(Fer-1)可通過阻斷胱氨酸轉運和抑制GSH的消耗來發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16]。可見，在腦I/R損傷過程中，增加細胞內GSH水平和上調GPX4的表達均可有效逆轉鐵死亡，有望為治療腦I/R損傷相關疾病提供新思路。

2.2鐵代謝異常 鐵廣泛存在于腦組織中，參與氧運輸、DNA生物合成和ATP生成，對維持神經(jīng)元正常功能和活動至關重要。然而，鐵因具有氧化還原活性，可產(chǎn)生ROS，觸發(fā)氧化應激反應，并啟動對細胞存活和細胞死亡至關重要的信號通路。關鍵鐵代謝基因包括鐵蛋白、轉鐵蛋白(transferrin， TF)、轉鐵蛋白受體 1 (transferrin receptor 1， TfR1，TFRC)、二價金屬轉運蛋白 1(divalent metal transporter 1， DMT1， SLC11A2)、膜鐵轉運蛋白(ferroportin， Fpn、SLC40A1)和鐵調素 (hepcidin， HAMP)，其穩(wěn)態(tài)是一個復雜的、受高度調控的過程[17]。鐵蛋白作為一種蛋白質復合物，由鐵蛋白輕鏈 (ferritin light chain， FTL)和鐵蛋白重鏈1 (ferritin heavy chain 1， FTH1)組成，可將細胞內的鐵以無活性的形式濃縮備用。有研究表明，腦缺血患者腦內鐵離子水平顯著升高，且如果腦缺血24小時后的患者血清鐵蛋白水平升高，則提示預后欠佳[18]。這可能是由于I/R損傷可以直接誘導小膠質細胞活化，釋放大量炎性因子，引起神經(jīng)炎癥，而炎性因子的上調反過來又通過HAMP影響腦鐵穩(wěn)態(tài)，導致大腦中游離鐵的進一步累積，對神經(jīng)元產(chǎn)生氧化損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腦I/R損傷過程中，線粒體鐵蛋白水平呈顯著上調，敲低線粒體鐵蛋白可通過促進鐵離子濃度升高來加重鐵死亡，表現(xiàn)為更嚴重的腦損傷和神經(jīng)功能缺陷；而過表達線粒體鐵蛋白可逆轉此變化[11]。多項研究表明，鐵螯合劑作用于缺血性腦卒中動物模型，可顯著減輕其腦損傷，且在腦卒中患者中亦可發(fā)揮抗氧化和神經(jīng)保護作用[19]?？梢?，線粒體鐵蛋白和鐵螯合劑可通過抑制鐵累積來有效抑制腦I/R誘導的鐵死亡和隨后的腦損傷，為腦I/R損傷相關疾病提供了潛在靶點。

2.3異常脂質過氧化 鐵死亡發(fā)生的重要因素之一是脂質過氧化物的累積，此過程需要幾種關鍵酶的激活，如ACSL4、溶血磷脂酰膽堿酰基轉移酶 3 (lysophosphatidylcholine acyltransferase 3， LPCAT3) 和花生四烯酸15-脂氧合酶 (arachidonate 15-lipoxygenase， ALOX15)[20]。具體而言，ACSL4可催化PUFA(尤其是花生四烯酸)產(chǎn)生CoA，LPCAT3可調節(jié)AA-CoA酯化成含氧化花生四烯酸的磷脂酰乙醇胺(oxidized arachidonic acid-containing phosphatidylethanolamine， AA-PE)，而AA-PE在脂氧合酶的催化作用下可被氧化成AA-OOH-PE，可進一步發(fā)揮氧化作用。AA-PE是鐵死亡的關鍵信號，AA-OOH-PE是誘導鐵死亡的關鍵磷脂。當AA-OOH-PE水平超過還原系統(tǒng)的極限時，會誘導鐵死亡[10]。有研究表明，ACSL4作為啟動和執(zhí)行鐵死亡的重要組成部分，其敲低可發(fā)揮抗鐵死亡的保護作用，且其表達與誘導鐵死亡的敏感性顯著相關[21]。近年來的研究證實，在腦I/R損傷過程中，脂質過氧化產(chǎn)物顯著增加，伴SLC7A11的顯著激活，而敲低SLC7A11可顯著抑制脂質過氧化物的生成[15]。此外，ACSL4作為一種新的神經(jīng)元調節(jié)劑，其敲低可保護小鼠免受腦缺血的影響，而其過表達則可通過促進脂質過氧化誘導鐵死亡和神經(jīng)炎癥來加劇缺血性腦損傷[22]。此外，在小鼠MCAO模型中，liprostatin-1(lip-1)亦可通過阻斷脂質過氧化來發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16]?？梢?，下調ACSL4和SLC7A11的表達可通過靶向抑制脂質過氧化來有效抑制鐵死亡的發(fā)生，ACSL4和SLC7A11可能為腦I/R損傷相關疾病的潛在治療靶點。

3 鐵死亡調控腦I/R損傷的機制

3.1鐵死亡相關主要信號通路參與調控腦I/R損傷

3.1.1 GSH/GPX4通路 GPX4作為機體的一種重要的抗氧化酶，在氧化應激時主要通過將GSH轉化為氧化型谷胱甘肽，并將細胞毒性脂質過氧化物還原為相應的醇，來抑制鐵死亡的發(fā)生；而抑制GPX4活性可導致脂質過氧化物的累積，繼而促進鐵死亡的發(fā)生?？梢?，GPX4抑制是誘導鐵死亡的中心節(jié)點。Guan等[15]研究發(fā)現(xiàn)，沙鼠神經(jīng)元經(jīng)I/R處理后發(fā)生了鐵死亡，伴有SLC7A11和GPX4的表達均呈顯著下調；敲低SLC7A11，GPX4的表達亦顯著下調，可見，SLC7A11/GPX4通路介導的鐵死亡參與腦I/R損傷的發(fā)生發(fā)展。Yuan等[13]的研究表明，在腦I/R損傷過程中，山萘酚可部分通過激活核因子紅系2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor， Nrf2)，啟動SLC7A11/GPX4信號通路來增強抗氧化能力，抑制神經(jīng)元中脂質過氧化物的累積可顯著逆轉糖氧剝奪/復氧(OGD/R)誘導的鐵死亡。另一項研究亦證實，通過抑制SCL7A11/GPX4通路可部分減輕急性腦缺血大鼠的神經(jīng)損傷[23]。最近，Wang等[11]的小鼠MCAO模型發(fā)現(xiàn)，腦I/R損傷過程中，ACSL4表達上調、GSH水平降低，Ptgs2過表達和GPX4下調，鐵依賴性酶12、15-LOX表達上調，導致脂質過氧化、炎性因子水平升高、小膠質細胞激活和血腦屏障被破壞。此外，在腫瘤、心臟I/R損傷和心臟移植等疾病中，谷氨酰胺通路、硫轉移通路和甲羥戊酸通路等亦均可通過調控GSH/GPX4通路來介導鐵死亡[24]，但其在腦I/R損傷過程中的作用需待進一步探討。

3.1.2 ATG5-ATG7-NCOA4通路 敲除或敲低成纖維細胞和癌細胞中的自噬相關5(autophagy-related 5， Atg5)和自噬相關7(autophagy-related 7， Atg7)可降低細胞內亞鐵水平和抑制脂質過氧化，從而抑制erastin誘導的鐵死亡[25]。核受體共激活劑4(nuclear receptor coactivator 4， NCOA4)作為一種選擇性貨物受體，其基因抑制可抑制鐵蛋白的降解，進而抑制鐵死亡；而NCOA4的過表達會促進鐵蛋白的降解，進而促進鐵死亡的發(fā)生[25]?？梢?，ATG5-ATG7-NCOA4通路可通過降解鐵蛋白來調控鐵死亡。Zhang等[26]的研究表明，與永久性腦缺血相反，在腦再灌注階段敲低Atg7或全敲Atg5可通過抑制自噬來增強I/R誘導的細胞色素c的釋放和下游細胞凋亡的激活，繼而加重腦I/R損傷。近年來的研究證實，腦I/R損傷過程中，鐵死亡與自噬間確實存在串擾，ATG5-ATG7-NCOA4通路介導的鐵死亡可能在腦I/R損傷中起著重要作用。

3.1.3 HIF1α/TFR途徑 PIEZO1作為一種新型非選擇性機械敏感性離子通道，在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)如小腦、下丘腦、延髓、腦橋等中均有表達。在非炎癥條件下，PIEZO1通道在星形膠質細胞中呈低水平表達；而在脂多糖的誘導下會上調PIEZO1通道的表達，介導細胞外Ca2+內流，進一步激活Ca2+依賴的信號級聯(lián)反應，抑制促炎細胞釋放，繼而抑制神經(jīng)炎癥[27]。有研究表明，在OGD/R和I/R后神經(jīng)元中PIEZO1蛋白表達顯著上調，且通過Ca2+/鈣蛋白酶信號介導細胞凋亡[28]。PIEZO1的異常激活可引起Ca2+超載并抑制原代肝細胞中HAMP的表達，導致細胞內鐵的累積，表明PIEZO1是一種新的鐵代謝調節(jié)劑[29]。缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF1α)作為鐵死亡的重要介質，在腦缺血后神經(jīng)元和星形膠質細胞中的表達顯著上調，可通過轉鐵蛋白受體(transferrin receptor, TFR)對鐵的攝取增加來加重鐵累積，繼而誘導鐵死亡[30]。那么，PIEZO1可能通過HIF1α/TFR途徑來調控鐵死亡，且PIEZO1信號轉導對腦I/R損傷的調節(jié)作用可能取決于鐵死亡[15]，但這需待進一步研究證實。

3.1.4 其他可能途徑

3.1.4.1 p62-Keap1-Nrf2通路 Sun等[31]用鐵死亡誘導劑erastin作用于肝細胞癌發(fā)現(xiàn)，p62的表達會抑制Nrf2的降解，而Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1， Keap)的失活亦增強隨后Nrf2在胞核內的累積，隨后核Nrf2與轉錄共激活因子相互作用又可激活醌氧化還原酶-1、血紅素加氧酶-1 和FTH1的轉錄；而敲低p62、醌氧化還原酶-1、血紅素加氧酶-1和FTH1可促進鐵死亡的發(fā)生?？梢?，p62-Keap1-Nrf2通路可通過調控鐵蛋白代謝來介導鐵死亡。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，p62-Keap1-Nrf2通路參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，然而其在臟器I/R損傷中的研究主要聚焦于心臟[32]，其是否在腦I/R損傷過程中參與調控鐵死亡需待進一步探討。

3.1.4.2 p53-SAT1-ALOX15通路和p53-SLC7A11-ALOX12通路 精胺/精胺N1-乙酰轉移酶 1(spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1， SAT1)基因作為p53的轉錄靶點，是多胺分解代謝的限速酶，其表達激活可誘導脂質過氧化，并在ROS的誘導下介導鐵死亡；敲除SAT1，花生四烯酸-15-脂加氧酶(arachidonate 15-lipoxygenase, ALOX15)的表達降低，部分消除了p53介導的鐵死亡[33]。此外，在ROS應激下，p53亦可通過抑制SLC7A11的轉錄來間接激活ALOX12，繼而觸發(fā)花生四烯酸-12-脂加氧酶(arachidonate 12-lipoxygenase, ALOX12)依賴性鐵死亡[34]。p53-SAT1-ALOX15通路和p53-SLC7A11-ALOX12通路介導的鐵死亡在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用，但其在腦I/R損傷中的作用尚不清楚。

3.1.4.3 FSP1-CoQ10-NAD(P)H 通路 CoQ10作為一種親脂性內源性醌，能有效清除細胞內累積的自由基。當機體發(fā)生氧化應激時，CoQ氧化還原酶鐵死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1， FSP1)可被招募至質膜，使用NADH作為輔因子促進CoQ10的生成來抑制脂質過氧化，繼而抑制誘導鐵死亡[35]。FSP1-CoQ10-NAD(P)H 通路是最近發(fā)現(xiàn)的一個可與GPX4/GSH通路協(xié)同抑制細胞內脂質過氧化和鐵死亡的新機制[36]。當GPX4缺失或者活性降低時，F(xiàn)SP1-CoQ10-NAD(P)H通路可視為抑制鐵死亡的補充保護機制，但其在腦I/R損傷過程中的互補作用機制尚不清楚。

3.2非編碼RNA(non-coding RNA， ncRNA) ncRNA如微小RNA(microRNA， miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA， lncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA， circRNA)等在哺乳動物細胞的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達，具有組織和細胞特異性。ncRNA可在神經(jīng)退行性病變中充當基因表達的關鍵調節(jié)因子，其激活或抑制可能通過調節(jié)GSH的合成和(或)GSH的新陳代謝來改變大腦中的氧化應激狀態(tài)[37]。有研究表明[38]，小鼠腦I/R損傷過程中，miR-214可通過與TFR1的3′UTR結合來調控鐵進入細胞，加重脂質過氧化物和鐵在腦組織中累積，促進鐵死亡的發(fā)生；敲低lncRNA PVT1或過表達miR-214可顯著下調p53的表達，而過表達lncRNA PVT1或抑制miR-214的表達可顯著抵消Fer-1對鐵死亡的影響。另一項研究表明，神經(jīng)元經(jīng)OGD/R 處理后，Yin-Yang 1(YY1)的表達下調，YY1可通過與生長抑制特異性基因5(growth arrest-specific transcript 5, GAS5)啟動子結合來負調節(jié)GAS5表達，與此同時，YY1和GAS5亦可與磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6二磷酸酶3(phosphofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase 3,PFKFB3)啟動子的同一區(qū)域結合，促進PFKFB3表達和神經(jīng)元糖酵解，繼而加劇OGD/R誘導的神經(jīng)元凋亡；而上調YY1或抑制GAS5表達可逆轉I/R誘導的腦損傷并改善神經(jīng)功能[39]。lncRNA X inactivate specific transcript (XIST)通過調控miR-27a-3p/FOXO3軸來加重腦I/R 損傷；而沉默F(xiàn)OXO3可通過抑制N2a細胞凋亡和ROS的產(chǎn)生來減輕腦損傷[40]。在腦I/R損傷過程中，lncRNA ZFAS1的表達顯著下調，而ZFAS1的上調或 miR-582-3p的下調都可以抑制炎癥、氧化應激和細胞凋亡，并提高經(jīng)OGD/R處理的PC12 細胞中的NO水平[41]?？梢姡谀XI/R損傷過程中，lncRNA PVT1介導的鐵死亡在其發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，GAS5、XIST和ZFAS1等ncRNA亦可能參與調控鐵死亡。

鐵死亡作為一種由鐵依賴性的脂質過氧化物和ROS過度累積引起的新型程序性細胞死亡模式，在腦I/R損傷過程中至關重要，可嚴重影響腦I/R損傷相關疾病的預后。理論上鐵死亡可以被鐵螯合劑(如DFO和DPF)、親脂性抗氧化劑(如 Fer-1和維生素 E)和GSH生物合成促進劑(如NAC)所抑制[24]。此外，ROS抑制劑(如Fer-1、Lip-1、維生素E、維生素C和胡蘿卜素)，以及GPX4及其促進劑(如多巴胺和硒)可有效抑制鐵死亡[42]，需待進一步研究證實。本綜述重點闡述了國內外鐵死亡概述、鐵死亡與腦I/R損傷和鐵死亡調控腦I/R損傷的機制進展，以期為闡明鐵死亡在腦I/R損傷中的具體調控機制、開發(fā)新的有效的治療策略提供新的方向。